Microscopia Multidimensionale sulle Celle Viventi Facendo Uso del Microscopio Atomico della Forza di Nanowizard dagli Strumenti di JPK

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Sfondo

Analisi di Spettroscopia della Forza

Tecniche di Microscopia

Microscopia Multidimensionale

Impostazione Sperimentale

Immagini delle Cellule Viventi

Conclusione

Sfondo

Una tendenza relativa in corso alla ricerca scientifica è lo sviluppo delle tecniche che possono indirizzare le componenti multiple di un sistema ad un singolo tempo. L'analisi di microarray del DNA fornisce uno scatto improvviso dell'insieme dei geni espressi in un dato momento all'interno di una cella. La tecnologia Multidimensionale dell'identificazione della proteina sta sviluppanda per determinare il contenuto dei campioni eterogenei delle proteine.

Analisi di Spettroscopia della Forza

L'analisi della spettroscopia della Forza può indirizzare la complessità di aderenza delle cellule distinguendo fra il contributo di diversi elementi al trattamento obbligatorio. Gli Avanzamenti nelle tecniche di microscopia e nei preparati del campione stanno estendendo questo tipo di approccio a più componenti alla rappresentazione delle celle.

Tecniche di Microscopia

Le informazioni generate circa la struttura e la funzione cellulari facendo uso di varie tecniche di microscopia differiranno secondo come il contrasto è generato. Combinando le tecniche, le informazioni sui beni differenti dell'un campione possono essere riflesse simultaneamente. Il microscopio atomico della forza di JPK Nanowizard® è destinato per essere installato su un microscopio ottico invertito, permettendo alla rappresentazione simultanea di un campione da microscopia atomica della forza (AFM) e le varie tecniche ottiche di microscopia a partire dalla fase contrappongono al epi-flourescence, alla microscopia di fluorescenza totale del riflesso (TIRF) interno ed al laser scandicenti la microscopia confocale (CLSM) per nominare alcuni. Questa combinazione di AFM ed altri metodi di microscopia, finora, pricipalmente è stata utilizzata per gli studi di funzione di struttura. Tuttavia, il JPK Nanowizard® può essere usato per ottenere le immagini superiori delle celle viventi, simultaneamente con le tecniche microscopiche supplementari (figura 1). Ciò rende al JPK Nanowizard® uno strumento potente e versatile per gli studi multidimensionali di microscopia.

Microscopia Multidimensionale

La microscopia Multidimensionale si riferisce col passare del tempo alla generazione di immagini multiple dei beni differenti di un campione. Come esempio, la microscopia multidimensionale è stata utilizzata a grande effetto nello studio sulla composizione e sulla dinamica delle strutture focali di aderenza.

Figura 1.

In questo caso, i canali fluorescenti multipli sono stati utilizzati per caratterizzare le componenti delle aderenze focali e della loro distribuzione relativamente ad a vicenda e ad actina all'interno della cella. Gli Avanzamenti nei fluorophores e nelle tecniche disponibili del preparato del campione significano che la fluorescenza del canale multiplo può essere condotta entrambi che vivono e sulle celle fisse.

Questa rappresentazione simultanea dei canali fluorescenti multipli genera le informazioni sulla localizzazione delle componenti multiple nella cella, comunque un tal approccio potrebbe più ulteriormente essere esteso combinando il AFM con la microscopia di contrasto di microscopia e di fase di fluorescenza. In un tal modo, non solo può si studiare la posizione delle proteine particolari ma anche la dinamica delle strutture di superficie e del citoscheletro sotto la superficie oltre alla morfologia globale delle cellule, simultaneamente. Qui abbiamo celle imaged REF52, esprimenti il paxillin-GFP, con contrasto di fase, la epi-fluorescenza ed il AFM.

Impostazione Sperimentale

Per acquistare le immagini multiple di microscopia sulle celle viventi, le celle si sono sviluppate sulle lamelle, che poi sono state montate nel JPK Biocell™ per la rappresentazione. Il Biocell™ (figura 2) è destinata per ottimizzare l'acquisizione delle immagini simultanee del AFM ed ottiche, mentre mantiene un ambiente riflettente delle circostanze fisiologiche.

Figura 2.

Il Biocell è destinato per permettere ai termini ottimali della rappresentazione per sia il AFM che i metodi ottici mentre permetta il controllo della temperatura rapido e preciso da 20-60°C.

Le celle erano imaged a 37°C nei media che contengono HEPES. Il JPK Nanowizard® è stato installato su un microscopio ottico invertito 200M di Zeiss Axiovert. Le Celle erano imaged nel modo di contatto basso di costante di forza, con una trave a mensola flessibile e unsharpened. All'inizio di ogni scansione un contrasto di fase e le immagini della fluorescenza sono stati ottenuti.

Immagini delle Cellule Viventi

Può essere veduta sopra, nella figura 1, la rappresentazione del AFM del modo di contatto può essere usata per ottenere le immagini di generalità di intera cella, o può essere gestita facendo uso di piccole dimensioni di scansione per risolvere le strutture di superficie oltre la risoluzione di microscopia leggera convenzionale. Mentre la razione di segnale/disturbo e di risoluzione del AFM è vantaggi importanti di questa tecnica di rappresentazione le informazioni generate nelle immagini di più grandi dimensioni di scansione possono anche essere utili e complementari ad altre tecniche di rappresentazione. La rappresentazione del AFM è un trattamento meccanico, in base all'interazione della sonda molto flessibile del AFM con la superficie. Di Conseguenza, le informazioni generate sono strutturali e meccaniche. Ulteriormente, il AFM è una tecnica di superficie, in modo dalle immagini del AFM “sono messe a fuoco„ sulla superficie della cella e delle strutture meccaniche, quale il citoscheletro dell'actina, che lo sono alla base.

La combinazione di rappresentazione la superficie facendo uso del AFM e di rappresentazione della fluorescenza delle aderenze focali permette che il ricercatore confronti la dinamica delle strutture focali di aderenza alla base della cella alle strutture dell'actina alla superficie della cella. Le immagini supplementari di contrasto di fase danno ad una cella globale dell'impressione la morfologia e possono contribuire a determinare se le strutture osservate alla superficie delle cellule sono dovuto le vescicole che sono visualizzate chiaramente nell'immagine di contrasto di fase. Come tale, le immagini sono generate della dinamica che accade alla base, nell'organismo ed alla superficie della cella.

Nella figura 3 una serie di immagini è presentata - ogni riga mostra il contrasto di fase, il epifluorescence e le immagini del segnale di errore del modo di contatto catturate a 15 intervalli minuti. Le celle erano dense sulla lamella, inibire la motilità delle cellule, tali che il movimento su scala ridotta potrebbe essere studiato. I Più Grandi cambiamenti in struttura della cellula possono essere veduti nelle immagini di contrasto di fase (circondate in A, D, G). Le Vescicole all'interno della cella possono essere vedute per muovere le posizioni. Un confronto delle tre immagini epi-fluorescenti della manifestazione GFP-contrassegnata di paxillin scarso effetto fra ogni immagine.

Figura 3.

Le frecce bianche nelle immagini fluorescenti (B, E, H) strutture focali di aderenza di punto culminante che non sembrano cambiare nel corso delle scansioni. Interessante, una volta confrontate alla struttura dell'actina nelle immagini del AFM, le aderenze focali non sembrano cambiare, mentre c'è un allineamento distinto delle fibre dell'actina lungo l'organismo della cella. Nell'immagine originale una rete è visibile nel citoscheletro submembranous. Con ogni immagine successiva le fibre citoscheletriche coincidono (frecce nere) ed il corpo cellulare più su. Inoltre, ci sono molte piccole, sporgenze flessibili e altamente dinamiche sulle aree piane della cella (circondata nel nero). Da queste immagini il citoscheletro sotto la superficie sembra essere considerevolmente più dinamico sopra questa cronologia genealogica che le aderenze focali all'interfaccia fra la cella ed il supporto.

Mentre qui soltanto uno fluorophore è usato, la microscopia di fluorescenza potrebbe essere estesa ovviamente per comprendere i canali multipli della fluorescenza. Il laser nel JPK Nanowizard® è di una lunghezza d'onda oltre lo spettro visibile tale che la fluorescenza rossa del canale non è interrotta dalla presenza del laser del AFM.

Alle più piccole dimensioni di scansione, il grado di dinamismo alla superficie delle cellule può essere veduto più chiaro. Due immagini successive della superficie delle cellule sono presentate nella figura 4 come proiezioni tridimensionali dei dati topografici. Le due immagini sono state catturate successivamente, 15 minuti a parte. Le grandi strutture citoscheletriche alla cima di entrambe le immagini sono simili, comunque gran parte del resto della struttura è cambiato fra le immagini. Una cresta flessibile (freccia nera) veduta nella prima immagine è scomparso nel seconda. La struttura sotto la superficie Più Fine può inoltre essere veduta per avere cambiamenti considerevoli fra le due immagini.

Figura 4.

Conclusione

Il AFM può essere usato alle celle viventi di immagine a risoluzione senza precedenti e su una cronologia genealogica che è adatta ad indirizzare una serie di trattamenti biologici.

La progettazione del JPK Nanowizard® permette alla microscopia multidimensionale che combina il AFM con le tecniche di rappresentazione ottiche.

Una Tal impostazione può essere usata per studiare, simultaneamente, gli eventi che accadono nelle regioni differenti della cella. Alternativamente, le informazioni derivate dai metodi differenti di contrasto hanno potuto essere usate per generare le informazioni sulle relazioni di struttura-funzione. Mentre il AFM può generare le informazioni interessanti ed uniche sulle celle come tecnica di rappresentazione autonoma, l'integrazione del JPK Nanowizard® nella a completamente - il microscopio ottico funzionale e invertito estende il potenziale per il AFM per la rappresentazione delle cellule.

Sorgente: Strumenti di JPK

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego gli Strumenti di JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:56

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