Mehrdimensionale Mikroskopie auf Lebenden Zellen Unter Verwendung des AtomKraft-Mikroskops Nanowizard von JPK-Instrumenten

Themen Umfaßt

Hintergrund

Kraft Spektroskopie-Analyse

Mikroskopie Techniken

Mehrdimensionale Mikroskopie

Experimentelle Installation

Lebende ZellBilder

Schlussfolgerung

Hintergrund

Eine laufende Tendenz in der wissenschaftlichen Forschung ist die Entwicklung von Techniken, die mehrfache Bauteile einer Anlage zu einer einzelnen Zeit adressieren können. DNA-Chip-Analyse liefert einen Schnappschuss des Sets der Gene, die zu gegebener Zeit innerhalb einer Zelle ausgedrückt werden. Mehrdimensionale Proteinkennzeichentechnologie wird entwickelt, um den Inhalt von heterogenen Proben von Proteinen zu bestimmen.

Kraft Spektroskopie-Analyse

Kraftspektroskopieanalyse kann die Komplexität des Zellbeitrittes ansprechen, indem sie zwischen dem Beitrag von einzelnen Elementen an den verbindlichen Prozess unterscheidet. Förderungen in den Mikroskopietechniken und -Probenaufbereitungen dehnen dieses Baumuster des Mehrkomponenten- Anfluges auf die Darstellung von Zellen aus.

Mikroskopie Techniken

Die Informationen, die über Zellaufbau und Funktion unter Verwendung der verschiedenen Mikroskopietechniken erzeugt werden, unterscheiden sich abhängig von, wie Kontrast erzeugt wird. Indem man Techniken kombiniert, können Informationen über verschiedene Eigenschaften der einer Probe gleichzeitig geüberwacht werden. Das Atomkraftmikroskop JPK Nanowizard® wird konstruiert, auf ein umgekehrtes Lichtmikroskop eingebaut zu werden und aktiviert simultane Darstellung einer Probe durch Atomkraftmikroskopie (AFM) und verschiedene optische Mikroskopietechniken von der Phase kontrastieren zum epi-flourescence, zu Totalreflexionsfluoreszenz (TIRF)mikroskopie und zu Laser, die confocal Mikroskopie (CLSM) scannen um einige zu benennen. Diese Kombination von FLUGHANDBUCH und andere Mikroskopiemethoden ist bis jetzt hauptsächlich für Zellenfunktionsstudien verwendet worden. Jedoch kann das JPK Nanowizard® verwendet werden, um überlegene Bilder von lebenden Zellen, gleichzeitig mit zusätzlichen mikroskopischen Techniken zu erhalten (Abbildung 1). Dieses stellt das JPK Nanowizard® ein leistungsfähiges und vielseitiges Hilfsmittel für mehrdimensionale Mikroskopiestudien her.

Mehrdimensionale Mikroskopie

Mehrdimensionale Mikroskopie spricht die Generation von Geisterbildern von verschiedenen Eigenschaften einer Probe im Laufe der Zeit an. Als Beispiel ist mehrdimensionale Mikroskopie an großen Effekt in der Studie der Zusammensetzung und der Dynamik der fokalen Beitrittszellen gewöhnt gewesen.

Abbildung 1.

In diesem Fall wurden mehrfache Leuchtstoffkanäle verwendet, um die Bauteile von fokalen Beitritten und von ihrer Verteilung in Bezug auf einander und zum Actin innerhalb der Zelle zu kennzeichnen. Fortschritte in den erhältlichen fluorophores und in den Probenaufbereitungstechniken bedeuten, dass Fluoreszenz des mehrfachen Kanals auf lebende beide und reparierte Zellen geleitet werden kann.

Diese simultane Darstellung von mehrfachen Leuchtstoffkanälen erzeugt Informationen über die Lokolisierung von mehrfachen Bauteilen in der Zelle, gleichwohl solch ein Anflug weiter ausgedehnt werden könnte, indem man FLUGHANDBUCH mit Fluoreszenzmikroskopie- und -phasenkontrastmikroskopie kombinierte. In solch einer Art kann man den Einbauort von bestimmten Proteinen aber auch die Dynamik von Oberflächenzellen und von unter der Oberfläche liegendem Cytoskeleton zusätzlich zur Gesamtzellmorphologie nicht nur nachforschen, gleichzeitig. Hier haben wir die abgebildeten Zellen REF52 und drücken paxillin-GFP, mit Phasenkontrast, Epifluoreszenz und FLUGHANDBUCH aus.

Experimentelle Installation

Um mehrfache Mikroskopiebilder auf lebenden Zellen zu erwerben, wurden die Zellen auf Deckgläsern gewachsen, die dann in das JPK Biocell™ für Darstellung montiert wurden. Das Biocell™ (Abbildung 2) wird konstruiert, um Datenerfassung von simultanen optischen und FLUGHANDBUCH-Bildern zu optimieren, beim Erhalten einer Umgebung, die von den physiologischen Bedingungen reflektierend ist.

Abbildung 2.

Das Biocell wird konstruiert, um optimale Darstellungsbedingungen für FLUGHANDBUCH und optische Methoden zu aktivieren, während schnellen und genauen Temperaturregler von 20-60°C. erlauben Sie.

Die Zellen waren an 37°C in den Media abgebildet, die HEPES enthalten. Das JPK Nanowizard® war auf ein umgekehrtes Lichtmikroskop Zeiss Axiovert 200M eingebaut. Zellen waren im niedrigen Kraftkonstanten-Kontaktmodus, mit einem flexiblen, unsharpened Kragbalken abgebildet. Zu Beginn jedes Scans wurden ein Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder erhalten.

Lebende ZellBilder

Wie, in Abbildung 1 oben gesehen werden kann, Kontaktmodus FLUGHANDBUCH-Darstellung kann verwendet werden, um Überblickbilder einer ganzen Zelle zu erhalten oder kann unter Verwendung der kleinen Scan-Größen laufen gelassen werden, um Oberflächenzellen über der Auflösung der herkömmlichen Lichtmikroskopie hinaus zu lösen. Während die Auflösung und das Signal, Zuteilung von FLUGHANDBUCH zu lärmen bedeutende Vorteile dieser Abbildungstechnik sind, können sich die Informationen, die in den Bildern von größeren Scan-Größen erzeugt werden, zu anderen Abbildungstechniken nützlich, und auch ergänzen. FLUGHANDBUCH-Darstellung ist ein mechanischer Prozess, basiert auf der Interaktion des sehr flexiblen FLUGHANDBUCH-Fühlers mit der Oberfläche. Infolgedessen sind die Informationen, die erzeugt werden, strukturell und mechanisch. Zusätzlich ist FLUGHANDBUCH eine Oberflächentechnik, also werden FLUGHANDBUCH-Bilder auf die Oberfläche der Zelle und der mechanischen Zellen, wie des Actin Cytoskeleton „gerichtet“, die ihm zugrunde liegen.

Die Kombination der Darstellung die Oberfläche unter Verwendung FLUGHANDBUCHS und der Fluoreszenzdarstellung der fokalen Beitritte erlaubt dem Forscher, die Dynamik von fokalen Beitrittszellen an der Basis der Zelle mit den Actinzellen an der Oberfläche der Zelle zu vergleichen. Die zusätzlichen Phasenkontrastbilder geben eine Gesamteindruckszellmorphologie und können helfen, zu bestimmen, ob die Zellen, die an der Zelloberfläche beobachtet werden, an den Bäschen liegen, die offenbar im Phasenkontrastbild sichtbar gemacht werden. Als solches werden Bilder von der Dynamik erzeugt, die an der Basis, im Gehäuse und an der Oberfläche der Zelle geschieht.

In Abbildung 3 wird eine Reihe Bilder dargestellt - jede Reihe zeigt Phasenkontrast, epifluorescence und die Kontaktmodus-Fehlersignalbilder, die in 15 winzigen Abständen genommen werden. Die Zellen waren auf dem Deckglas dicht, Zellmotilität zu sperren, so, dass Kleinbewegung nachgeforscht werden könnte. Größere Änderungen in der Zellzelle können gesehen werden in den Phasenkontrastbildern (eingekreist worden in A, D, G). Bäschen innerhalb der Zelle können gesehen werden, Stellungen verschoben zu haben. Ein Vergleich der drei epi-Leuchtstoffbilder GFP-beschrifteter paxillin Show geringe Änderung zwischen jedem Bild.

Abbildung 3.

Die weißen Pfeile in den Leuchtstoffbildern (B, E, H) fokale Beitrittszellen des Höhepunktes, die nicht scheinen, im Laufe der Scans zu ändern. Interessant wenn sie mit der Actinzelle in den FLUGHANDBUCH-Bildern verglichen werden, scheinen die fokalen Beitritte nicht zu ändern, während es eine eindeutige Ausrichtung der Actinfasern entlang dem Gehäuse der Zelle gibt. Im Ausgangsbild ist ein Netz im submembranous Cytoskeleton sichtbar. Mit jedem aufeinander folgenden Bild werden die zytoskelettfasern (schwarze Pfeile) und das Zellgehäuse höher übereingestimmt. Darüber hinaus gibt es viele kleinen, flexiblen, in hohem Grade dynamischen Vorsprünge auf den flachen Bereichen der Zelle (eingekreist im Schwarzen). Von diesen Bildern scheint der unter der Oberfläche liegende Cytoskeleton, über dieser Zeitschuppe als die fokalen Beitritte an der Schnittstelle zwischen der Zelle und der Halterung beträchtlich dynamischer zu sein.

Während hier nur fluorophore ein verwendet wird, offensichtlich könnte die Fluoreszenzmikroskopie ausgedehnt werden, um mehrfache Fluoreszenzkanäle zu umfassen. Der Laser im JPK Nanowizard® ist von einer Wellenlänge über dem sichtbaren Spektrum hinaus so, dass rote Kanalfluoreszenz nicht durch das Vorhandensein des FLUGHANDBUCHlasers gestört wird.

An den kleineren Scan-Größen kann der Grad von Dynamik an der Zelloberfläche offenbar gesehen werden. Zwei aufeinander folgende Bilder der Zelloberfläche werden in Abbildung 4 als dreidimensionale Projektionen von topographischen Daten dargestellt. Die zwei Bilder wurden mehrmals hintereinander, 15 Minuten auseinander genommen. Die großen zytoskelettzellen an der Spitze beider Bilder sind ähnlich, gleichwohl viel des Restes der Zelle zwischen Bildern geändert hat. Eine flexible Kante (schwarzer Pfeil) gesehen im ersten Bild ist in dem zweiten verschwunden. Feinere unter der Oberfläche liegende Zelle kann auch gesehen werden, um die Änderungen zu haben, die zwischen den zwei Bildern beträchtlich sind.

Abbildung 4.

Schlussfolgerung

Das FLUGHANDBUCH kann zu lebenden Zellen des Bildes an beispielloser Auflösung und auf einer Zeitschuppe verwendet werden, die für das Ansprechen einiger biologischer Prozesse geeignet ist.

Die Auslegung des JPK Nanowizard® aktiviert die mehrdimensionale Mikroskopie, die FLUGHANDBUCH mit optischen Abbildungstechniken kombiniert.

Solch Eine Installation kann verwendet werden, um gleichzeitig die Ereignisse nachzuforschen, die in den verschiedenen Regionen der Zelle auftreten. Wechselweise konnten die Informationen, die von den verschiedenen Kontrastmethoden aufgelesen wurden, verwendet werden, um Informationen auf Zellefunktion Verhältnissen zu erzeugen. Während FLUGHANDBUCH die interessanten und eindeutigen Informationen über Zellen als unabhängige Abbildungstechnik erzeugen kann, die Integration des JPK Nanowizard® in a völlig - Funktions-, umgekehrtes Lichtmikroskop dehnt das Potenzial für FLUGHANDBUCH für Zelldarstellung aus.

Quelle: JPK-Instrumente

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte JPK-Instrumente

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:52

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