Microscopia Multidimensional en las Células Vivas Usando el Microscopio Atómico de la Fuerza de Nanowizard de los Instrumentos de JPK

Temas Revestidos

Antecedentes

Análisis de la Espectroscopia de la Fuerza

Técnicas de la Microscopia

Microscopia Multidimensional

Ajuste Experimental

Imágenes de la Célula Viva

Conclusión

Antecedentes

Una tendencia en curso en la investigación científica es el revelado de las técnicas que pueden dirigir componentes múltiples de un sistema en un único rato. El análisis del microarray de la DNA proporciona a un tiro rápido del conjunto de genes expresados dentro de una célula en un momento dado. La tecnología Multidimensional de la identificación de la proteína se está desarrollando para determinar el contenido de muestras heterogéneas de proteínas.

Análisis de la Espectroscopia de la Fuerza

El análisis de la espectroscopia de la Fuerza puede dirigir la complejidad de la adherencia de célula distinguiendo entre la contribución de elementos individuales al proceso obligatorio. Los Adelantos en técnicas de la microscopia y preparaciones de la muestra están extendiendo este tipo de aproximación de varios componentes a la proyección de imagen de células.

Técnicas de la Microscopia

La información generada sobre la estructura y la función celulares usando diversas técnicas de la microscopia diferirá dependiendo de cómo se genera el contraste. Combinando técnicas, la información sobre diversas propiedades de la una muestra se puede vigilar simultáneamente. El microscopio atómico de la fuerza de JPK Nanowizard® se diseña para ser instalado en un microscopio pálido invertido, activando proyección de imagen simultánea de una muestra por microscopia atómica de la fuerza (AFM) y las diversas técnicas ópticas de la microscopia a partir de la fase ponen en contraste con el epi-flourescence, la microscopia de fluorescencia total de la reflexión (TIRF) interna y el laser explorando la microscopia confocal (CLSM) para nombrar algunos. Esta combinación del AFM y otros métodos de la microscopia, hasta el momento, se ha utilizado principal para los estudios de la función de estructura. Sin Embargo, el JPK Nanowizard® se puede utilizar para obtener imágenes superiores de células vivas, simultáneamente con las técnicas microscópicas adicionales (cuadro 1). Esto hace el JPK Nanowizard® una herramienta potente y versátil para los estudios multidimensionales de la microscopia.

Microscopia Multidimensional

La microscopia Multidimensional refiere a la generación de imágenes múltiples de diversas propiedades de una muestra en un cierto plazo. Como un ejemplo, la microscopia multidimensional se ha utilizado al gran efecto en el estudio de la composición y de la dinámica de las estructuras focales de la adherencia.

Cuadro 1.

En este caso, los canales fluorescentes múltiples fueron utilizados para caracterizar los componentes de adherencias focales y de su distribución en relación a uno a y a la actinia dentro de la célula. Los Avances en fluorophores y técnicas disponibles de la preparación de la muestra significan que la fluorescencia del canal múltiple se puede conducto en ambos que viven y células reparadas.

Esta proyección de imagen simultánea de canales fluorescentes múltiples genera la información sobre la localización de componentes múltiples en la célula, no obstante tal aproximación podría ser ampliada más a fondo combinando el AFM con microscopia del contraste de la microscopia y de la fase de fluorescencia. De tal manera, no sólo puede uno investigar la ubicación de proteínas determinadas pero también la dinámica de las estructuras superficiales y del citoesqueleto subsuperficie además de la morfología total de la célula, simultáneamente. Aquí tenemos células reflejadas REF52, expresando el paxillin-GFP, con contraste de la fase, epi-fluorescencia y el AFM.

Ajuste Experimental

Para detectar imágenes múltiples de la microscopia en las células vivas, las células fueron crecidas en las tiras, que entonces fueron montadas en el JPK Biocell™ para la proyección de imagen. El Biocell™ (el cuadro 2) se diseña para optimizar la adquisición de las imágenes ópticas y del AFM simultáneas, mientras que mantiene un ambiente reflexivo de condiciones fisiológicas.

Cuadro 2.

El Biocell se diseña para activar las condiciones óptimas de la proyección de imagen para el AFM y los métodos ópticos mientras que permita el control de la temperatura rápido y exacto de 20-60°C.

Las células eran reflejadas en 37°C en los media que contenían HEPES. El JPK Nanowizard® fue instalado en un Zeiss Axiovert que los 200M invirtieron el microscopio pálido. Las Células eran reflejadas en modo de contacto inferior del constante de fuerza, con un voladizo flexible, unsharpened. Al principio de cada exploración un contraste de la fase y las imágenes de la fluorescencia fueron obtenidos.

Imágenes de la Célula Viva

Como se puede considerar arriba, en el cuadro 1, la proyección de imagen del AFM del modo de contacto se puede utilizar para obtener imágenes de la reseña de una célula entera, o se puede operatorio usando pequeñas tallas de la exploración para resolver las estructuras superficiales más allá de la resolución de la microscopia pálida convencional. Mientras Que la ración de la resolución y de la señal ruido del AFM es ventajas importantes de esta técnica de proyección de imagen la información generada en imágenes de tallas más grandes de la exploración puede también ser útil, y complementaria a otras técnicas de proyección de imagen. La proyección de imagen del AFM es un proceso mecánico, sobre la base de la acción recíproca de la antena muy flexible del AFM con la superficie. Por Lo Tanto, la información generada es estructural y mecánica. Además, el AFM es una técnica superficial, así que las imágenes del AFM “se centran” en la superficie de la célula y de las estructuras mecánicas, tales como el citoesqueleto de la actinia, que son la base de él.

La combinación de la proyección de imagen la superficie usando el AFM y de la proyección de imagen de la fluorescencia de adherencias focales permite que el investigador compare la dinámica de las estructuras focales de la adherencia en la base de la célula con las estructuras de la actinia en la superficie de la célula. Las imágenes adicionales del contraste de la fase dan una morfología total de la célula de la impresión y pueden ayudar a determinar si las estructuras observadas en la superficie de la célula son debido a las vesículas que se visualizan sin obstrucción en la imagen del contraste de la fase. Como tal, las imágenes se generan de la dinámica suceso en la base, en el cuerpo y en la superficie de la célula.

En el cuadro 3 una serie de imágenes se presenta - cada fila muestra contraste de la fase, epifluorescence y las imágenes de la señal del desvío del modo de contacto tomadas en 15 intervalos minuciosos. Las células eran densas en la tira, inhibir movilidad de la célula, tales que el movimiento de una escala más pequeña podría ser investigado. Cambios Más Grandes en estructura de célula se pueden considerar en las imágenes del contraste de la fase (circundadas en A, D, G). Las Vesículas dentro de la célula se pueden ver para haber movido posiciones. Una comparación de las tres imágenes epi-fluorescentes de la demostración GFP-etiqueta del paxillin pequeño cambio entre cada imagen.

Cuadro 3.

Las flechas blancas en las imágenes fluorescentes (B, E, H) estructuras focales de la adherencia del punto culminante que no parecen cambiar a lo largo de las exploraciones. Interesante, cuando están comparadas a la estructura de la actinia en las imágenes del AFM, las adherencias focales no parecen cambiar, mientras que hay una alineación distinta de las fibras de la actinia a lo largo del cuerpo de la célula. En la imagen original una red es visible en el citoesqueleto submembranous. Con cada imagen sucesiva las fibras citoesqueléticas se alinean (las flechas negras) y el cuerpo de célula más arriba. Además, hay muchas protuberancias pequeñas, flexibles, altamente dinámicas en las áreas planas de la célula (circundada en negro). De estas imágenes el citoesqueleto subsuperficie parece ser considerablemente más dinámico sobre este escala de tiempo que las adherencias focales en el interfaz entre la célula y el soporte.

Mientras Que aquí solamente uno fluoróforo se utiliza, la microscopia de fluorescencia se podría ampliar obviamente para incluir los canales múltiples de la fluorescencia. El laser en el JPK Nanowizard® es de una longitud de onda más allá del espectro visible tal que la fluorescencia roja del canal no es rota por la presencia del laser del AFM.

En tallas más pequeñas de la exploración, el grado de dinamismo en la superficie de la célula puede ser considerado más sin obstrucción. Dos imágenes sucesivas de la superficie de la célula se presentan en el cuadro 4 como proyecciones tridimensionales de datos topográficos. Las dos imágenes fueron tomadas sucesivamente, 15 minutos aparte. Las estructuras citoesqueléticas grandes en la cima de ambas imágenes son similares, no obstante mucho del descanso de la estructura ha cambiado entre las imágenes. Una cumbrera flexible (flecha negra) vista en la primera imagen ha desaparecido en la segunda. Una estructura subsuperficie Más Fina se puede también considerar para tener cambios considerables entre las dos imágenes.

Cuadro 4.

Conclusión

El AFM se puede utilizar a las células vivas de la imagen en la resolución sin precedente y en escala de tiempo que es conveniente para dirigir varios procesos biológicos.

El diseño del JPK Nanowizard® activa la microscopia multidimensional que combina el AFM con técnicas de proyección de imagen ópticas.

Tal ajuste se puede utilizar para investigar, simultáneamente, las acciones que ocurren en diversas regiones de la célula. Alternativamente, la información espigada de los diversos métodos del contraste se podía utilizar para generar la información en lazos de la estructura-función. Mientras Que el AFM puede generar la información interesante y única sobre las células como técnica de proyección de imagen independiente, la integración del JPK Nanowizard® en a completo - el microscopio pálido funcional, invertido amplía el potencial para el AFM para la proyección de imagen de la célula.

Fuente: Instrumentos de JPK

Para más información sobre esta fuente visite por favor los Instrumentos de JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:28

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