JPK の器械からの Nanowizard 原子力の顕微鏡を使用して生体細胞の多次元顕微鏡検査

カバーされるトピック

背景

力の分光学の分析

顕微鏡検査の技術

多次元顕微鏡検査

実験セットアップ

生体細胞の画像

結論

背景

科学研究の進行中の傾向は単一時にシステムの多重コンポーネントをアドレス指定できる技術の開発です。 DNA のマイクロアレイの分析はセルの内にある特定時に表現される遺伝子のセットの急な打撃を提供します。 多次元蛋白質の識別技術は蛋白質の異質サンプルの内容を定めるために開発されています。

力の分光学の分析

力の分光学の分析はバインディングプロセスに個々の要素の貢献の間の区別によって細胞粘着の複雑さをアドレス指定できます。 顕微鏡検査の技術およびサンプル準備の進歩はセルのイメージ投射にこのタイプの多成分アプローチを拡張しています。

顕微鏡検査の技術

さまざまな顕微鏡検査の技術を使用して細胞構造および機能について生成された情報は対照がどのようにによって生成されるか異なります。 技術の結合によって、 1 つのサンプルの異なった特性についての情報は同時に監視することができます。 JPK Nanowizard® 原子力の顕微鏡は原子力の顕微鏡検査によって逆にされた光学顕微鏡で設計され、サンプルの同時イメージ投射を可能にしますインストールされるように (AFM)段階からのさまざまな光学顕微鏡検査の技術は少数を指名するために共焦点の顕微鏡検査 (CLSM) をスキャンする (TIRF) epi-flourescence、総内面反射の蛍光顕微鏡およびレーザーに対比します。 AFM のこの組合せおよび他の顕微鏡検査方法は構造機能調査のために、これまでに、主に利用されました。 ただし追加顕微鏡の技術 (図 1) の生体細胞の優秀な画像を、同時に得るのに、 JPK Nanowizard® が使用することができます。 これは JPK Nanowizard® に多次元顕微鏡検査の調査のための強力で、多目的なツールを作ります。

多次元顕微鏡検査

多次元顕微鏡検査はサンプルの異なった特性の複数の画像の生成を一定時間にわたり示します。 一例として、多次元顕微鏡検査は焦点付着の構造の構成そして原動力の調査ですばらしい効果に使用されました。

図 1。

この場合、多重蛍光チャネルが互いに関連してそしてセル内のアクチンに焦点付着および分布のコンポーネントを特徴付けるのに使用されました。 使用できる fluorophores およびサンプル準備の技術の前進はマルチチャネルの蛍光性が住んでいる両方および修復されたセルで行なうことができることを意味します。

多重蛍光チャネルのこの同時イメージ投射はそのようなアプローチが蛍光顕微鏡および段階の対照の顕微鏡検査と AFM を結合することによって更に拡張できるどんなに、セルの多重コンポーネントのローカリゼーションについての情報を生成します。 そのような方法では、同時にしか 1 つは全面的なセル形態に加えて特定蛋白質の位置表面の構造および表面下の細胞骨格のまた原動力を調査できません。 ここに私達に段階の対照、 epi 蛍光性および AFM が付いている paxillin-GFP を、表現する視覚化された REF52 セルがあります。

実験セットアップ

生体細胞の多重顕微鏡検査の画像を得るためには、セルはイメージ投射のための JPK Biocell™に取付けられた coverslips で育ちました。 生理学的な条件の反射環境を維持している間 Biocell™ (同時光学および AFM の画像の獲得を最適化するように図 2) は設計されています。

図 2。

Biocell は 20-60°C. からの急速で、精密な温度調整を許可する間、 AFM および光学方法両方のための最適イメージ投射条件を可能にするように設計されています。

セルは HEPES を含んでいる媒体の 37°C で視覚化されていました。 JPK Nanowizard® は 200M が光学顕微鏡を逆にしたツァイス Axiovert でインストールされました。 セルは適用範囲が広い、 unsharpened 片持梁との低い力の定数の接触モードで視覚化されていました。 各スキャンの始めに段階の対照および蛍光性の画像は得られました。

生体細胞の画像

全セルの概要の画像を得るのに慣習的な光学顕微鏡検査の解像度を越える表面の構造を解決するために接触モード AFM イメージ投射が使用することができたりまたは小さいスキャンサイズを使用して作動することができる、図 1 で上で見ることができるように。 AFM の解像度および信号対雑音の配給量がこの映像技術の主要な利点の間、より大きいスキャンサイズの画像で生成される情報はまた他の映像技術に有用、補足である場合もあります。 AFM イメージ投射は表面が付いている非常に適用範囲が広い AFM のプローブの相互作用に基づいて機械的処理、です。 その結果、生成される情報は構造および機械です。 さらに、 AFM は表面の技術です、従って AFM の画像はセルそしてそれの下にある機械構造の表面に、アクチン細胞骨格のような 「焦点を合わせます」。

イメージ投射 AFM を使用して表面および焦点付着の蛍光性イメージ投射の組合せは調査官がセルの表面でアクチン構造とセルのベースで焦点付着の構造の原動力を比較することを可能にします。 追加段階の対照の画像は全面的な印象のセル形態を与え、セル表面で観察される構造が段階の対照の画像ではっきり視覚化される小胞が原因であるかどうか定めるのを助けることができます。 したがって、画像は原動力のベースで、ボディでそしてセルの表面で起こる生成されます。

図 3 一連の画像で示されます - 各列は段階の対照、 epifluorescence および 15 の微細な間隔で撮られる接触モードのエラーシグナルの画像を示します。 セルは小規模の動きが調査できること coverslip で密、セル運動性を禁じるためにそのような物でした。 段階の対照の画像のセル構造のより大きい変更は見ることができます (A で、 D の G) 一周される。 セル内の小胞は位置を移動するために見ることができます。 GFP 分類された paxillin ショーの 3 つの epi 蛍光画像の比較各画像間の僅かな変化。

図 3。

蛍光画像 (B、 E、 H) ハイライトのスキャンの間に変更しないような焦点付着のの白い矢構造。 興味深いことに、 AFM の画像のアクチン構造と比較されたとき、焦点付着はセルのボディに沿うアクチンファイバーの個別のアラインメントがある一方変更しないようではないです。 元の画像でネットワークは submembranous 細胞骨格で目に見えます。 各々の連続的な画像によって cytoskeletal ファイバーはより一直線に並べられて (黒い矢) および高の細胞体なります。 さらに、セルの平らな領域に多くの小さく、適用範囲が広く、極めてダイナミックな突起があります (黒で一周される)。 これらの画像から表面下の細胞骨格はセルとサポート間のインターフェイスで焦点付着よりこの時間目盛にかなりダイナミックようです。

ここに fluorophore 1 つだけが使用される間、多重蛍光性チャネルが含まれるために、明らかに蛍光顕微鏡は拡張できます。 JPK Nanowizard® のレーザーは可視スペクトルを越える波長赤いチャネルの蛍光性が AFM レーザーの存在によって破壊されないことそのような物です。

より小さいスキャンサイズで、セル表面の動力論のある程度はもっとはっきり見ることができます。 セル表面の 2 つの連続的な画像は地勢データの三次元投射として図 4 で示されます。 2 つの画像は、 15 分離れて引き続いて撮られました。 両方の画像の上の大きい cytoskeletal 構造は構造の残りの多くが画像の間で変更したどんなに、類似しています。 最初の画像で見られる適用範囲が広い隆起部分 (黒い矢) は第 2 で消えました。 より良い表面下の構造はまた 2 つの画像間でかなり変更があるために見ることができます。

図 4。

結論

AFM は前例のない解像度でそしていくつかの生物学的過程をアドレス指定するために適している時間目盛で画像の生体細胞に使用することができます。

JPK Nanowizard® のデザインは光学映像技術と AFM を結合する多次元顕微鏡検査を可能にします。

そのようなセットアップが、同時に、セルの異なった領域に発生するイベントを調査するのに使用することができます。 また、異なった対照方法から拾われた情報が構造機能関係で情報を生成するのに使用できます。 AFM がスタンドアロン映像技術としてセルについての興味深く、一義的な情報を生成できる間、フル機能装備の、逆にされた光学顕微鏡への JPK Nanowizard® の統合はセルイメージ投射の AFM のための潜在性を拡張します。

ソース: JPK の器械

このソースのより多くの情報のために JPK の器械を訪問して下さい

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:00

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