Rappresentazione Di alta risoluzione con il NanoWizard BioAFM dagli Strumenti di JPK

Argomenti Coperti

Sfondo

NanoWizard BioAFM

Grata Atomica di Mica

Livello Intermedio Esagonale Imballato

Complesso Nucleare del Poro

Rappresentazione del DNA

Conclusioni

Ringraziamenti

Sfondo

Dalla sua invenzione, il microscopio atomico della forza (AFM) è stato utilizzato all'immagine una vasta gamma di campioni differenti.

Quando il AFM è stato modificato tali che potrebbe campioni di immagine in buffer è diventato possibile rivolgere le domande biologiche nei termini fisiologici con questa tecnica. Il dettaglio nelle immagini atomiche della forza è incomparabile mediante altre tecniche di microscopia che possono essere utilizzate ai campioni di immagine in liquido, dovuto il rapporto di segnale/disturbo dello strumento. Inoltre, i campioni secchi per conservare la struttura non devono più ulteriormente essere trattati per generare il contrasto.

NanoWizard BioAFM

Il NanoWizard® BioAFM dagli Strumenti di JPK ha una serie di funzionalità che migliorano la capacità di questa tecnologia per la rappresentazione più di alta risoluzione dei campioni biologici. Vale A Dire, il JPK Nanowizard® è linearizzato in tutte e tre le dimensioni. Cioè c'è un feedback a circuito chiuso che assicura il posizionamento preciso nella x e nelle assi y come pure nell'asse di z. Ulteriormente, il Nanowizard® ulteriore estende l'applicabilità della rappresentazione atomica di microscopia (AFM) della forza permettendo alla rappresentazione simultanea del AFM con le tecniche microscopiche ottiche supplementari. Entrambe funzionalità possono salvare il momento e le risorse dell'utente quando si sforza per quello perfetto, immagine di alta risoluzione.

Grata Atomica di Mica

L'assistenza tecnica e la stabilità Superiori è richiesta per l'acquisizione delle immagini di alta risoluzione. Per dimostrare la stabilità del JPK Nanowizard® anche quando installato su un microscopio ottico invertito, la mica di recente fenduta era imaged nel modo di contatto in aria. La grata atomica di mica può essere veduta chiaramente (Fico 1.)

Figura 1.

Livello Intermedio Esagonale Imballato

Il livello intermedio esagonale (HPI) imballato del archaebacteria, radiodurans di Deinococcus, è stato studiato estesamente facendo uso di microscopia atomica della forza.

Figura 2. di.

Il livello di HPI di radiodurans del D. forma uno strato superficiale, presunto per fungere da un genere di setaccio molecolare per regolamentare il trasporto delle sostanze nutrienti e dei metaboliti dentro e fuori della cella.

I Dati sono stati generati sulla struttura e sulla funzione del livello di HPI facendo uso di varie tecniche differenti, dalla biochimica a microscopia elettronica. Tuttavia, la rappresentazione del AFM di questo campione può essere effettuata in liquido, all'alta risoluzione, per seguire i cambiamenti dinamici in struttura della proteina.

Il livello di HPI è estratto dalle intere celle con il detersivo e poi è adsorbito ad una superficie di recente fenduta della mica. L'imballaggio stabile di diversi elementi della proteina facilita l'acquisizione delle immagini di alta risoluzione. Il HPI mette a strati le toppe del modulo sulla superficie della mica e le immagini di generalità di queste toppe già rivelano la grata-struttura regolare del livello di HPI (Fico 2, A).

Dopo l'acquisizione di un'immagine di generalità di una toppa della membrana di HPI, una regione adatta può essere selezionata per la rappresentazione a più di alta risoluzione (Fico 2, B). Poichè il posizionamento di x-y del JPK Nanowizard® è gestito da un sistema di feedback a circuito chiuso lo strumento “zummerà„ alla regione selezionata con alta precisione. Ciò permette all'utente di catturare meno scansioni, diminuenti la probabilità di contaminazione del suggerimento o di danno della toppa della membrana.

Complesso Nucleare del Poro

La cella eucariotica è organizzata nei compartimenti chiamati organelli. Il trasporto Controllato attraverso le membrane che circondano ogni organello permette che la cella suddivida in compartimenti le molecole specifiche, un trattamento che è alla base della funzione cellulare. Nella membrana nucleare, il complesso nucleare del poro (NPC) è responsabile del trasporto di varie molecole in e dal nucleo.

Figura 3.

A Differenza del livello di HPI di radiodurans del D., i preparati di NPC non contengono semplicemente NPC condensato in una grata. I campioni sono preparati dagli interi nuclei, in questo caso dai laevis del Xenopus e possono essere abbastanza eterogenei.

Come la versione di scienze biologiche del JPK Nanowizard® completamente è integrato in un'invertita in, il microscopio ottico, microscopia della trasmissione può essere usato per scandire il campione per una regione che non contiene un gran numero di detriti, prima della scansione. In tale maniera l'utente può, ancora una volta, diminuire il tempo richiesto per trovare una regione adatta per la scansione e per fare diminuire la probabilità di contaminazione del suggerimento.

Figura 4.

I campioni di NPC, su una lamella di vetro, erano imaged facendo uso di microscopia differenziale di contrasto (DIC) di interferenza, evidenziante chiaramente i detriti che sarebbero stati impossibli da visualizzare facendo uso di microscopia luminosa del campo (Fico 3). Il suggerimento poi è stato posizionato sopra un'area con detriti minimi e una scansione di generalità acquistata (Fico 4). Di Nuovo, il feedback capacitively controllato poi permette la selezione precisa di un'area per una scansione più di alta risoluzione.

Rappresentazione del DNA

La Maggior Parte dei dati generati sulla struttura e sulla funzione di DNA è venuto dal campo di biologia molecolare.

Tuttavia, con il rapporto di segnale/disturbo del AFM questa molecola biologica fondamentalmente importante può essere studiata all'alta risoluzione in liquido ed in aria, per delucidare la struttura fisica e l'interazione di DNA con le molecole dell'DNA-associazione. Nelle circostanze appropriate, il DNA può essere adsorbito a mica di recente fenduta ed imaged in buffer. Figura 5 DNA di manifestazioni Lambda (modo dei fagi di CA in liquido).

Figura 5.

L'interazione di varie proteine con DNA è fondamentale nei trattamenti della replica e della trascrizione. Un esempio è l'associazione di DNA con gli istoni per formare i nucleosomes. Questa condensazione del DNA intorno alla memoria nucleosome (consisiting di un octamer dell'istone) gioca un ruolo nel regolamento del Replicazione del dna e la trascrizione, poichè il DNA condensato non è accessibile ad altre proteine dell'DNA-associazione.

Figura 6.

In questo caso, linearizzata, pGEM del plasmide di KB 3 è stata incubata con i nucleosomes in un rapporto di 1 mole di DNA a 20 mole dei octamers dell'istone. Il plasmide del pGEM ha 20 sedi del legame nucleosome presunte, tuttavia, può essere veduto che nelle circostanze di incubazione, i nucleosomes non hanno legato a tutte e 20 le sedi del legame (Fico 6).

Conclusioni

Il rapporto di segnale/disturbo, mancanza di requisito della macchiatura o del pretrattamento e di capacità alla funzione in liquido rende alla rappresentazione del AFM un metodo estremamente efficace per la descrizione, all'alta risoluzione, della struttura dei campioni biologici. La progettazione del JPK Nanowizard® può facilitare tali studi di alta risoluzione. Per esempio, il posizionamento accurato nella x ed in y (dovuto feedback a circuito chiuso) diminuisce il numero delle scansioni che sono richieste “per mettere a fuoco„ all'alta risoluzione su una regione di interesse. Ciò fa diminuire la probabilità di danno dei campioni delicati e di contaminazione del suggerimento.

Per i campioni pronti su vetro, quale il complesso nucleare del poro descritto precedentemente, contaminare i detriti può essere evitata facilmente cercando un'area adatta facendo uso di microscopia leggera della trasmissione, salvante ancora il tempo dell'utente.

Il vantaggio di usando il AFM per tali studi della rappresentazione si trova nella capacità del AFM ai campioni di immagine in liquido, nelle circostanze fisiologiche. Gli Strumenti di JPK fabbrica il Biocell™ che può permettere che l'utente modifichi le circostanze durante lo scansione (Fico 7), quali i mutamenti di temperatura controllati o l'aggiunta in situ delle molecole pertinenti, ulteriore migliorando l'applicabilità del JPK Nanowizard® per la rappresentazione più di alta risoluzione dei campioni biologici.

Figura 7.

Il JPK Nanowizard®, integrato in un microscopio ottico invertito, egualmente è ottimizzato per la rappresentazione di altri campioni biologici, dai doppii strati lipidici e dai biopolimeri quale il collageno alle intere celle. La rappresentazione del AFM di tali campioni può essere completata con le tecniche supplementari di microscopia leggera, quali la scansione del laser confocale, il epifluorescence TIRF o il CERCHIO. Il JPK Nanowizard® egualmente è stato usato per quantificare le forze scioglienti, dalle diverse proteine alle interazioni del cellcell. Come tale, il JPK Nanowizard® BioAFM è perfetto per le misure di conduzione della forza e della rappresentazione dei campioni biologici dalle diverse proteine alle intere celle, nelle circostanze controllate e fisiologiche.

Ringraziamenti

Molte grazie a tutti i coloro che ha contribuito i campioni e le immagini. L'immagine di alta risoluzione di HPI è stata fornita dal Dott. Patrick Frederix dal gruppo di Prof. Engel, di. Il campione di NPC era un regalo gentile da Barbara Windoffer del gruppo di Prof. il Dott. Oberleithner, Universitätsklinikum Münster. Il campione dell'DNA-istone è stato preparato dal Dott. Dennis Merkel (gruppo di Prof. Schwille) ed imaged dal Dott. Clemens Franz (gruppo) di Prof. Müller entrambi dell'Università Tecnologica di Dresda.

Sorgente: Strumenti di JPK

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego gli Strumenti di JPK

Date Added: Feb 20, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:56

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