科学研究の継続的な傾向は、単一の時点で、システムの複数のコンポーネントに対応できる技術の開発です。 DNAマイクロアレイ解析は、所定の時間に細胞内で発現する遺伝子のセットのスナップショットを提供します。多次元タンパク質同定技術は、タンパク質の不均一試料の内容を決定するために開発されています。 フォーススペクトロスコピー分析 フォーススペクトロスコピー分析は、バインディングプロセスに個々の要素の寄与を区別することによって細胞接着の複雑さに対処することができます。顕微鏡技術とサンプル調製の進歩は、細胞のイメージングに多成分のアプローチのこのタイプを拡張している。 顕微鏡技術 様々な顕微鏡技術を用いて細胞の構造と機能について生成された情報は、コントラストがどのように生成されるかによって異なります。技術を組み合わせることで、一つのサンプルのさまざまなプロパティについての情報を同時に監視することができます。 JPK Nanowizard ®原子間力顕微鏡は、位相コントラストからエピflourescence、内部全反射蛍光（全反射するために原子間力顕微鏡（AFM）および各種光学顕微鏡技術によるサンプルの同時イメージングを可能にする、倒立光学顕微鏡上にインストールするように設計されています）いくつか例を挙げると共焦点顕微鏡（CLSM）を走査型顕微鏡とレーザー。 AFMと他の顕微鏡法の組み合わせは、これまで、主に構造機能研究のために利用されている。しかし、 JPK Nanowizard ®は、追加の顕微鏡技術（図1）と同時に、生きた細胞の優れた画像を得るために使用することができます。これはですJPK Nanowizard ®多次元顕微鏡研究のための強力で多目的なツールを。 多次元顕微鏡 多次元顕微鏡は、時間をかけてサンプルの異なる性質の複数の画像の世代を指します。例として、多次元顕微鏡は、焦点接着構造の組成とダイナミクスの研究に大きな効果を使用されています。  図1。 徐々に小さくスキャンサイズにおける生体細胞の連続エラー信号の画像。すべての低圧力で撮影した画像、一定の接触モード このケースでは、複数の蛍光チャネルは相互に、かつ、細胞内のアクチンとの関係で接着斑とその分布の構成要素を特徴づけるために使用されていました。利用可能な蛍光物質と試料調製技術の進歩により、複数チャネルの蛍光が生活や固定細胞の両方で行うことができることを意味する。 複数の蛍光チャネルのこの同時イメージングは、細胞内の複数のコンポーネントのローカライズに関する情報を生成し、しかしそのようなアプローチは、蛍光顕微鏡と位相差顕微鏡とAFMを組み合わせることにより、さらに拡張することができる。このようにして、だけではなく、同時に、全体的な細胞の形態に加えて、特定の蛋白質の場所だけでなく、表面構造と地下細胞骨格のダイナミクスを調べることができます。ここでは、位相コントラスト、落射蛍光とAFMで、パキシリン- GFPを発現し、REF52細胞を画像化している。 実験的なセットアップ 生きた細胞上の複数の顕微鏡画像を取得するために、細胞は、その後にマウントされたカバーグラス上で増殖させたJPK バイオセルイメージングのための™。 バイオセル ™（図2）生理学的条件を反映した環境を維持しながら、同時光学およびAFM像の取得を最適化するように設計されています。  図2。JPK バイオセル™ バイオセルは、 20〜60℃から迅速かつ正確な温度制御を可能にしながらAFMと光学的方法の両方に最適な撮影条件を有効にするために設計されています。 細胞を37で撮像した·メディアのCは、HEPESを含む。 JPK Nanowizard ®はツァイスAxiovert 200M倒立光学顕微鏡に設置されました。細胞は柔軟性、unsharpenedカンチレバーで、低力の定数接触モードで画像化した。各スキャンの開始時に位相コントラストおよび蛍光画像が得られた。 生細胞の画像 ASは、図1に、コンタクトモードAFMイメージングは細胞全体の概観の画像を取得するために使用できる、または、従来の光学顕微鏡の分解能を越えて表面構造を解決するための小さなスキャンサイズを使って操作できる、上記で見ることができます。 AFMのN比の分解能と信号がこのイメージング技術の大きな利点であるが大規模なスキャンのサイズの画像で生成された情報は、有用な、と他のイメージング技術を補完することができます。 AFMイメージングは、表面に非常に柔軟なAFMプローブの相互作用に基づいて、機械的なプロセスです。その結果、生成された情報は、構造と機械的です。また、AFMは表面のテクニックですので、AFM像は、それを根底にあるようなアクチン細胞骨格などの細胞と機械的な構造、、の表面に"焦点を当てて"されています。 接着斑のAFMと蛍光イメージングを用いたイメージングの組み合わせ表面は、調査員が、細胞の表面でのアクチンの構造と細胞の基部に接着斑の構造のダイナミクスを比較することができます。追加の位相コントラスト像は、全体的な印象の細胞の形態を与え、細胞表面で観測される構造が明らかに位相コントラスト画像で視覚化されている小胞に起因するかどうかを判断するのに役立ちます。このように、画像がベースで、体内で、細胞の表面で起こってダイナミクスから生成されます。 図3では、一連の画像が提示される-各行は15分間隔で撮影された位相コントラスト、落射蛍光と接触モードのエラー信号の画像を示す。細胞は小さい規模の動きを調査することができるように細胞の運動性を阻害する、カバースリップ上に高密度であった。セル構造の大きな変化は、位相コントラスト画像（丸で、D、G）で見ることができる。細胞内小胞が移動した位置を持つように見ることができます。 GFP標識パキシリンの三エピ蛍光画像の比較は、各画像の間にほとんど変化を示さない。  図3。REF52 繊維芽細胞の複数のチャネルタイムラプス画像。生きている線維芽細胞は、落射蛍光（B、E、H）（A、D、G）、位相コントラストで画像化し、t = 0での原子間力顕微鏡（C、F、I）（A、B、Cでモードを連絡した）は、t = 15（D、E、F）とt = 30（G、H、I）。 蛍光画像の白い矢印は（B、E、H）スキャンのコースを介して変更していないよう接着斑の構造を強調。セルの体に沿ってアクチン繊維の異なるアライメントが存在するのに対し、興味深いことに、AFM像におけるアクチンの構造と比較すると、接着斑は、変更していないようだ。元の画像でネットワークは亜 膜性の細胞骨格に表示されます。それぞれの連続したイメージで細胞骨格繊維は、より多くの整列になり（黒矢印）と細胞体より高い。さらに、細胞の平坦な地域で多くの小規模な、柔軟で、高度に動的な突起は、（黒の円内）があります。これらの画像から地下細胞骨格は細胞とサポートの間の界面における接着斑よりも、この時間スケールでかなりダイナミックと思われる。 ここで唯一の蛍光体が使用されている間、明らかに蛍光顕微鏡は、複数の蛍光チャンネルを含むように拡張することができます。のレーザーJPK Nanowizard ®は、赤チャンネルの蛍光はAFMレーザーの存在によって中断されないような可視スペクトルを超えて波長のです。 小さ なスキャンサイズで、細胞表面でのダイナミズムの度合いはより明確に見ることができます。細胞表面の連続した2つの画像は、地形データの三次元投影として図4に示す。二つの画像は15分間隔で、連続して撮影した。両方の画像の上部にある大規模な細胞骨格構造が類似している、構造の残りのしかし多くは、画像間で変更されました。最初の画像に見られる柔軟な尾根（黒矢印）は、第二に消滅している。細かいサブ表面構造は、2つの画像間でかなりの変化を持つように見ることができます。  図4。 細胞表面の同じ領域の連続した地形画像。どちらの場合も、スキャンサイズは5 × 5μmであり、zの範囲000〜200 nmである。 結論 AFMは、前例のない解像度で、生物学的プロセスの数に対処するのに適した時間スケールでの画像の生きた細胞に使用することができます。 の設計JPK Nanowizard ®は、光学イメージング技術とAFMを組み合わせた多次元顕微鏡を可能にします。 そのような設定は、同時に、細胞のさまざまな地域で発生するイベントを調査するために使用することができます。また、異なるコントラスト法から収集した情報は、構造と機能の関係に関する情報を生成するために使用することができる。 AFMは、スタンドアロンのイメージング技術、の統合としての細胞についての興味深い、ユニークな情報を生成できますが、 JPK Nanowizardに®完全に機能する、反転光顕微鏡は、細胞イメージングのためのAFMの可能性を拡張します。 |