En pågående trend i forskning er utvikling av teknikker som kan ta flere komponenter i et system på én gang. DNA microarray analysen gir et blunk skudd av settet av gener uttrykt i en celle på et gitt tidspunkt. Flerdimensjonale protein identifikasjon teknologi blir utviklet for å fastslå innholdet av heterogene prøver av proteiner. Force Spektroskopi Analysis Force spektroskopi analyse kan håndtere kompleksiteten i celle adhesjon ved å skille mellom bidrag individuelle elementer til bindende prosessen. Fremskritt i mikroskopi teknikker og prøve preparater er å utvide denne type multi-komponent tilnærming til avbildning av celler. Mikroskopi Techniques Opplysningene genereres om cellestruktur og funksjon ved hjelp av ulike mikroskopi teknikker vil variere avhengig av hvordan kontrasten er generert. Ved å kombinere teknikker, kan opplysninger om forskjellige egenskaper av én prøve overvåkes samtidig. Den JPK Nanowizard ® atomic force mikroskop er designet for å være installert på en invertert lys mikroskop, slik at samtidig avbildning av en prøve med atomic force mikroskopi (AFM) og ulike optisk mikroskopi teknikker fra fase kontrast til epi-flourescence, (total intern refleksjon fluorescens TIRF ) mikroskopi og laser scanning konfokalmikroskopi (CLSM) for å nevne noen. Denne kombinasjonen av AFM og andre mikroskopi metoder har, så langt, i hovedsak vært benyttet for struktur-funksjon studier. Men JPK Nanowizard kan ® brukes til å oppnå bedre bilder av levende celler, samtidig med ekstra mikroskopiske teknikker (figur 1). Dette gjør JPK Nanowizard ® et kraftig og allsidig verktøy for flerdimensjonale mikroskopi studier. Multidimensional Mikroskopi Flerdimensjonale mikroskopi refererer til generasjonen av flere bilder av forskjellige egenskaper av en prøve over tid. Som et eksempel har flerdimensjonale mikroskopi blitt brukt til stor effekt i studiet av sammensetning og dynamikk fokal vedheft strukturer.  Figur 1. Suksessive feil signal bilder av en levende celle ved gradvis mindre scan størrelser. Alle bilder er tatt i lav kraft, konstant kontakt mode I dette tilfellet ble flere fluorescerende kanaler som brukes for å karakterisere komponenter i brennvidde sammenvoksninger og deres fordeling i forhold til hverandre og til aktin i cellen. Fremskritt innen tilgjengelig fluorophores og prøveopparbeidelse teknikker bety at flere kanalen fluorescens kan bli gjennomført på både levende og faste celler. Denne samtidige avbildning av flere fluorescerende kanaler genererer informasjon om lokalisering av flere komponenter i cellen, men en slik tilnærming kan forlenges ytterligere ved å kombinere AFM med fluorescens mikroskopi og fase kontrast mikroskopi. I en slik måte, kan ikke bare ett undersøke plasseringen av bestemte proteiner, men også dynamikken i overflatestrukturer og undergrunnen cytoskjelettet i tillegg til den generelle celle morfologi, samtidig. Her har vi fotografert REF52 celler, uttrykker paxillin-GFP, med fasekontrast, epi-fluorescens og AFM. Eksperimentell Setup For å få flere mikroskopi bilder på levende celler, ble cellene dyrket på Dekkglass, som ble deretter montert inn i JPK Biocell ™ for imaging. Den Biocell ™ (figur 2) er utformet for å optimalisere oppkjøp av samtidige optiske og AFM bilder, og samtidig opprettholde et miljø som gjenspeiler fysiologiske forhold.  Figur 2. Den JPK Biocell ™ Den Biocell er konstruert for å muliggjøre optimal bildebehandling forhold både for AFM og optiske metoder, mens tillater rask og presis temperaturregulering 20-60 ° C. Cellene ble fotografert ved 37 ° C i media som inneholder HEPES. Den JPK Nanowizard ® ble installert på en Zeiss Axiovert 200M invertert lysmikroskop. Celler ble fotografert i lav kraft konstant kontakt modus, med en fleksibel, unsharpened cantilever. Ved begynnelsen av hver skanning en fase kontrast og fluorescens bildene ble innhentet. Levende celle bilder Som det fremgår ovenfor, i figur 1, kan ta kontakt mode AFM bildeteknologi brukes til å skaffe oversikt bilder av en hel celle, eller kan brukes med liten scan størrelser for å løse overflatestrukturer utover oppløsningen av konvensjonell lysmikroskopi. Mens oppløsning og signal til støy rasjon av AFM er store fordeler med denne avbildningsteknikk opplysningene genereres i bilder av større scan størrelser kan også være nyttig, og komplementære til andre imaging teknikker. AFM imaging er en mekanisk prosess, basert på samspillet av de svært fleksible AFM probe med overflaten. Derfor er informasjonen genereres strukturelle og mekaniske. I tillegg er AFM en overflate teknikk, så AFM bildene er "fokusert" på overflaten av cellen, og den mekaniske strukturer, slik som aktin cytoskjelettet, som ligger bak det. Kombinasjonen av imaging overflaten ved hjelp av AFM og fluorescens avbildning av fokal sammenvoksninger lar etterforsker for å sammenligne dynamikken i fokale vedheft strukturer på bunnen av cellen med aktin strukturer på overflaten av cellen. Den ekstra fasekontrast bilder gir et helhetlig inntrykk celle morfologi og kan bidra til å avgjøre om strukturer observert på celleoverflaten skyldes vesikler som er tydelig visualisert i fase kontrast bildet. Som sådan, er bilder genereres av dynamikken skjer ved basen, i kroppen og på overflaten av cellen. I figur 3 en serie med bilder blir presentert - hver rad viser fasekontrast, epifluorescence og kontakt mode feil signal bilder tatt med 15 minutters intervaller. Cellene var tett på dekkglass, å hemme celle motilitet, slik at mindre skala bevegelsen kan bli undersøkt. Større endringer i cellestrukturen kan sees i fasekontrast bilder (innringet i A, D, G). Blemmer i cellen kan sees å ha flyttet posisjoner. En sammenligning av de tre epi-fluorescerende bilder av GFP-merket paxillin viser liten endring mellom hvert bilde.  Figur 3. Flere kanal time-lapse bilder av REF52 fibroblast celler. Levende fibroblast celler ble fotografert i fasekontrast (A, D, G) epi-fluorescens (B, E, H) og kontakt modus med atomic force mikroskop (C, F, I) ved t = 0 (A, B, C ), t = 15 (D, E, F) og t = 30 (G, H, I). De hvite pilene i den fluorescerende bilder (B, E, H) utheve fokale vedheft strukturer som ikke synes å endre seg i løpet av skanner. Interessant, i forhold til aktin strukturen i AFM bildene, gjør fokal adhesions ikke ut til å endre, mens det er en distinkt justering av aktin fiber langs kroppen av cellen. I det opprinnelige bildet et nettverk er synlig i submembranous cytoskjelettet. Med hver påfølgende bilde de cytoskeletal fibrene blir mer på linje (svarte piler) og cellen kroppen høyere. I tillegg er det mange små, fleksible og svært dynamisk fremspring på de flate områdene av cellen (innringet i svart). Fra disse bildene undergrunnen cytoskjelettet synes å være betydelig mer dynamisk over denne gangen skala enn den fokale sammenvoksninger i grenseflaten mellom cellen og støtte. Mens her bare ett fluoroforen brukes, åpenbart fluorescens mikroskopi kan utvides til å omfatte flere fluorescens kanaler. Laseren i JPK Nanowizard ® er en bølgelengde utenfor det synlige spekteret, slik at rød sone fluorescens ikke blir forstyrret av tilstedeværelsen av AFM laser. På mindre scan størrelser, kan graden av dynamikk på celleoverflaten bli mer tydelig. To påfølgende bilder av celleoverflaten er presentert i figur 4 som tredimensjonale projeksjoner av topografiske data. De to bildene ble tatt suksessivt, 15 minutters mellomrom. Den store cytoskeletal strukturer på toppen av begge bildene er like, har imidlertid mye av resten av strukturen endres mellom bilder. En fleksibel rygg (svart pil) sett i det første bildet har forsvunnet i det andre. Finere sub-overflatestruktur kan også ses å ha endringer betydelige mellom de to bildene.  Figur 4. Suksessive topografisk bilder av den samme regionen celleoverflaten. I begge tilfeller skannestørrelse er 5 x 5 mikrometer og z-serien 000-200 nm. Konklusjon AFM kan brukes til å avbilde levende celler på enestående oppløsning og på en tidsskala som er egnet til å adressere en rekke biologiske prosesser. Utformingen av JPK Nanowizard ® muliggjør flerdimensjonale mikroskopi kombinere AFM med optisk imaging teknikker. Et slikt oppsett kan brukes til å undersøke, samtidig hendelser i ulike regioner av cellen. Alternativt kan informasjon hentet fra de ulike kontrast metoder brukes til å generere informasjon om struktur-funksjon relasjoner. Mens AFM kan generere interessant og unik informasjon om celler som en stand-alone avbildningsteknikk, integrering av JPK Nanowizard ® til en fullt funksjonell, invertert lysmikroskop utvider potensialet for AFM for cell imaging. |