Microscopie Multidimensionnelle sur les Cellules Vivantes Utilisant le Microscope Atomique de Force de Nanowizard des Instruments de JPK

Sujets Couverts

Mouvement Propre

Analyse de Spectroscopie de Force

Techniques de Microscopie

Microscopie Multidimensionnelle

Installation Expérimentale

Images de Cellules Vivantes

Conclusion

Mouvement Propre

Une tendance actuelle dans la recherche scientifique est le développement des techniques qui peuvent adresser les composants multiples d'un système à un seul temps. L'analyse de puce ADN d'ADN fournit une piqûre instantanée de l'ensemble de gènes exprimés dans une cellule à un moment donné. La technologie Multidimensionnelle d'identification des protéines est développée pour déterminer les teneurs des échantillons hétérogènes de protéines.

Analyse de Spectroscopie de Force

L'analyse de spectroscopie de Force peut aborder la difficulté de l'adhérence cellulaire en distinguant la cotisation de différents éléments au procédé obligatoire. Les Avancements dans des techniques et des préparations des échantillons de microscopie étendent ce type d'élan à plusieurs éléments à la représentation des cellules.

Techniques de Microscopie

L'information produite au sujet de la structure cellulaire et du fonctionnement utilisant des techniques variées de microscopie différera selon la façon dont le contraste est produit. En combinant des techniques, des informations sur différentes propriétés de l'un échantillon peuvent être surveillées simultanément. Le microscope atomique de force de JPK Nanowizard® est conçu pour être installé sur un photomicroscope inversé, activant la représentation simultanée d'un échantillon par microscopie atomique de force (AFM) et les techniques optiques variées de microscopie de la phase contrastent à l'epi-flourescence, à la microscopie à fluorescence totale de réflexion interne (TIRF) et à la microscopie confocale de lecture de laser (CLSM) pour nommer quelques uns. Cette combinaison d'AFM et d'autres méthodes de microscopie, jusqu'ici, a été principalement employée pour des études de fonctionnement de structure. Cependant, le JPK Nanowizard® peut être employé pour obtenir des images supérieures des cellules vivantes, simultanément avec des techniques microscopiques supplémentaires (le schéma 1). Ceci effectue au JPK Nanowizard® un outil puissant et versatile pour des études multidimensionnelles de microscopie.

Microscopie Multidimensionnelle

La microscopie Multidimensionnelle se rapporte au rétablissement des images multiples de différentes propriétés d'un échantillon au fil du temps. Comme exemple, la microscopie multidimensionnelle a été utilisée à l'effet grand dans l'étude de composition et de la dynamique des structures focales d'adhérence.

Le Schéma 1.

Dans ce cas, des tunnels fluorescents multiples ont été utilisés pour caractériser les composants des adhérences focales et de leur distribution par rapport à l'un l'autre et à l'actine dans la cellule. Les Avances dans les fluorophores disponibles et les techniques de préparation des échantillons signifient que la fluorescence de tunnel multiple peut être conduite sur les deux qui vivent et les cellules fixes.

Cette représentation simultanée des tunnels fluorescents multiples produit des informations sur la localisation des composants multiples dans la cellule, toutefois un tel élan pourrait être encore étendu en combinant l'AFM avec la microscopie de contraste de microscopie à fluorescence et de phase. D'une telle façon, non seulement peut on vérifier l'emplacement des protéines particulières mais également la dynamique des structures extérieures et du cytosquelette sous la surface en plus de la morphologie générale de cellules, simultanément. Ici nous avons les cellules REF52 imagées, exprimant paxillin-GFP, avec le contraste de phase, l'epi-fluorescence et l'AFM.

Installation Expérimentale

Afin de saisir des images multiples de microscopie sur les cellules vivantes, les cellules ont été développées sur les lamelles, qui ont été alors montées dans le JPK Biocell™ pour la représentation. Le Biocell™ (le schéma 2) est conçu pour optimiser la saisie des images simultanées optiques et d'AFM, tout en mettant à jour un environnement réfléchi des conditions physiologiques.

Le Schéma 2.

Le Biocell est conçu pour activer des conditions optimales de représentation pour l'AFM et les méthodes optiques tandis que permettez le contrôle de température rapide et précis de 20-60°C.

Les cellules étaient imagées à 37°C dans les medias contenant HEPES. Le JPK Nanowizard® a été installé sur Zeiss Axiovert que 200M ont inversé le photomicroscope. Les Cellules étaient imagées en mode de contact faible de constante de force, avec un encorbellement flexible et unsharpened. Au début de chaque échographie un contraste de phase et des images de fluorescence ont été obtenus.

Images de Cellules Vivantes

Comme peut être vue ci-dessus, sur le schéma 1, la représentation d'AFM de mode de contact peut être utilisée pour obtenir des images de synthèse d'une cellule entière, ou peut être actionnée utilisant de petites tailles d'échographie pour résoudre les structures extérieures au delà de la définition de la photomicroscopie conventionnelle. Tandis Que la ration de définition et de signal-bruit de l'AFM sont des principaux avantages de cette technique d'imagerie l'information produite dans les images de plus grandes tailles d'échographie peut également être utile, et complémentaire à d'autres techniques d'imagerie. La représentation d'AFM est un procédé mécanique, basé sur l'interaction de la sonde très flexible d'AFM avec la surface. En Conséquence, l'information produite est structurelle et mécanique. Supplémentaire, l'AFM est une technique extérieure, ainsi des images d'AFM « sont concentrées » sur la surface de la cellule et des structures mécaniques, telles que le cytosquelette d'actine, qui sont à la base de lui.

La combinaison de la représentation la surface utilisant l'AFM et de la représentation de fluorescence des adhérences focales permet au chercheur de comparer la dynamique des structures focales d'adhérence à la base de la cellule aux structures d'actine sur la surface de la cellule. Les images supplémentaires de contraste de phase donnent à une cellule générale d'impression la morphologie et peuvent aider à déterminer si les structures observées sur la surface de cellules sont dues aux vésicules qui sont de manière dégagée conçues dans l'image de contraste de phase. En soi, des images sont produites de la dynamique se produisant à la base, dans le fuselage et sur la surface de la cellule.

Sur le schéma 3 une suite d'images est présentée - chaque ligne affiche le contraste de phase, l'epifluorescence et les images de signe d'erreur de mode de contact prises à 15 intervalles mn. Les cellules étaient denses sur la lamelle, pour empêcher la motilité de cellules, tels que le mouvement sur une échelle plus petite pourrait être vérifié. De Plus Grands changements de structure cellulaire peuvent être vus dans les images de contraste de phase (cerclées dans A, D, G). Des Vésicules dans la cellule peuvent être vues pour avoir déménagé des positions. Une comparaison des trois images epi-fluorescentes de l'exposition GFP-étiquetée de paxillin peu de modification entre chaque image.

Le Schéma 3.

Les flèches blanches dans les images fluorescentes (B, E, H) structures focales d'adhérence de point culminant qui ne semblent pas changer au cours des échographies. Intéressant, si comparées à la structure d'actine dans les images d'AFM, les adhérences focales ne semblent pas changer, attendu qu'il y a un cadrage distinct des fibres d'actine le long du fuselage de la cellule. Dans l'image originale un réseau est visible dans le cytosquelette submembranous. Avec chaque image successive les fibres cytosquelettiques coïncident (les flèches noires) et le corps cellulaire plus haut. De plus, il y a beaucoup petit, flexible, des protrusions hautement dynamiques sur les zones plates de la cellule (cerclée dans le noir). De ces images le cytosquelette sous la surface semble être considérablement plus dynamique au-dessus de cette échelle de temps que les adhérences focales à la surface adjacente entre la cellule et le support.

Tandis Qu'ici seulement un fluorophore est utilisé, évidemment la microscopie à fluorescence pourrait être étendue pour comprendre les tunnels multiples de fluorescence. Le laser dans le JPK Nanowizard® est d'une longueur d'onde au delà du spectre visible tel que la fluorescence rouge de tunnel n'est pas perturbée par la présence du laser d'AFM.

À de plus petites tailles d'échographie, le degré de dynamisme sur la surface de cellules peut plus clair être vu. Deux images successives de la surface de cellules sont présentées sur le schéma 4 en tant que projections en trois dimensions des données topographiques. Les deux images ont été prises successivement, 15 mn à part. Les grandes structures cytosquelettiques en haut des deux images sont assimilées, toutefois une grande partie du reste de la structure a changé entre les images. Une arête flexible (flèche noire) vue dans la première image a disparu dans la deuxième. Une structure sous la surface Plus Fine peut également être vue pour avoir des modifications considérables entre les deux images.

Le Schéma 4.

Conclusion

L'AFM peut être utilisé aux cellules vivantes d'image à la définition sans précédent et sur une échelle de temps qui convient pour adresser un certain nombre de procédés biologiques.

Le design du JPK Nanowizard® active la microscopie multidimensionnelle combinant l'AFM avec des techniques d'imagerie optiques.

Une Telle installation peut être employée pour vérifier, simultanément, des événements se produisant dans différentes régions de la cellule. Alternativement, l'information glanée des différentes méthodes de contraste a pu être employée pour produire de l'information sur des relations de structure-fonctionnement. Tandis Que l'AFM peut produire des informations intéressantes et seules sur des cellules comme technique d'imagerie autonome, l'intégration du JPK Nanowizard® dans a entièrement - le photomicroscope fonctionnel et inversé étend le potentiel pour l'AFM pour la représentation de cellules.

Source : Instruments de JPK

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît les Instruments de JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:47

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