De Weergave van de Hoge Resolutie met NanoWizard BioAFM van Instrumenten JPK

Besproken Onderwerpen

Achtergrond

NanoWizard BioAFM

Atoom Rooster van Mica

Hexagonally Pakte MiddenLaag in

Kern Complexe Porie

De Weergave van DNA

Conclusies

Erkenning

Achtergrond

Sinds zijn uitvinding, is de atoomkrachtmicroscoop (AFM) gebruikt aan beeld een brede waaier van verschillende steekproeven.

Toen AFM werd gewijzigd dusdanig dat het beeldsteekproeven in buffer kon werd het mogelijk om biologische vragen in de fysiologische omstandigheden met deze techniek te richten. Het detail in atoomkrachtbeelden is ongeëvenaard door andere de microscopietechnieken die aan beeldsteekproeven in vloeibaar kunnen worden gebruikt, wegens het signaal aan lawaaiverhouding van het instrument. Bovendien droge te hoeven de steekproeven om structuur te bewaren niet verder worden behandeld om contrast te produceren.

NanoWizard BioAFM

NanoWizard® BioAFM van Instrumenten JPK heeft een aantal eigenschappen die de capaciteit van deze technologie voor de hoogste resolutieweergave van biologische steekproeven verbeteren. Namelijk, is JPK Nanowizard® gelineariseerd in alle drie afmetingen. Namelijk zijn er closed-loop terugkoppelt die het nauwkeurige plaatsen in de x en yassen evenals in de zas verzekert. Bovendien, breidt Nanowizard® verder de toepasselijkheid van de atoomweergave van de kracht (AFM)microscopie door gelijktijdige weergave AFM met extra optische microscopische technieken uit toe te laten. Beide eigenschappen kunnen de de gebruikerstijd en middelen besparen wanneer het streven voor dat perfecte, hoge resolutiebeeld.

Atoom Rooster van Mica

De Superieure techniek en de stabiliteit worden vereist voor de aanwinst van hoge resolutiebeelden. Om de stabiliteit van JPK Nanowizard® aan te tonen zelfs wanneer geïnstalleerd op een omgekeerde lichte microscoop, was het vers gespleten mica imaged op contactwijze in lucht. Het atoomrooster van mica kan duidelijk worden gezien (Fig. 1.)

Figuur 1.

Hexagonally Pakte MiddenLaag in

De hexagonally ingepakte midden (HPI)laag van archaebacteria, Deinococcus radiodurans, is uitgebreid bestudeerd gebruikend de atoomkrachtmicroscopie.

Figuur 2. van.

De laag HPI van D. radiodurans vormt een oppervlaktelaag, wordt verondersteld om als een soort moleculaire zeef handelen om vervoer van voedingsmiddelen en metabolites in en uit de cel te regelen die.

Het Gegeven is geproduceerd over de structuur en de functie van de laag HPI gebruikend een verscheidenheid van verschillende technieken, van biochemie aan elektronenmicroscopie. Nochtans, kan de weergave AFM van deze steekproef in vloeistof, bij hoge resolutie worden uitgevoerd, om dynamische veranderingen in eiwitstructuur te volgen.

De laag HPI wordt gehaald uit gehele cellen met detergens en aan een vers gespleten micaoppervlakte dan geadsorbeerd. De stabiele verpakking van de individuele eiwitelementen vergemakkelijkt de aanwinst van hoge resolutiebeelden. De lagen HPI vormen flarden op de micaoppervlakte, en de overzichtsbeelden van deze flarden openbaren reeds de regelmatige rooster-structuur van de laag HPI (Fig. 2, A).

Na de aanwinst van een overzichtsbeeld van een HPI membraanflard, kan een geschikt gebied voor weergave bij hogere resolutie (Fig. 2, B) worden geselecteerd. Aangezien het x-y plaatsen van JPK Nanowizard® door closed-loop wordt gecontroleerd koppel systeem terug het instrument „in“ aan het geselecteerde gebied met hoge nauwkeurigheid zal zoemen. Dit laat de gebruiker toe om minder aftasten te nemen, dat de waarschijnlijkheid van het vervuilen van het uiteinde of het beschadigen van het membraanflard verminderen.

Kern Complexe Porie

De eukaryotic cel wordt georganiseerd in compartimenten genoemd organellen. Het Gecontroleerde vervoer over de membranen die elk organel omringen staat de cel toe om specifieke molecules, een proces te compartimenteren dat aan cellulaire functie ten grondslag ligt. In het kernmembraan, is de kern complexe (NPC) porie de oorzaak van vervoer van diverse molecules in en uit de kern.

Figuur 3.

In Tegenstelling Tot de laag HPI van D. radiodurans die, bevatten de voorbereidingen van NPC eenvoudig geen NPC in een rooster wordt gecondenseerd. De steekproeven worden voorbereid van gehele kernen, in dit geval van laevis Xenopus, en kunnen vrij heterogeen zijn.

Aangezien de versie van de het levenswetenschap van JPK Nanowizard® in een omgekeerde, lichte microscoop volledig geïntegreerd is, kan de transmissiemicroscopie worden gebruikt om de steekproef voor een gebied af te tasten dat geen hopen van puin, vóór aftasten bevat. Op zulke wijze die kan de gebruiker, nogmaals, de tijd verminderen wordt vereist om een geschikt gebied voor aftasten te vinden, en de kans te verminderen om het uiteinde te vervuilen.

Figuur 4.

De steekproeven NPC, op glascoverslip, waren imaged gebruikend de differentiële microscopie van het interferentie (DIC)contrast, duidelijk benadrukkend puin dat onmogelijk zou zijn om het gebruiken van de heldere gebiedsmicroscopie (Fig. 3) te visualiseren. Het uiteinde werd toen geplaatst over een gebied met minimaal puin en een verworven overzichtsaftasten (Fig. 4). Opnieuw, koppelt capacitively gecontroleerd toestaat dan nauwkeurige selectie van een gebied voor een hogere resolutieaftasten terug.

De Weergave van DNA

De Meeste geproduceerde gegevens over de structuur en de functie van DNA is gekomen uit het gebied van moleculaire biologie.

Nochtans, met het signaal aan lawaaiverhouding van AFM kan deze fundamenteel belangrijke biologische molecule bij hoge resolutie in vloeistof en in lucht worden bestudeerd, om fysieke structuur en de interactie van DNA nader toe te lichten met DNA-Bindende molecules. In de aangewezen omstandigheden, kan DNA aan vers gespleten mica worden geadsorbeerd en imaged in buffer. Figuur 5 toont Lambda phage DNA (ac wijze in vloeistof).

Figuur 5.

De interactie van diverse proteïnen met DNA is fundamenteel in de processen van replicatie en transcriptie. Één voorbeeld is de vereniging van DNA met te vormen histones zich nucleosomes. Dit het condenseren van DNA rond de nucleosome kern (het consisiting van histone octamer) speelt een rol in de verordening van de replicatie van DNA, en transcriptie, aangezien gecondenseerde DNA niet toegankelijk voor andere DNA-Bindende proteïnen is.

Figuur 6.

In dit geval, werd gelineariseerd, 3 kb plasmide pGEM uitgebroed met nucleosomes in een verhouding van 1 mol DNA aan 20 mollen van histone octamers. De pGEMplasmide heeft 20 vemeende nucleosome bandplaatsen, echter, het kan worden gezien dat onder incubatie de voorwaarden, nucleosomes niet bij alle 20 bandplaatsen bonden (Fig. 6).

Conclusies

Het signaal aan lawaaiverhouding, gebrek aan vereiste om te bevlekken of vooraf te behandelen en vermogen om in vloeistof te functioneren maakt tot weergave AFM een uiterst krachtige methode om bij hoge resolutie, de structuur van biologische steekproeven te beschrijven. Het ontwerp van JPK Nanowizard® kan dergelijke hoge resolutiestudies vergemakkelijken. Bijvoorbeeld, het nauwkeurige verminderen plaatsen in x en y (wegens closed-loop koppel) terug het aantal aftasten dat zich bij hoge resolutie „wordt vereist concentreren“ over een gebied van belang. Dit vermindert de waarschijnlijkheid van het beschadigen van gevoelige steekproeven en van het vervuilen van het uiteinde.

Voor steekproeven op glas, zoals kern hierboven beschreven worden voorbereid porie complex, kan het vervuilen van puin gemakkelijk worden vermeden door naar een geschikt gebied te zoeken gebruikend de transmissie lichte microscopie, opnieuw besparend de gebruikerstijd die.

Het voordeel om AFM voor dergelijke weergavestudies te gebruiken ligt in het vermogen van AFM aan beeldsteekproeven in vloeistof, in de fysiologische omstandigheden. De Instrumenten JPK vervaardigt Biocell™ die de gebruiker kan toestaan om voorwaarden tijdens aftasten (Fig. 7), zoals gecontroleerde temperatuurveranderingen of de toevoeging in situ van relevante molecules te wijzigen, verder verbeterend de toepasselijkheid van JPK Nanowizard® voor de hoogste resolutieweergave van biologische steekproeven.

Figuur 7.

JPK Nanowizard®, in een omgekeerde lichte microscoop wordt geïntegreerd, wordt ook geoptimaliseerd voor weergave van andere biologische steekproeven, van lipidebilayers en biopolymeren zoals collageen aan gehele cellen die. De weergave AFM van dergelijke steekproeven kan met extra de lichte microscopietechnieken, zoals laser confocal aftasten, epifluorescence TIRF of LIJSTWERK worden aangevuld. JPK Nanowizard® is ook gebruikt om losmakende krachten, van individuele proteïnen aan cellcellinteractie te kwantificeren. Als dusdanig, is JPK Nanowizard® BioAFM perfect voor het leiden van weergave en krachtmetingen van biologische steekproeven van individuele proteïnen aan gehele cellen, in de gecontroleerde, fysiologische omstandigheden.

Erkenning

Vele dank aan die allemaal wie steekproeven en beelden bijdroegen. Het hoge resolutiebeeld van HPI werd verstrekt door Dr. Patrick Frederix van de groep Prof. Engel, van. De steekproef NPC was een vriendelijke gift van Barbara Windoffer van de groep Prof. Dr. Oberleithner, Universitätsklinikum Münster. Werd de dna-Histone steekproef voorbereid door Dr. Dennis Merkel (de groep van Prof. Schwille's) en imaged door Dr. Clemens Franz (de groep van Prof. Müller's) allebei van de Universiteit van Dresden van Technologie.

Bron: Instrumenten JPK

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Instrumenten JPK

Date Added: Feb 20, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:43

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit