Représentation De haute résolution avec le NanoWizard BioAFM des Instruments de JPK

Sujets Couverts

Mouvement Propre

NanoWizard BioAFM

Réseau Atomique de Mica

Couche Intermédiaire Hexagonal Bourrée

Composé Nucléaire de Pore

Représentation d'ADN

Conclusions

Remerciements

Mouvement Propre

Depuis son invention, le microscope atomique de force (AFM) a été utilisé à l'image un large éventail de différents échantillons.

Quand l'AFM a été modifié tels qu'il pourrait des échantillons d'image dans le tampon il est devenu possible d'aborder des questions biologiques dans des conditions physiologiques avec cette technique. Le petit groupe dans des images atomiques de force est incomparable par d'autres techniques de microscopie qui peuvent être utilisées aux échantillons d'image en liquide, dues au taux de signal-bruit de l'instrument. De plus, des échantillons secs pour préserver la structure n'ont pas besoin d'être encore traités pour produire du contraste.

NanoWizard BioAFM

Le NanoWizard® BioAFM des Instruments de JPK a un certain nombre de caractéristiques techniques qui augmentent la capacité de cette technologie pour la représentation la plus de haute résolution des échantillons biologiques. À Savoir, le JPK Nanowizard® est linéarisé dans chacune des trois cotes. C'est-à-dire, il y a un contrôle par retour de l'information en boucle bloquée qui assure positionner précis dans le x et les axes des ordonnées ainsi qu'à l'axe de z. Supplémentaire, le Nanowizard® autre étend les possibilités d'application de la représentation atomique de microscopie (AFM) de force en activant la représentation simultanée d'AFM avec des techniques microscopiques optiques supplémentaires. Chacun des deux caractéristiques techniques peuvent économiser le moment et les moyens d'utilisateur en tâchant pour cela parfait, image de haute résolution.

Réseau Atomique de Mica

Le bureau d'études et la stabilité Supérieurs est exigé pour la saisie des images de haute résolution. Pour expliquer la stabilité du JPK Nanowizard® même lorsqu'installé sur un photomicroscope inversé, le mica frais fendu était en contact mode imagé en air. Le réseau atomique du mica peut de manière dégagée être vu (Figue 1.)

Le Schéma 1.

Couche Intermédiaire Hexagonal Bourrée

La couche intermédiaire hexagonal (HPI) bourrée de l'archaebacteria, radiodurans de Deinococcus, a été considérable étudiée utilisant la microscopie atomique de force.

Le Schéma 2. de.

La couche de HPI de radiodurans de D. forme une couche extérieure, présumée pour agir en tant qu'un genre de tamis moléculaire pour régler le transport des éléments nutritifs et des métabolites dans et hors de la cellule.

Des Données ont été produites sur la structure et le fonctionnement de la couche de HPI utilisant un grand choix de différentes techniques, des biochimies à la microscopie électronique. Cependant, la représentation d'AFM de cet échantillon peut être effectuée en liquide, à la haute résolution, pour suivre les changements dynamiques de la structure des protéines.

La couche de HPI est extraite des cellules entières avec le détergent et puis adsorbé sur une surface frais fendue de mica. L'emballage stable des différents éléments de protéine facilite la saisie des images de haute résolution. Le HPI pose des corrections de forme sur la surface de mica, et les images de synthèse de ces corrections indiquent déjà la réseau-structure régulière de la couche de HPI (Figue 2, A).

Après la saisie d'une image de synthèse d'une correction de membrane de HPI, une région adaptée peut être sélectée pour la représentation à plus de haute résolution (Figue 2, B). Car positionner de x/y du JPK Nanowizard® est réglé par un système de contrôle par retour de l'information en boucle bloquée l'instrument « changera de plan dedans » à la région sélectée avec de grande précision. Ceci permet à l'utilisateur de prendre moins échographies, réduisant la probabilité de contaminer l'extrémité ou d'endommager la correction de membrane.

Composé Nucléaire de Pore

La cellule eucaryote est dispensée en organelles appelées de compartiments. Le transport Réglé en travers des membranes entourant chaque organelle permet à la cellule de compartimenter les molécules particulières, un procédé qui est à la base de la fonction cellulaire. Dans la membrane nucléaire, le composé nucléaire de pore (NPC) est responsable du transport des molécules variées dans et hors du noyau.

Le Schéma 3.

À La Différence de la couche de HPI de radiodurans de D., les préparations de NPC ne contiennent pas simplement NPC condensé dans un réseau. Les échantillons sont préparés à partir des noyaux entiers, dans ce cas des laevis de Xenopus, et peuvent être tout à fait hétérogènes.

Pendant Que la version des sciences de la vie du JPK Nanowizard® est entièrement intégrée dans inversé, le photomicroscope, microscopie de boîte de vitesses peut être utilisé pour balayer l'échantillon pour une région qui ne contient pas un grand nombre de saletés, avant le balayage. D'une telle voie l'utilisateur peut, de nouveau, réduire le temps nécessaire pour trouver une région adaptée pour balayer, et pour diminuer la possibilité de contaminer l'extrémité.

Le Schéma 4.

Les échantillons de NPC, sur une lamelle en verre, étaient imagés utilisant la microscopie différentielle de contraste (DIC) d'interférence, mettant en valeur de manière dégagée les saletés qui seraient impossibles à concevoir utilisant la microscopie lumineuse de zone (Figue 3). L'extrémité a été alors positionnée au-dessus d'une zone avec des saletés minimales et une échographie de synthèse saisie (Figue 4). De Nouveau, le contrôle par retour de l'information capacitively réglé permet alors la sélection précise d'une zone pour une échographie plus de haute résolution.

Représentation d'ADN

La Majeure Partie des données produites sur la structure et le fonctionnement de l'ADN est venue de la zone de la biologie moléculaire.

Cependant, avec le taux de signal-bruit de l'AFM cette molécule biologique principalement importante peut être étudiée à la haute résolution dans le liquide et en air, pour élucider la structure matérielle et l'interaction de l'ADN avec les molécules ADN-grippantes. Dans des conditions appropriées, l'ADN peut être adsorbé au mica frais fendu et imagé dans le tampon. Le Schéma 5 expositions Lambda ADN (mode bactériophage à C.A. en liquide).

Le Schéma 5.

L'interaction des protéines variées avec l'ADN est principale dans les procédés de la réplication et de la transcription. Un exemple est l'association de l'ADN avec des histones pour former des nucleosomes. Ce se condenser de l'ADN autour du noyau nucleosome (consisiting d'un octamer d'histone) joue un rôle dans le règlement de la Réplication de l'ADN, et la transcription, car l'ADN condensé n'est pas accessible à d'autres protéines ADN-grippantes.

Le Schéma 6.

Dans ce cas, linéarisée, pGEM de plasmide de 3 kb a été incubée avec des nucleosomes en un rapport de 1 mole d'ADN à 20 moles d'octamers d'histone. Le plasmide de pGEM a 20 accepteurs nucleosome putatifs, cependant, il peut voir que dans les conditions d'incubation, les nucleosomes n'ont pas grippé à chacun des 20 accepteurs (Figue 6).

Conclusions

Le taux de signal-bruit, manque de condition pour souiller ou traiter préalablement et de capacité au fonctionnement dans le liquide effectue à représentation d'AFM une méthode extrêmement puissante pour décrire, à la haute résolution, la structure des échantillons biologiques. Le design du JPK Nanowizard® peut faciliter de telles études de haute résolution. Par exemple, positionner précis dans x et y (dus au contrôle par retour de l'information en boucle bloquée) réduit le nombre d'échographies qui sont exigées « pour se concentrer » à la haute résolution sur une région d'intérêt. Ceci diminue la probabilité d'endommager les échantillons fragiles et de contaminer l'extrémité.

Pour des échantillons préparés sur la glace, telle que le composé nucléaire de pore décrit ci-dessus, contaminer des saletés peut être facilement évité en recherchant une zone adaptée utilisant la photomicroscopie de boîte de vitesses, enrégistrant de nouveau le temps d'utilisateur.

L'avantage d'utiliser l'AFM pour de telles études de représentation se situe dans la capacité de l'AFM aux échantillons d'image dans le liquide, dans des conditions physiologiques. Les Instruments de JPK fabrique le Biocell™ qui peut permettre à l'utilisateur de modifier des conditions pendant la lecture (Figue 7), tel que les changements de température réglés ou l'ajout in situ des molécules appropriées, autre augmentant les possibilités d'application du JPK Nanowizard® pour la représentation la plus de haute résolution des échantillons biologiques.

Le Schéma 7.

Le JPK Nanowizard®, intégré dans un photomicroscope inversé, est également optimisé pour la représentation d'autres échantillons biologiques, des bilayers de lipide et des biopolymères tels que le collagène aux cellules entières. La représentation d'AFM de tels échantillons peut être complétée avec des techniques supplémentaires de photomicroscopie, telles que le balayage de laser confocal, l'epifluorescence TIRF ou la FRETTE. Le JPK Nanowizard® a été également employé pour mesurer les forces défaisantes, de différentes protéines aux interactions de cellcell. En soi, le JPK Nanowizard® BioAFM est parfait pour des mesures de conduite de représentation et de force des échantillons biologiques de différentes protéines aux cellules entières, dans des conditions réglées et physiologiques.

Remerciements

Merci beaucoup à tous ceux qui ont contribué des échantillons et des images. L'image de haute résolution de HPI a été fournie par M. Patrick Frederix du groupe de Prof. Engel, de. L'échantillon de NPC était un don aimable de Barbara Windoffer du groupe du Prof. M. Oberleithner, Universitätsklinikum Münster. L'échantillon d'ADN-histone a été préparé par M. Dennis Merkel (groupe de Prof. Schwille's) et imagé par M. Clemens Franz (groupe de Prof. Müller's) les deux de l'Université De Technologie de Dresde.

Source : Instruments de JPK

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît les Instruments de JPK

Date Added: Feb 20, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:47

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