Uma tendência em curso na pesquisa científica é o desenvolvimento de técnicas que podem endereço de múltiplos componentes de um sistema de uma única vez. DNA microarray análise fornece um snap shot do conjunto de genes expressos em uma célula em um determinado momento. Multidimensional tecnologia de identificação de proteínas está sendo desenvolvido para determinar o conteúdo de amostras heterogêneo de proteínas. Força Análise de Espectroscopia A análise das forças espectroscopia pode lidar com a complexidade da adesão celular ao distinguir entre a contribuição dos elementos individuais para o processo de ligação. Avanços em técnicas de microscopia e preparações de amostra estão estendendo este tipo de abordagem multi-componente para a criação de imagens de células. Técnicas de microscopia As informações geradas sobre a estrutura celular e função utilizando técnicas de microscopia várias será diferente dependendo de como o contraste é gerado. Através da combinação de técnicas, informações sobre diferentes propriedades da amostra pode ser monitorados simultaneamente. O JPK NanoWizard ® microscópio de força atômica é projetado para ser instalado em um microscópio de luz invertida, permitindo gravação simultânea de uma amostra por microscopia de força atômica (AFM) e várias técnicas de microscopia óptica de contraste de fase para epi-Fluorescência, fluorescência de reflexão interna total (TIRF ) e microscopia de varredura a laser microscopia confocal (CLSM) para citar alguns. Esta combinação de AFM e os métodos de microscopia de outro tem, até agora, sido principalmente utilizado para estudos da função estrutura. No entanto, o JPK NanoWizard ® pode ser usado para obter imagens de qualidade superior de células vivas, em simultâneo com outras técnicas microscópicas (figura 1). Isso torna o JPK NanoWizard ® uma ferramenta poderosa e versátil para estudos de microscopia multidimensional. Microscopia multidimensional Microscopia multidimensional se refere à geração de imagens múltiplas de diferentes propriedades de uma amostra ao longo do tempo. Como exemplo, microscopia multidimensional tem sido usada com grande efeito no estudo da composição e dinâmica de estruturas de adesão focal.  Figura 1. Imagens sucessivas do sinal de erro de uma célula viva em tamanhos cada vez menores scan. Todas as imagens tiradas em vigor baixa, de modo constante contato Neste caso, múltiplos canais fluorescentes foram usados para caracterizar os componentes de adesões focais e sua distribuição em relação uns aos outros e à actina dentro da célula. Avanços na fluoróforos disponíveis e técnicas de preparação de amostra significa que fluorescence múltiplos canais podem ser realizadas em ambas as células vivas e fixas. Esta gravação simultânea de múltiplos canais fluorescentes gera informações sobre a localização de vários componentes da célula, no entanto essa abordagem pode ser estendida pela combinação de AFM com microscopia de fluorescência e microscopia de contraste de fase. De tal forma, não só se pode investigar a localização de proteínas específicas, mas também a dinâmica de estruturas de superfície e subsuperfície do citoesqueleto, além da morfologia das células em geral, simultaneamente. Aqui temos imaged REF52 células, expressando paxillin-GFP, com contraste de fase, epi-fluorescência e AFM. Instalação Experimental Para adquirir imagens de microscopia múltiplas em células vivas, as células foram cultivadas em lamínulas, que foram, então, montado dentro da JPK Biocell ™ para imagens. O Biocell ™ (figura 2) é projetado para otimizar a aquisição de imagens simultâneas óptica e AFM, mantendo um ambiente reflexivo das condições fisiológicas.  Figura 2. Biocell O JPK ™ O Biocell é projetado para permitir condições de imagem ideal para ambos AFM e métodos óticos, enquanto permitem o controle de temperatura rápidas e precisas 20-60 ° C. As células foram fotografadas a 37 ° C em meios contendo HEPES. O JPK NanoWizard ® foi instalado em um microscópio de luz Zeiss Axiovert 200M invertido. As células foram fotografadas em modo de baixa força de contato constante, com um cantilever flexível unsharpened. No início de cada digitalizar um contraste de fase e as imagens de fluorescência foram obtidos. Imagens vivendo celular Como pode ser visto acima, na figura 1, entre em contato modo AFM pode ser usado para obter imagens de síntese de uma célula inteira, ou pode ser operado usando tamanhos pequeno scan para resolver estruturas de superfície além da resolução da microscopia de luz convencional. Enquanto a resolução e sinal para ruído de ração AFM são as principais vantagens desta técnica de imagem, a informação gerada em imagens de tamanhos maiores scan também pode ser útil, e complementar à outras técnicas de imagem. AFM é um processo mecânico, baseado na interação da sonda AFM muito flexível com a superfície. Consequentemente, a informação gerada é estrutural e mecânica. Além disso, AFM é uma técnica de superfície, para que as imagens AFM são "focado" na superfície da célula e as estruturas mecânicas, tais como o citoesqueleto de actina, que a fundamentam. A combinação de imagens da superfície usando AFM e fluorescência de imagem de aderências focal permite ao pesquisador a comparar a dinâmica de estruturas de adesão focal na base da célula com as estruturas de actina na superfície da célula. As imagens de contraste de fase adicional dar uma impressão geral a morfologia das células e pode ajudar a determinar se as estruturas observadas na superfície da célula são devidos a vesículas que são claramente visualizado na imagem de contraste de fase. Como tal, as imagens são geradas de dinâmicas acontecendo na base, no corpo e na superfície da célula. Na figura 3 uma série de imagens é apresentada - cada linha mostra contraste de fase de epifluorescência, e entre em contato modo de imagens de erro do sinal tomada em intervalos de 15 minutos. As células foram densa na lamela, para inibir a motilidade celular, de modo que o movimento menor escala puderam ser investigadas. Mudanças maiores na estrutura celular pode ser visto nas imagens de contraste de fase (circulado em A, D, G). Vesículas dentro da célula pode ser visto como tendo posições mudaram. A comparação dos três epi-fluorescente imagens de GFP-rotulados paxillin mostram pouca mudança entre cada imagem.  Figura 3. Múltiplos canais de lapso de tempo imagens de REF52 fibroblastos. Células de fibroblastos vivos foram fotografadas em contraste de fase (A, D, G) epi-fluorescência (B, E, H) e entre em contato com o modo de microscópio de força atômica (C, F, I) em t = 0 (A, B, C ), t = 15 (D, E, F) e t = 30 (G, H, I). As setas brancas nas imagens fluorescentes (B, E, H) destacam estruturas de adesão focal que não parecem mudar ao longo das varreduras. Curiosamente, quando comparado com a estrutura de actina nas imagens AFM, as adesões focais parecem não mudar, enquanto há um alinhamento diferente das fibras de actina ao longo do corpo da célula. Na imagem original de uma rede é visível no citoesqueleto submembranas. Com cada imagem sucessiva as fibras do citoesqueleto se tornam mais alinhados (setas pretas) e o corpo da célula superior. Além disso, existem muitas pequenas, flexível, altamente dinâmica saliências sobre as áreas planas da célula (circulado em preto). A partir dessas imagens o citoesqueleto subsuperfície parece ser bastante mais dinâmica sobre esta escala de tempo do que as adesões focal na interface entre a célula eo apoio. Enquanto aqui apenas um fluoróforo é usado, obviamente, a microscopia de fluorescência pode ser estendido para incluir múltiplos canais de fluorescência. O laser na JPK NanoWizard ® é de um comprimento de onda além do espectro visível de tal forma que fluorescence canal vermelho não é interrompido pela presença do laser AFM. Em tamanhos menores de digitalização, o grau de dinamismo na superfície da célula pode ser visto mais claramente. Duas imagens sucessivas da superfície celular são apresentados na figura 4 como três projeções dimensional de dados topográficos. As duas imagens foram tiradas sucessivamente, a 15 minutos de intervalo. Grandes estruturas do citoesqueleto no topo de ambas as imagens são semelhantes, porém grande parte do resto da estrutura mudou entre as imagens. Um cume flexível (seta preta) visto na primeira imagem desapareceu na segunda. Estrutura mais fina sub-superfície também pode ser visto ter mudanças consideráveis entre as duas imagens.  Figura 4. Sucessivas imagens topográficas da mesma região da superfície da célula. Em ambos os casos o tamanho da digitalização é de 5 x 5 mm eo intervalo z 000-200 nm. Conclusão O AFM pode ser usado para as células vivas de imagem com uma resolução sem precedentes e numa escala de tempo que é adequado para tratar uma série de processos biológicos. O design do JPK NanoWizard ® permite microscopia AFM multidimensional combinando com técnicas de imagem óptica. Tal configuração pode ser usado para investigar, simultaneamente, eventos que ocorrem em diferentes regiões da célula. Alternativamente, as informações obtidas pelo métodos de contraste diferente poderia ser usado para gerar informações sobre a estrutura-função relacionamentos. Enquanto AFM pode gerar informação interessante e original sobre células como uma técnica de imagem stand-alone, a integração do JPK NanoWizard ® em um completamente funcional, microscópio de luz invertida amplia o potencial de AFM para imagens de células. |