JPK 계기에서 Nanowizard 원자 군대 현미경을 사용하는 생세포에 다차원 현미경 검사법

커버되는 토픽

배경

군대 분광학 분석

현미경 검사법 기술

다차원 현미경 검사법

실험적인 준비

생세포 심상

결론

배경

과학적인 연구에 있는 전진하는 동향은 시간에 시스템의 다중 분대를 제시할 수 있는 기술의 발달입니다. DNA microarray 분석은 세포 안에서 주어진 시간에 표현된 유전자의 세트의 황급한 탄을 제공합니다. 다차원 단백질 식별 기술은 단백질의 이질적인 견본의 내용을 결정하기 위하여 개발되고 있습니다.

군대 분광학 분석

군대 분광학 분석은 바인딩 프로세스에 개별적인 성분의 기여금 사이에서 구별해서 세포 접착의 복합성을 제시할 수 있습니다. 현미경 검사법 기술과 견본 준비에 있는 전진은 세포의 화상 진찰까지 다성분 접근의 이 모형을 확장하고 있습니다.

현미경 검사법 기술

각종 현미경 검사법 기술을 사용하여 셀 방식 구조물 및 기능에 관하여 생성된 정보는 대조가 어떻게에 따라서 생성되는지 다를 것입니다. 기술을 결합해서, 1개 견본의 다른 속성에 관하여 정보는 동시에 감시될 수 있습니다. JPK Nanowizard® 원자 군대 현미경은 원자 군대 현미경 검사법에 의해 거꾸로 한 가벼운 현미경에 디자인되고, 견본의 동시 화상 진찰을 가능하게 하 설치되기 위하여 (AFM) 단계에서 각종 광학적인 현미경 검사법 기술은 약간을 지명하기 위하여 confocal 현미경 검사법 (CLSM)를 검사하는 (TIRF) epi-flourescence, 총 내부 반사 형광 현미경 검사법 및 레이저에 대조합니다. AFM의 이 조합 및 그밖 현미경 검사법 방법은 구조 함수 연구 결과를 위해, 여태까지는, 주로 이용되었습니다. 그러나, JPK Nanowizard®는 추가 현미경 기술 (숫자 1)를 가진 생세포의 우량한 심상을, 동시에 장악하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이것은 JPK Nanowizard®에게 다차원 현미경 검사법 연구 결과를 위한 강력하고 다재다능한 공구를 만듭니다.

다차원 현미경 검사법

다차원 현미경 검사법은 견본의 다른 속성의 멀티플 이미지의 발생을 한동안 나타납니다. 한 예로, 다차원 현미경 검사법은 초점 접착 구조물의 구성 그리고 역동성의 연구 결과에 있는 훌륭한 효력 사용되었습니다.

숫자 1.

이런 경우에, 다중 형광성 채널 통신로는 서로에 관하여 그리고 세포 내의 악틴에 초점 접착 및 그들의 배급의 분대를 성격을 나타내기 위하여 사용되었습니다. 유효한 fluorophores 및 견본 준비 기술에 있는 어드밴스는 다중 채널 통신로 형광이 사는 둘 다 및 고쳐진 세포에 수행될 수 있다는 것을 의미합니다.

다중 형광성 채널 통신로의 이 동시 화상 진찰은 그런 접근이 형광 현미경 검사법과 단계 대조 현미경 검사법과 AFM를 결합해서 더 확장될 수 있었다 그러나, 세포에 있는 다중 분대의 지방화에 관하여 정보를 생성합니다. 그런 방법에서는, 동시에 뿐만 아니라 누구든개는 전반적인 세포 형태학 이외에 특정한 단백질의 위치 또한 지상 구조물 및 지하 세포 뼈대의 역동성을 조사할 수 있습니다. 여기에서 우리는 단계 대조, epi 형광 및 AFM와 더불어 paxillin-GFP를, 표현하는 imaged REF52 세포가 있습니다.

실험적인 준비

생세포에 다중 현미경 검사법 심상을 취득하기 위하여는, 세포는 화상 진찰을 위한 JPK Biocell™로 그 때 거치된 coverslips에 증가되었습니다. 생리적인 조건의 사려깊은 환경을 유지하고 있는 동안 Biocell™ (동시 광학 적이고와 AFM 심상의 취득을 낙관하기 위하여 숫자 2)는 디자인됩니다.

숫자 2.

Biocell는 20-60°C.에서 급속하고 정확한 온도 조종을 허용하는 동안 AFM와 광학적인 방법 둘 다를 위한 최적 화상 진찰 조건을 가능하게 하기 위하여 디자인됩니다.

세포는 HEPES를 포함하는 매체에 있는 37°C에 imaged 이었습니다. JPK Nanowizard®는 200M가 가벼운 현미경을 거꾸로 한 Zeiss Axiovert에 설치되었습니다. 세포는 유연한, unsharpened 외팔보와 더불어 낮은 힘상수 접촉형에서 imaged, 이었습니다. 각 검사 시작되는 시점에 단계 대조 및 형광 심상은 장악되었습니다.

생세포 심상

, 전체적인 세포의 개관 심상을 장악하기 위하여 전통적인 가벼운 현미경 검사법의 해결책 저쪽에 지상 구조물을 해결하기 위하여 접촉형 AFM 화상 진찰이 사용될 수 있고, 또는 작은 검사 규모를 사용하여 작전될 수 있다, 숫자 1에서 상기 보일 수 있다시피. AFM의 해결책과 신호 대 잡음 식량이 이 화상 기술의 중요한 이점의 동안 더 큰 검사 규모의 심상에서 생성된 정보는 또한 그밖 화상 기술에 유용하고, 무료할 수 있습니다. AFM 화상 진찰은 표면을 가진 아주 유연한 AFM 탐사기의 상호 작용에 근거하여 기계 프로세스, 입니다. 따라서, 생성된 정보는 구조상과 기계적입니다. 게다가, AFM는 지상 기술입니다, 그래서 AFM 심상은 세포 그리고 그것을 밑에 있는 기계적인 구조물의 표면에 악틴 세포 뼈대와 같은 "집중됩니다".

화상 진찰 AFM를 사용하여 표면과 초점 접착의 형광 화상 진찰의 조합은 조사자가 세포의 표면에 악틴 구조물과 세포의 기지에 초점 접착 구조물의 역동성을 비교하는 것을 허용합니다. 추가 단계 대조 심상은 전반적인 느낌 세포 형태학을 주고 세포 표면에 관찰된 구조물이 단계 대조 심상에서 명확하게 구상되는 소포 때문이 결정하는 것을 도울 수 있습니다. 따라서, 심상은 기지에, 바디에서 그리고 세포의 표면에 일어나는 역동성의 생성됩니다.

숫자 3 일련의 심상에서 제출됩니다 - 각 줄은 단계 대조, epifluorescence 및 15의 작은 간격으로 취한 접촉형 과실 신호 심상을 보여줍니다. 세포는 소규모 운동이 조사될 수 있었다 coverslip에 조밀했습니다, 그 같은 세포 운동성을 억제하기 위하여. A에서, D 도는 의 단계 대조 심상에서 세포 구조물에 있는 더 큰 변경은 보일 수 있습니다 (G). 세포 내의 소포는 위치를 것을 보일 수 있습니다. GFP 레테르를 붙인 paxillin 쇼의 3개의 epi 형광성 심상의 비교 각 심상 사이 작은 변화.

숫자 3.

형광성 이미지 (B, E, H) 하이라이트 검사 동안 바꾸는 것을 보이지 않는 초점 접착에 있는 백색 화살 구조물. 흥미롭게, AFM 심상에 있는 악틴 구조물에 비교될 때, 초점 접착은 세포의 바디에 따라서 악틴 섬유의 명백한 줄맞춤이 있더라도 반면, 변경하는 것을 보이지 않습니다. 본래 심상에서 통신망은 submembranous 세포 뼈대에서 눈에 보입니다. 각 계속되는 심상으로 세포 구조 섬유는 맞춰 (까만 화살) 높이의 세포체 되고. 추가적으로, (검정에서 도는) 세포의 편평한 지역에 많은 작고, 유연한, 매우 역동적인 돌출이 있습니다. 이 심상에서 지하 세포 뼈대는 세포와 지원 사이 공용영역에 초점 접착 보다는 이 시간의 척도에 상당히 동적인 것을 보입니다.

여기에서 fluorophore 단지 1개가 사용되는 동안, 명백하게 형광 현미경 검사법은 다중 형광 채널 통신로를 포함하기 위하여 확장될 수 있었습니다. JPK Nanowizard®에 있는 레이저는 가시광선 저쪽에 파장의 빨간 채널 통신로 형광이 AFM 레이저의 존재에 의해 중단되지 않다 그 같은입니다.

더 작은 검사 규모에, 세포 표면에 동력론의 정도는 더 명확하게 보일 수 있습니다. 세포 표면의 2개의 계속되는 심상은 지형도 작성 데이터의 3차원 투상으로 숫자 4에서 제출됩니다. 2개의 심상은, 15 분 따로따로 연속적으로 취했습니다. 두 심상 전부의 상단에 큰 세포 구조 구조물은 구조물의 나머지의 다량이 심상 사이에서 변경했다 그러나, 유사합니다. 첫번째 심상에서 보인 유연한 능선 (까만 화살)는 두번째에서 사라졌습니다. 더 정밀한 지하 구조물에는 또한 2개의 심상 사이 상당한 변경이 있을 것을 보일 수 있습니다.

숫자 4.

결론

AFM는 전례가 없는 해결책에 그리고 다수 생물학 프로세스 언급을 위해 적당한 시간의 척도에 심상 생세포에 이용될 수 있습니다.

JPK Nanowizard®의 디자인은 광학적인 화상 기술과 AFM를 결합하는 다차원 현미경 검사법을 가능하게 합니다.

그런 준비는, 동시에, 세포의 다른 지구에서 일어나는 사건을 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다. 양자택일로, 다른 대조 방법에서 주운 정보는 구조물 기능 관계에 정보를 생성하기 위하여 이용될 수 있었습니다. AFM가 독립 화상 기술로 세포에 관하여 흥미롭고 유일한 정보를 생성하는 수 있는 동안, 완전 기능의, 거꾸로 한 가벼운 현미경으로 JPK Nanowizard®의 통합은 세포 화상 진찰을 위한 AFM를 위한 잠재력을 확장합니다.

근원: JPK 계기

이 근원에 추가 정보를 위해 JPK 계기를 방문하십시오

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:04

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