De Multidimensionele Microscopie op Levende Cellen die de AtoomMicroscoop van de Kracht Nanowizard van Instrumenten JPK Gebruiken

Besproken Onderwerpen

Achtergrond

De Analyse van de Spectroscopie van de Kracht

De Technieken van de Microscopie

De Multidimensionele Microscopie

Experimentele Opstelling

Het Leven de Beelden van de Cel

Conclusie

Achtergrond

Een aan de gang zijnde tendens in wetenschappelijk onderzoek is de ontwikkeling van technieken die veelvoudige componenten van een systeem in één enkele tijd kan richten. De microarray analyse van DNA verstrekt een onverwacht die schot van de reeks genen binnen een cel op een gegeven moment wordt uitgedrukt. De Multidimensionele eiwitidentificatietechnologie wordt ontwikkeld om de inhoud van heterogeene steekproeven van proteïnen te bepalen.

De Analyse van de Spectroscopie van de Kracht

De de spectroscopieanalyse van de Kracht kan de ingewikkeldheid van celadhesie richten door tussen de bijdrage onderscheid te maken van individuele elementen tot het bindende proces. De Vorderingen in de microscopietechnieken en steekproefvoorbereidingen breiden dit type van benadering met meerdere componenten van de weergave van cellen uit.

De Technieken van de Microscopie

De informatie over cellulaire structuur wordt geproduceerd en de functie die diverse de microscopietechnieken gebruiken zullen verschillen afhankelijk van hoe het contrast dat wordt geproduceerd. Door technieken te combineren, kan de informatie over verschillende eigenschappen van de één steekproef gelijktijdig worden gecontroleerd. De JPK Nanowizard® atoomkrachtmicroscoop wordt ontworpen om op een omgekeerde lichte microscoop worden geïnstalleerd, toelatend gelijktijdige weergave van een steekproef door de atoomkrachtmicroscopie (AFM) en diverse optische de microscopietechnieken van fase stel aan epi-flourescence, de totale interne microscopie en (TIRF) de laser die van de bezinningsfluorescentie confocal microscopie (CLSM) aftasten tegenover elkaar om enkelen te noemen. Deze combinatie AFM en andere de microscopiemethodes, is hoofdzakelijk tot zover gebruikt voor de studies van de structuurfunctie. Nochtans, kan JPK Nanowizard® worden gebruikt om superieure beelden van levende cellen, gelijktijdig met extra microscopische technieken (figuur 1) te verkrijgen. Dit maakt tot JPK Nanowizard® een krachtig en veelzijdig hulpmiddel voor multidimensionele de microscopiestudies.

De Multidimensionele Microscopie

De Multidimensionele microscopie verwijst naar de generatie van veelvoudige beelden van verschillende eigenschappen van een steekproef in tijd. Als voorbeeld, is de multidimensionele microscopie gebruikt aan groot effect in de studie van de samenstelling en de dynamica van brandpuntsadhesiestructuren.

Figuur 1.

In dit geval, werden de veelvoudige fluorescente kanalen gebruikt om de componenten van brandpuntsadhesie en hun distributie met betrekking tot elkaar en aan actin binnen de cel te kenmerken. De Vooruitgang in de beschikbare fluorophores en technieken van de steekproefvoorbereiding betekent dat de veelvoudige kanaalfluorescentie op zowel het leven als vaste cellen kan worden geleid.

Deze gelijktijdige weergave van veelvoudige fluorescente kanalen produceert informatie over de localisatie van veelvoudige componenten in de cel, nochtans zou zulk een benadering verder kunnen worden uitgebreid door AFM met de fluorescentiemicroscopie en de microscopie van het fasecontrast te combineren. Op zulk een manier, niet alleen kan één de plaats van bijzondere proteïnen maar ook de dynamica van oppervlaktestructuren en subsurface cytoskeleton naast de algemene celmorfologie onderzoeken, gelijktijdig. Hier hebben wij imaged cellen REF52 die, paxillin-GFP, met fasecontrast, epi-fluorescentie en AFM uitdrukken.

Experimentele Opstelling

om veelvoudige de microscopiebeelden op levende cellen te verwerven, werden de cellen gekweekt op coverslips, die toen in JPK Biocell™ voor weergave werden opgezet. Biocell™ (figuur 2) wordt ontworpen om aanwinst van gelijktijdige optisch en beelden te optimaliseren AFM, terwijl het handhaven van een milieu weerspiegelend van fysiologische voorwaarden.

Figuur 2.

Biocell wordt ontworpen om optimale weergavevoorwaarden voor zowel AFM als optische methodes toe te laten terwijl snelle en nauwkeurige temperatuurcontrole van 20-60°C. toesta.

De cellen waren imaged bij 37°C in media die HEPES bevatten. JPK Nanowizard® werd geïnstalleerd op een omgekeerde lichte microscoop van Zeiss Axiovert 200M. De Cellen waren imaged in lage kracht de constante contactwijze, met flexibel, cantilever unsharpened. Aan het begin van elk aftasten een van de fasecontrast en fluorescentie werden de beelden verkregen.

Het Leven de Beelden van de Cel

Zoals, in figuur 1 kan hierboven worden gezien, kan de weergave van de contactwijze AFM worden gebruikt om overzichtsbeelden van een gehele cel te verkrijgen, of kan worden in werking gesteld gebruikend kleine aftastengrootte om oppervlaktestructuren voorbij de resolutie van de conventionele lichte microscopie op te lossen. Terwijl de resolutie en het signaal aan lawaairantsoen van AFM belangrijke voordelen van deze weergavetechniek zijn produceerde de informatie in beelden van grotere aftastengrootte kan ook aan andere weergavetechnieken nuttig, en complementair zijn. De weergave AFM is een mechanisch die proces, op de interactie van de zeer flexibele sonde AFM met de oppervlakte wordt gebaseerd. Derhalve is de geproduceerde informatie structureel en mechanisch. Bovendien, is AFM een oppervlaktetechniek, zodat worden de beelden AFM „geconcentreerd“ op de oppervlakte van de cel en de mechanische structuren, zoals actin cytoskeleton, die aan het ten grondslag liggen.

De combinatie van weergave de oppervlakte die AFM gebruiken en fluorescentieweergave van brandpuntsadhesie staat de onderzoeker toe om de dynamica van brandpuntsadhesiestructuren bij de basis van de cel met de actin structuren aan de oppervlakte van de cel te vergelijken. De extra beelden van het fasecontrast geven de algemene morfologie van de indrukcel en kunnen helpen die te bepalen of de structuren aan de celoppervlakte aan blaasjes toe te schrijven zijn worden waargenomen die duidelijk in het beeld van het fasecontrast worden gevisualiseerd. Als dusdanig, worden de beelden van dynamica geproduceerd die bij de basis, in het lichaam en aan de oppervlakte van de cel gebeuren.

In figuur 3 wordt een reeks beelden voorgesteld - die elke rij toont van het van fasecontrast, epifluorescence en contact het signaalbeelden van de wijzefout met 15 minieme intervallen worden genomen. De cellen waren dicht op coverslip, om celmotiliteit te remmen, dusdanig dat de kleinschaliger beweging zou kunnen worden onderzocht. De Grotere die veranderingen in celstructuur kunnen in de beelden van het fasecontrast (in A, D, G worden omcirkeld) worden gezien. De Blaasjes binnen de cel kunnen worden gezien posities bewogen te hebben. Een vergelijking van de drie epi-fluorescente beelden van GFP-Geëtiketteerde paxillin toont weinig verandering tussen elk beeld.

Figuur 3.

De witte pijlen in de fluorescente beelden (B, E, H) benadrukken brandpuntsadhesiestructuren die niet om over de cursus van het aftasten schijnen te veranderen. Interessant, wanneer vergeleken bij de actin structuur in de beelden AFM, schijnt de brandpuntsadhesie niet te veranderen, terwijl er een verschillende groepering van de actin vezels langs het lichaam van de cel is. In het originele beeld is een netwerk zichtbaar in submembranous cytoskeleton. Met elk opeenvolgend beeld worden de cytoskeletal vezels meer gericht (zwarte pijlen) en het hogere cellichaam. Bovendien zijn er vele kleine, flexibele, hoogst dynamische uitsteeksels op de vlakke die gebieden van de cel (in zwarte wordt omcirkeld). Van deze beelden subsurface schijnt cytoskeleton aanzienlijk dynamischer te zijn over deze tijdschaal dan de brandpuntsadhesie bij de interface tussen de cel en de steun.

Terwijl hier slechts fluorophore één wordt gebruikt, duidelijk zou de fluorescentiemicroscopie kunnen worden uitgebreid om veelvoudige fluorescentiekanalen te omvatten. De laser in JPK Nanowizard® is van een golflengte voorbij het zichtbare spectrum dusdanig dat de rode kanaalfluorescentie niet door de aanwezigheid van de laser AFM wordt onderbroken.

Bij kleinere aftastengrootte, kan de graad van dynamisme aan de celoppervlakte duidelijker worden gezien. Twee opeenvolgende beelden van de celoppervlakte worden voorgesteld in figuur 4 als driedimensionele projecties van topografische gegevens. De twee beelden werden apart opeenvolgend genomen, 15 minuten. De grote cytoskeletal structuren bij de bovenkant van beide beelden zijn gelijkaardig, nochtans is veel van de rest van de structuur tussen beelden veranderd. Een flexibele rand (zwarte die pijl) in het eerste beeld wordt is gezien in de tweede verdwenen. De Fijnere sub-surface structuur kan ook worden gezien veranderingen hebben aanzienlijk tussen de twee beelden.

Figuur 4.

Conclusie

AFM kan aan beeld levende cellen bij een ongekende resolutie en op een tijdschaal worden gebruikt die geschikt is om een aantal biologische processen te richten.

Het ontwerp van JPK Nanowizard® laat de multidimensionele microscopie toe die AFM combineren met optische weergavetechnieken.

Zulk een opstelling kan worden gebruikt om, gelijktijdig, gebeurtenissen te onderzoeken die in verschillende gebieden van de cel voorkomen. Alternatief, zou de informatie van de verschillende contrastmethodes kunnen wordt verzameld worden gebruikt om informatie te produceren over structuur-functie verhoudingen die. Terwijl AFM interessante en unieke informatie over cellen als stand-alone weergavetechniek kan produceren, de integratie van JPK Nanowizard® in a volledig - de functionele, omgekeerde lichte microscoop breidt het potentieel voor AFM voor celweergave uit.

Bron: Instrumenten JPK

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Instrumenten JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:43

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit