Imagem Lactente De alta resolução com o NanoWizard BioAFM dos Instrumentos de JPK

Assuntos Cobertos

Fundo

NanoWizard BioAFM

Estrutura Atômica da Mica

Camada Intermediária Sextavada Embalada

Complexo Nuclear do Poro

Imagem Lactente do ADN

Conclusões

Reconhecimentos

Fundo

Desde sua invenção, o microscópio atômico da força (AFM) foi usado à imagem uma vasta gama de amostras diferentes.

Quando o AFM foi alterado tais que poderia amostras da imagem no amortecedor tornou-se possível endereçar perguntas biológicas sob condições fisiológicos com esta técnica. O detalhe em imagens atômicas da força é imbatível por outras técnicas da microscopia que podem ser usadas às amostras da imagem no líquido, devido ao sinal à relação de ruído do instrumento. Além, as amostras secadas para preservar a estrutura não precisam de ser tratadas mais para gerar o contraste.

NanoWizard BioAFM

O NanoWizard® BioAFM dos Instrumentos de JPK tem um número de características que aumentam a capacidade desta tecnologia para a imagem lactente a mais de alta resolução de amostras biológicas. A Saber, o JPK Nanowizard® é tornado linear em todas as três dimensões. Isto é, há um feedback do circuito fechado que assegure o posicionamento preciso nos machados de x e de y assim como na linha central de z. Adicionalmente, o Nanowizard® mais adicional estende a aplicabilidade da imagem lactente atômica da microscopia (AFM) da força permitindo a imagem lactente simultânea do AFM com técnicas microscópicas ópticas adicionais. Both of these características podem salvar o momento e os recursos do usuário ao esforçar-se para aquele perfeito, imagem de alta resolução.

Estrutura Atômica da Mica

A engenharia e a estabilidade Superiores são exigidas para a aquisição de imagens de alta resolução. Para demonstrar a estabilidade do JPK Nanowizard® mesmo quando instalado em um fotomicroscópio invertido, a mica recentemente fendida era imaged no modo de contacto no ar. A estrutura atômica da mica pode claramente ser vista (Figo 1.)

Figura 1.

Camada Intermediária Sextavada Embalada

A camada intermediária sextavada (HPI) embalada do archaebacteria, radiodurans de Deinococcus, foi estudada extensivamente usando a microscopia atômica da força.

Figura 2. de.

A camada de HPI de radiodurans do D. forma uma camada de superfície, presumida actuar como um tipo da peneira molecular para regular o transporte dos nutrientes e dos metabolitos dentro e fora da pilha.

Os Dados foram gerados na estrutura e na função da camada de HPI usando uma variedade de técnicas diferentes, da bioquímica à microscopia de elétron. Contudo, a imagem lactente do AFM desta amostra pode ser realizada no líquido, na alta resolução, para seguir mudanças dinâmicas na estrutura da proteína.

A camada de HPI é extraída das pilhas inteiras com detergente e fixada então a uma superfície recentemente fendida de mica. A embalagem estável dos elementos individuais da proteína facilita a aquisição de imagens de alta resolução. As correcções de programa do formulário das camadas de HPI na superfície de mica, e as imagens da vista geral destas correcções de programa já revelam a estrutura-estrutura regular da camada de HPI (Figo 2, A).

Após a aquisição de uma imagem da vista geral de uma correcção de programa da membrana de HPI, uma região apropriada pode ser seleccionada para a imagem lactente em mais de alta resolução (Figo 2, B). Porque o posicionamento x-y do JPK Nanowizard® é controlado por um sistema de feedback de circuito fechado o instrumento “zumbirá dentro” à região selecionada com precisão alta. Isto permite o usuário de tomar menos varreduras, reduzindo a probabilidade de contaminar a ponta ou de danificar a correcção de programa da membrana.

Complexo Nuclear do Poro

A pilha eucariótica é organizada nos compartimentos chamados os organelles. O transporte Controlado através das membranas que cercam cada organelle permite que a pilha divida em compartimentos moléculas específicas, um processo que seja a base da função celular. Na membrana nuclear, o complexo nuclear do poro (NPC) é responsável para o transporte de várias moléculas e fora do núcleo.

Figura 3.

Ao Contrário da camada de HPI de radiodurans do D., as preparações de NPC não contêm simplesmente NPC condensado em uma estrutura. As amostras são preparadas dos núcleos inteiros, neste caso dos laevis do Xenopus, e podem ser bastante heterogêneas.

Enquanto a versão da ciência da vida do JPK Nanowizard® é integrada inteiramente em uma invertida, o fotomicroscópio, microscopia da transmissão pode ser usado para fazer a varredura da amostra para uma região que não contenha grandes quantidades de restos, antes de fazer a varredura. Em tal maneira o usuário pode, mais uma vez, reduzir o tempo exigido para encontrar uma região apropriada para fazer a varredura, e para diminuir a possibilidade de contaminar a ponta.

Figura 4.

As amostras de NPC, em uma lamela de vidro, eram imaged usando a microscopia diferencial do contraste (DIC) da interferência, destacando claramente os restos que seriam impossíveis de visualizar usando a microscopia brilhante do campo (Figo 3). A ponta foi posicionada então sobre uma área com restos mínimos e uma varredura da vista geral adquirida (Figo 4). Além Disso, o feedback capacitively controlado permite então a selecção precisa de uma área para uma varredura mais de alta resolução.

Imagem Lactente do ADN

A Maioria dos dados gerados na estrutura e na função do ADN veio do campo da biologia molecular.

Contudo, com o sinal à relação de ruído do AFM esta molécula biológica fundamental importante pode ser estudada na alta resolução no líquido e no ar, para explicar a estrutura física e a interacção do ADN com moléculas ADN-obrigatórias. Sob circunstâncias apropriadas, o ADN pode ser fixado à mica recentemente fendida e imaged no amortecedor. Figura 5 ADN do fago do Lambda das mostras (modo da C.A. no líquido).

Figura 5.

A interacção de várias proteínas com ADN é fundamental nos processos de réplica e de transcrição. Um exemplo é a associação do ADN com os histones para formar nucleosomes. Esta condensação do ADN em torno do núcleo nucleosome (consisiting de um octamer do histone) joga um papel no regulamento da réplica do ADN, e a transcrição, porque o ADN condensado não é acessível a outras proteínas ADN-obrigatórias.

Figura 6.

Neste caso, tornado linear, pGEM do plasmídeo de 3 kb foi incubado com nucleosomes numa razão de 1 toupeira do ADN a 20 toupeiras de octamers do histone. O plasmídeo do pGEM tem 20 locais obrigatórios nucleosome putativos, contudo, pode-se ver que sob as circunstâncias da incubação, os nucleosomes não ligaram em todos os 20 locais obrigatórios (Figo 6).

Conclusões

O sinal à relação de ruído, falta da exigência para manchar ou pretreating e da capacidade à função no líquido faz a imagem lactente do AFM um método extremamente poderoso para descrever, na alta resolução, a estrutura de amostras biológicas. O projecto do JPK Nanowizard® pode facilitar tais estudos de alta resolução. Por exemplo, o posicionamento exacto em x e em y (devido ao feedback do circuito fechado) reduz o número de varreduras que são exigidas “para se centrar” na alta resolução sobre uma região de interesse. Isto diminui a probabilidade de danificar amostras delicadas e de contaminar a ponta.

Para as amostras preparadas no vidro, tal como o complexo nuclear do poro descrito acima, contaminar restos pode facilmente ser evitada procurarando por uma área apropriada usando a fotomicroscopia da transmissão, ganhando outra vez o tempo do usuário.

O benefício de usar o AFM para tais estudos da imagem lactente encontra-se na capacidade do AFM às amostras da imagem no líquido, sob circunstâncias fisiológicos. Os Instrumentos de JPK fabricam o Biocell™ que pode permitir que o usuário altere circunstâncias durante a exploração (Figo 7), como mudanças de temperatura controladas ou a adição in situ de moléculas relevantes, mais adicional aumentando a aplicabilidade do JPK Nanowizard® para a imagem lactente a mais de alta resolução de amostras biológicas.

Figura 7.

O JPK Nanowizard®, integrado em um fotomicroscópio invertido, é aperfeiçoado igualmente para a imagem lactente de outras amostras biológicas, dos bilayers do lipido e dos biopolymers tais como o colagénio às pilhas inteiras. A imagem lactente do AFM de tais amostras pode ser suplementada com as técnicas adicionais da fotomicroscopia, tais como a varredura do laser confocal, o epifluorescence TIRF ou a FRICÇÃO. O JPK Nanowizard® foi usado igualmente para determinar desatar forças, das proteínas individuais às interacções do cellcell. Como tal, o JPK Nanowizard® BioAFM é perfeito para medidas de condução da imagem lactente e da força de amostras biológicas das proteínas individuais às pilhas inteiras, sob circunstâncias controladas, fisiológicos.

Reconhecimentos

Muitos agradecimentos a todos os aqueles que contribuíram amostras e imagens. A imagem de alta resolução de HPI foi fornecida pelo Dr. Patrick Frederix do grupo de Prof. Engel, de. A amostra de NPC era um presente amável de Barbara Windoffer do grupo de Prof. Dr. Oberleithner, Universitätsklinikum Münster. A amostra do ADN-histone foi preparada pelo Dr. Dennis Merkel (grupo do Prof. Schwille) e imaged pelo Dr. Clemens Franz (grupo) do Prof. Müller ambos da Universidade Tecnológica de Dresden.

Source: Instrumentos de JPK

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos de JPK

Date Added: Feb 20, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:20

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