Microscopia Multidimensional em Pilhas Vivas Usando o Microscópio Atômico da Força de Nanowizard dos Instrumentos de JPK

Assuntos Cobertos

Fundo

Análise da Espectroscopia da Força

Técnicas da Microscopia

Microscopia Multidimensional

Instalação Experimental

Imagens da Pilha Viva

Conclusão

Fundo

Uma tendência em curso na investigação científica é a revelação das técnicas que podem endereçar componentes múltiplos de um sistema em uma única estadia. A análise do microarray do ADN fornece um tiro instantâneo do grupo de genes expressados dentro de uma pilha em um dado momento. A tecnologia Multidimensional da identificação da proteína está sendo desenvolvida para determinar os índices de amostras heterogêneas de proteínas.

Análise da Espectroscopia da Força

A análise da espectroscopia da Força pode endereçar a complexidade da adesão de pilha distinguindo entre a contribuição de elementos individuais ao processo obrigatório. Os Avanços em técnicas da microscopia e em preparações da amostra estão estendendo este tipo de aproximação do multi-componente à imagem lactente das pilhas.

Técnicas da Microscopia

A informação gerada sobre a estrutura celular e a função que usam várias técnicas da microscopia diferirá segundo como o contraste é gerado. Combinando técnicas, a informação sobre propriedades diferentes da uma amostra pode ser monitorada simultaneamente. O microscópio atômico da força de JPK Nanowizard® é projectado ser instalado em um fotomicroscópio invertido, permitindo a imagem lactente simultânea de uma amostra pela microscopia atômica da força (AFM) e as várias técnicas ópticas da microscopia da fase contrastam ao epi-flourescence, à microscopia de fluorescência total da reflexão (TIRF) interna e ao laser fazendo a varredura da microscopia confocal (CLSM) para nomear alguns. Esta combinação de AFM e outros métodos da microscopia, foram utilizados até aqui principalmente para estudos da função de estrutura. Contudo, o JPK Nanowizard® pode ser usado para obter imagens superiores de pilhas vivas, simultaneamente com técnicas microscópicas adicionais (figura 1). Isto faz ao JPK Nanowizard® uma ferramenta poderosa e versátil para estudos multidimensional da microscopia.

Microscopia Multidimensional

A microscopia Multidimensional refere a geração de imagens múltiplas de propriedades diferentes de uma amostra ao longo do tempo. Como um exemplo, a microscopia multidimensional foi usada ao grande efeito no estudo da composição e da dinâmica de estruturas focais da adesão.

Figura 1.

Neste caso, os canais fluorescentes múltiplos foram usados para caracterizar os componentes de adesões focais e de sua distribuição com relação a se e ao actínio dentro da pilha. Os Avanços em fluorophores e em técnicas disponíveis da preparação da amostra significam que a fluorescência do canal múltiplo pode ser conduzida em ambos que vivem e em pilhas fixadas.

Esta imagem lactente simultânea dos canais fluorescentes múltiplos gera a informação sobre a localização de componentes múltiplos na pilha, porém tal aproximação poderia mais ser estendida combinando o AFM com a microscopia do contraste da microscopia e da fase de fluorescência. Em tal maneira, não somente pode se investigar o lugar de proteínas particulares mas igualmente a dinâmica das estruturas de superfície e do cytoskeleton subsuperficial além do que a morfologia total da pilha, simultaneamente. Aqui nós temos as pilhas REF52 imaged, expressando o paxillin-GFP, com contraste da fase, epi-fluorescência e AFM.

Instalação Experimental

A fim adquirir imagens múltiplas da microscopia em pilhas vivas, as pilhas foram crescidas nas lamelas, que foram montadas então no JPK Biocell™ para a imagem lactente. O Biocell™ (figura 2) é projectado aperfeiçoar a aquisição de imagens simultâneas ópticas e do AFM, ao manter um ambiente reflexivo de circunstâncias fisiológicos.

Figura 2.

O Biocell está projectado permitir condições óptimas da imagem lactente para o AFM e métodos ópticos quando permita o controle de temperatura rápido e preciso de 20-60°C.

As pilhas eram imaged em 37°C nos media que contêm HEPES. O JPK Nanowizard® foi instalado em um Zeiss Axiovert que 200M inverteu o fotomicroscópio. As Pilhas eram imaged no baixo modo de contacto da constante de força, com um modilhão flexível, unsharpened. No início de cada varredura um contraste da fase e as imagens da fluorescência foram obtidos.

Imagens da Pilha Viva

Como pode ser considerada acima, em figura 1, a imagem lactente do AFM do modo de contacto pode ser usada para obter imagens da vista geral de uma pilha inteira, ou pode ser operada usando tamanhos pequenos da varredura para resolver as estruturas de superfície além da definição da fotomicroscopia convencional. Quando a definição e o sinal propalar a ração do AFM forem vantagens principais desta técnica de imagem lactente a informação gerada nas imagens de tamanhos maiores da varredura pode igualmente ser útil, e complementar a outras técnicas de imagem lactente. A imagem lactente do AFM é um processo mecânico, com base na interacção da ponta de prova muito flexível do AFM com a superfície. Conseqüentemente, a informação gerada é estrutural e mecânica. Adicionalmente, o AFM é uma técnica de superfície, assim que as imagens do AFM “são centradas” sobre a superfície da pilha e das estruturas mecânicas, tais como o cytoskeleton do actínio, que são a base d.

A combinação de imagem lactente a imagem lactente de utilização de superfície do AFM e da fluorescência de adesões focais permite que o investigador compare a dinâmica de estruturas focais da adesão na base da pilha com as estruturas do actínio na superfície da pilha. As imagens adicionais do contraste da fase dão uma morfologia total da pilha da impressão e podem ajudar a determinar se as estruturas observadas na superfície da pilha são devido às vesículas que são visualizadas claramente na imagem do contraste da fase. Como tal, as imagens são geradas da dinâmica que acontece na base, no corpo e na superfície da pilha.

Em figura 3 uma série de imagens é apresentada - cada fileira mostra o contraste da fase, o epifluorescence e as imagens do sinal do erro do modo de contacto tomadas em 15 intervalos minutos. As pilhas eram densas na lamela, inibir a mobilidade da pilha, tais que o movimento da escala menor poderia ser investigado. As mudanças Maiores na estrutura de pilha podem ser consideradas nas imagens do contraste da fase (circundadas em A, D, G). As Vesículas dentro da pilha podem ser vistas para ter movido posições. Uma comparação das três imagens epi-fluorescentes de poucas mudanças GFP-etiquetadas da mostra do paxillin entre cada imagem.

Figura 3.

As setas brancas nas imagens fluorescentes (B, E, H) estruturas focais da adesão do destaque que não parecem mudar no curso das varreduras. Interessante, quando comparadas à estrutura do actínio nas imagens do AFM, as adesões focais não parecem mudar, visto que há um alinhamento distinto das fibras do actínio ao longo do corpo da pilha. Na imagem original uma rede é visível no cytoskeleton submembranous. Com cada imagem sucessiva as fibras cytoskeletal tornam-se mais alinhadas (setas pretas) e o corpo de pilha mais altamente. Além, há muitas saliências pequenas, flexíveis, altamente dinâmicas nas áreas lisas da pilha (circundada no preto). Destas imagens o cytoskeleton subsuperficial parece ser consideravelmente mais dinâmico sobre esta escala de tempo do que as adesões focais na relação entre a pilha e o apoio.

Quando somente um fluoróforo for usado aqui, obviamente a microscopia de fluorescência poderia ser estendida para incluir os canais múltiplos da fluorescência. O laser no JPK Nanowizard® é de um comprimento de onda além do espectro visível tal que a fluorescência vermelha do canal não está interrompida pela presença do laser do AFM.

Em tamanhos menores da varredura, o grau de dinamismo na superfície da pilha pode mais claramente ser considerado. Duas imagens sucessivas da superfície da pilha são apresentadas em figura 4 como projecções tridimensionais de dados topográficos. As duas imagens foram tomadas sucessivamente, 15 minutos distante. As grandes estruturas cytoskeletal na parte superior de ambas as imagens são similares, porém muito do resto da estrutura mudou entre imagens. Um cume flexível (seta preta) visto na primeira imagem desapareceu no segunda. Uma estrutura subsuperficial Mais Fina pode igualmente ser considerada para ter as mudanças consideráveis entre as duas imagens.

Figura 4.

Conclusão

O AFM pode ser usado às pilhas vivas da imagem em definição inaudita e em uma escala de tempo que seja apropriada para endereçar um número de processos biológicos.

O projecto do JPK Nanowizard® permite a microscopia multidimensional que combina o AFM com as técnicas de imagem lactente ópticas.

Tal instalação pode ser usada para investigar, simultaneamente, os eventos que ocorrem em regiões diferentes da pilha. Alternativamente, a informação inferida dos métodos diferentes do contraste podia ser usada para gerar a informação em relacionamentos da estrutura-função. Quando o AFM puder gerar informação interessante e original sobre pilhas como uma técnica de imagem lactente autônoma, a integração do JPK Nanowizard® na inteiramente - o fotomicroscópio funcional, invertido estende o potencial para o AFM para a imagem lactente da pilha.

Source: Instrumentos de JPK

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos de JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:20

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