Een voortdurende trend in het wetenschappelijk onderzoek is de ontwikkeling van technieken die meerdere componenten van een systeem kunnen richten op een enkele keer. DNA microarray analyse geeft een momentopname van de set van genen die tot expressie in een cel op een gegeven moment. Multidimensionele eiwit-identificatie technologie wordt ontwikkeld om de inhoud van heterogene monsters van eiwitten te bepalen. Force Spectroscopy Analyse Force spectroscopie analyse kan het adres van de complexiteit van de celadhesie door onderscheid te maken tussen de bijdrage van de afzonderlijke elementen om de binding proces. De vooruitgang in microscopie technieken en sample de voorbereidingen zijn de uitbreiding van deze vorm van multi-component benadering van de beeldvorming van cellen. Microscopische technieken De gegenereerde informatie over cellulaire structuur en functie met behulp van diverse microscopische technieken zullen verschillen, afhankelijk van hoe contrast is gegenereerd. Door het combineren van technieken kan informatie over verschillende eigenschappen van het ene monster tegelijk worden gecontroleerd. De JPK Nanowizard ® atomic force microscoop is ontworpen om te worden geïnstalleerd op een omgekeerde lichtmicroscoop, waarmee gelijktijdig beeldvorming van een monster door atomaire kracht microscopie (AFM) en diverse optische microscopie technieken van fase tegenstelling tot epi-fluorescentie, totale interne reflectie fluorescentie (TIRF ) microscopie en laser scanning confocale microscopie (CLSM) om een paar te noemen. Deze combinatie van AFM en andere microscopie methoden heeft, tot nu toe voornamelijk gebruikt voor de structuur functie studies. Echter, de JPK Nanowizard kan ® worden gebruikt om de superieure beeldkwaliteit van levende cellen te verkrijgen, tegelijkertijd met extra microscopische technieken (figuur 1). Dit maakt de JPK Nanowizard ® een krachtig en veelzijdig instrument voor multidimensionele microscopie studies. Multidimensionale Microscopie Multidimensional microscopie verwijst naar de generatie van meerdere afbeeldingen van de verschillende eigenschappen van een steekproef in de tijd. Als voorbeeld, is multidimensionale microscopie is gebruikt om veel effect in de studie van de samenstelling en dynamiek van focal adhesion structuren.  Figuur 1. Opeenvolgende foutsignaal beelden van een levende cel op steeds kleiner te scannen maten. Alle foto's genomen in een laag van kracht, constant contact mode In dit geval werden meerdere TL-kanalen gebruikt om de componenten van focale adhesies en hun verdeling in relatie tot elkaar en tot actine in de cel te karakteriseren. Vooruitgang in de beschikbare fluoroforen en monstervoorbereiding technieken betekenen dat meerdere kanalen fluorescentie kan worden uitgevoerd op zowel de woon-en vaste cellen. Deze gelijktijdige beeldvorming van meerdere tl-kanalen genereert informatie over de lokalisatie van meerdere componenten in de cel, maar een dergelijke benadering kan worden uitgebreid door het combineren van AFM met fluorescentie microscopie en fase contrast microscopie. Op een zodanige wijze, kan niet alleen een onderzoek naar de locatie van bepaalde eiwitten, maar ook de dynamiek van de oppervlakte structuren en ondergrondse cytoskelet in aanvulling op de algemene cel morfologie, tegelijkertijd. Hier hebben we belicht REF52 cellen, expressie paxillin-GFP, met fase contrast, epi-fluorescentie en AFM. Experimentele opstelling Om meerdere microscopie beelden op levende cellen te verwerven, werden de cellen gekweekt op dekglaasjes, die vervolgens werden gemonteerd in de JPK BioCell ™ voor de beeldvorming. De BioCell ™ (figuur 2) is ontworpen om de verwerving van gelijktijdige optische en AFM beelden te optimaliseren, met behoud van een omgeving een afspiegeling is van fysiologische omstandigheden.  Figuur 2. De JPK BioCell ™ De BioCell is ontworpen om een optimale imaging voorwaarden voor zowel AFM en optische methoden in staat stellen, terwijl mogelijk een snelle en nauwkeurige temperatuurregeling van 20-60 ° C. De cellen werden afgebeeld bij 37 ° C in media die HEPES. De JPK Nanowizard ® is geïnstalleerd op een Zeiss Axiovert 200M omgekeerd lichtmicroscoop. De cellen werden afgebeeld in lage kracht constant contact modus, met een flexibele, unsharpened cantilever. Aan het begin van elke scan een fase contrast en fluorescentie beelden werden verkregen. Living Cell beelden Zoals hierboven te zien is, in figuur 1, kan contact opnemen met mode AFM beeldvorming worden gebruikt om overzicht te beelden van een hele cel te krijgen, of kan worden bediend met behulp van kleine scan maten voor oppervlakte structuren op te lossen dan de resolutie van conventionele lichtmicroscopie. Terwijl de resolutie en signaal-ruisverhouding van de AFM zijn belangrijke voordelen van deze beeldvormende techniek van de informatie die wordt gegenereerd in afbeeldingen van de grotere maten scan kan ook nuttig zijn, en complementair met andere beeldvormende technieken. AFM beeldvorming is een mechanisch proces, gebaseerd op de interactie van de zeer flexibele AFM sonde met het oppervlak. Bijgevolg, de gegenereerde informatie is structureel en mechanisch. Bovendien, AFM is een oppervlakte techniek, zodat AFM beelden zijn "gericht" op het oppervlak van de cel en de mechanische structuren, zoals het actine cytoskelet, dat het ten grondslag liggen. De combinatie van imaging het oppervlak met behulp van AFM en fluorescentie beeldvorming van focale adhesies kan de onderzoeker om de dynamiek van focal adhesion structuren te vergelijken aan de voet van de cel met het actine structuren op het oppervlak van de cel. De extra fase-contrast beelden geven een globale indruk celmorfologie en kan helpen om te bepalen of structuren waargenomen op het celoppervlak zijn te wijten aan blaasjes die duidelijk gevisualiseerd in de fase contrast beeld. Als zodanig zijn beelden gegenereerd van dynamiek gebeuren aan de basis, in het lichaam en op het oppervlak van de cel. In figuur 3 een serie beelden wordt gepresenteerd - elke rij blijkt uit fase contrast, epifluorescentie en neem contact op mode foutsignaal foto's genomen op 15 minuten. De cellen werden dicht op het dekglaasje, naar cel beweeglijkheid, zodat kleinere schaal beweging kon worden onderzocht remmen. Grotere veranderingen in de celstructuur is te zien in de fase contrastrijke beelden (omcirkeld in A, D, G). Blaasjes binnen de cel kan worden gezien verplaatst posities. Een vergelijking van de drie epi-fluorescerende beelden van GFP-gelabelde paxillin tonen weinig verandering tussen elke afbeelding.  Figuur 3. Meerdere kanalen time-lapse beelden van REF52 fibroblast cellen. Living fibroblast cellen werden afgebeeld in fasecontrast (A, D, G) epi-fluorescentie (B, E, H) en contact mode met de atomic force microscoop (C, F, I) op t = 0 (A, B, C ), t = 15 (D, E, F) en t = 30 (G, H, I). De witte pijlen in de tl-beelden (B, E, H) de aandacht vestigen focal adhesion structuren die niet lijken te veranderen in de loop van de scans. Interessant is dat in vergelijking met de actine structuur in het AFM beelden, de focal verklevingen niet lijkt te veranderen, terwijl er een duidelijke afstemming van het actine vezels langs het lichaam van de cel. In het oorspronkelijke beeld een netwerk is zichtbaar in de submembranous cytoskelet. Met elke opeenvolgende imago van de cytoskelet vezels worden meer afgestemd (zwarte pijlen) en het cellichaam hoger. Daarnaast zijn er vele kleine, flexibele en zeer dynamische uitsteeksels op de vlakke gebieden van de cel (omcirkeld in het zwart). Uit deze beelden de ondergrond cytoskelet lijkt aanzienlijk dynamischer over deze tijdschaal dan de focale adhesies op het grensvlak tussen de cel en de ondersteuning. Terwijl hier slechts een fluorofoor wordt gebruikt, duidelijk de fluorescentie microscopie kan worden uitgebreid tot meerdere fluorescentie kanalen behoren. De laser in de JPK Nanowizard ® is van een golflengte dan het zichtbare spectrum zodanig dat rode kanaal fluorescentie niet wordt verstoord door de aanwezigheid van de AFM laser. Bij kleinere maten scan, kan de mate van dynamiek op het celoppervlak meer duidelijk te zien. Twee opeenvolgende beelden van het celoppervlak worden gepresenteerd in figuur 4 als drie dimensionale projecties van de topografische gegevens. De twee beelden werden achtereenvolgens genomen, 15 minuten na elkaar. De grote cytoskelet structuren op de top van beide beelden op elkaar lijken, heeft echter een groot deel van de rest van de structuur veranderd tussen de beelden. Een flexibele nok (zwarte pijl) te zien in de eerste afbeelding is verdwenen in de tweede. Fijnere ondergrond structuur kan ook worden gezien om wijzigingen aanzienlijk tussen de twee beelden te hebben.  Figuur 4. Opeenvolgende topografische afbeeldingen van hetzelfde gebied van het celoppervlak. In beide gevallen wordt de scan is 5 x 5 urn en de z-range 000-200 nm. Conclusie De AFM kan worden gebruikt om de afbeelding levende cellen op een ongekende resolutie en op een tijdschaal die geschikt is voor de aanpak van een aantal biologische processen. Het ontwerp van de JPK Nanowizard ® maakt multidimensionale microscopie combineren AFM met optische beeldvormende technieken. Een dergelijke setup kan worden gebruikt om tegelijkertijd te onderzoeken,, gebeurtenissen die plaatsvinden in verschillende regio's van de cel. Als alternatief zou informatie die verkregen wordt uit de verschillende contrast methoden worden gebruikt om informatie over de structuur-functie relaties te genereren. Terwijl de AFM kan interessante en unieke informatie over de cellen te genereren als een stand-alone beeldvormende techniek, de integratie van de JPK Nanowizard ® in een volledig functionele, omgekeerde lichtmicroscoop breidt de mogelijkheden voor AFM voor cell imaging. |