Многомерная Микроскопия на Живущих Клетках Используя Микроскоп Усилия Nanowizard Атомный от Аппаратур JPK

Покрытые Темы

Предпосылка

Анализ Спектроскопии Усилия

Методы Микроскопии

Многомерная Микроскопия

Экспириментально Настроение

Изображения Живущей Клетки

Заключение

Предпосылка

Продолжающийся тенденция в научном исследовании развитие методов которые могут адресовать множественные компоненты системы на одиночном времени. Анализ microarray ДНА обеспечивает щелчковую съемку комплекта генов выраженных внутри клетка в данное время. Многомерная технология идентификации протеина начинается для того чтобы определить содержание несродных образцов протеинов.

Анализ Спектроскопии Усилия

Анализ спектроскопии Усилия может адресовать сложность прилипания клетки путем различать между вкладом индивидуальных элементов к binding процессу. Выдвижения в методах микроскопии и подготовках образца удлиняют этот тип поликомпонентного подхода к воображению клеток.

Методы Микроскопии

Информация произведенная о сетчатой микроструктуре и функции используя различные методы микроскопии будет отличать в зависимости от как контраст произведен. Путем совмещать методы, информацию о различных свойствах одного образца можно контролировать одновременно. Микроскоп усилия JPK Nanowizard® атомный конструирован быть установленным на перевернутый светлый микроскоп, включающ одновременное воображение образца атомной микроскопией усилия (AFM) и различные оптически методы микроскопии от участка сравнивают к epi-flourescence, микроскопии флуоресцирования (TIRF) полного внутреннего отражения и лазеру просматривая confocal микроскопию (CLSM) для того чтобы назвать несколько. Это сочетание из AFM и другие методы микроскопии имеют, таким образом далеко, главным образом использовано для изучений функции структуры. Однако, JPK Nanowizard® можно использовать для того чтобы получить главные изображения живущих клеток, одновременно с дополнительными микроскопическими методами (диаграммой 1). Это делает JPK Nanowizard® мощный и разносторонний инструмент для многомерных изучений микроскопии.

Многомерная Микроскопия

Многомерная микроскопия ссылается к поколению множественных изображений различных свойств образца над временем. Как пример, многомерная микроскопия была использована к большому влиянию в изучении состава и динамики фокусных структур прилипания.

Диаграмма 1.

В этот случай, множественные дневные каналы были использованы для того чтобы характеризовать компоненты фокусных прилипаний и их распределения по отношению к одину другого и к актину внутри клетка. Выдвижения в доступные fluorophores и методы подготовки образца значат что флуоресцирование множественного канала можно дирижировать на обоих живя и исправленных клетках.

Это одновременное воображение множественных дневных каналов производит информацию о локализации множественных компонентов в клетке, тем ме менее такой подход смог более в дальнейшем быть расширен путем совмещать AFM с микроскопией контраста микроскопии и участка флуоресцирования. В таком образе, не только можно расследовать расположение определенных протеинов но также динамику поверхностных структур и близповерхностного цитоскелета в дополнение к общему словотолкованию клетки, одновременно. Здесь мы имеем imaged клетки REF52, выражая paxillin-GFP, с контрастом участка, epi-флуоресцированием и AFM.

Экспириментально Настроение

Приобрели множественные изображения микроскопии на живущих клетках, клетки рослись, что на coverslips, которые после этого были установлены в JPK Biocell™ для воображения. Biocell™ (диаграмма 2) конструирована для того чтобы оптимизировать прием одновременных изображений оптически и AFM, пока поддерживающ окружающую среду отражательную физиологопсихологических условий.

Диаграмма 2.

Biocell конструировано для того чтобы включить оптимальные условия воображения как для AFM, так и для оптически методов пока позвольте быстрому и точному контролю температуры от 20-60°C.

Клетки были imaged на 37°C в средствах содержа HEPES. JPK Nanowizard® было установлено на Zeiss Axiovert 200M перевернули светлый микроскоп. Клетки были imaged в низком режиме контакта коэффициента упругой связи, с гибким, unsharpened cantilever. В начале каждой развертки были получены контраст участка и изображения флуоресцирования.

Изображения Живущей Клетки

Как можно видеть над, в диаграмме 1, воображение AFM режима контакта можно использовать для того чтобы получить изображения обзора всей клетки, или может эксплуатироваться используя малые размеры развертки для того чтобы разрешить поверхностные структуры за разрешением обычной светлой микроскопии. Пока разрешение и сигнал зашуметь рацион AFM главные преимущества этого метода воображения информация произведенная в изображениях более больших размеров развертки может также быть полезна, и комплементарна к другим методам воображения. Воображение AFM механически процесс, основанный на взаимодействии очень гибкого зонда AFM с поверхностью. Следовательно, произведенная информация структурна и механически. Дополнительно, AFM поверхностный метод, поэтому изображения AFM «сфокусированы» на поверхности клетки и механически структур, как цитоскелет актина, которые кладут его в основу.

Воображение сочетание из поверхность используя AFM и воображение флуоресцирования фокусных прилипаний позволяют исследователю сравнить динамику фокусных структур прилипания на основании клетки с структурами актина на поверхности клетки. Дополнительные изображения контраста участка дают общее словотолкование клетки впечатления и могут помочь определить ли структуры наблюдаемые на поверхности клетки должны к vesicles которые ясно визуализированы в изображении контраста участка. Как таковой, изображения произведены динамики случаясь на основании, в теле и на поверхности клетки.

В диаграмме 3 серия изображений - каждый рядок показывает контраст участка, epifluorescence и изображения сигнала ошибки режима контакта принятые на 15 мельчайшие интервалы. Клетки были плотны на coverslip, для того чтобы заблокировать motility клетки, такие что движение более малого маштаба смогло быть расследовано. Более Большие изменения в структуре клетки можно увидеть в изображениях контраста участка (объезжанных в A, D, G). Vesicles внутри клетка можно увидеть, что двинули положения. Сравнение 3 epi-дневных изображений GFP-обозначенной выставки paxillin небольшое изменение между каждым изображением.

Диаграмма 3.

Белые стрелки в дневных изображениях (B, E, H) выделяют фокусные структуры прилипания которые не кажется, что изменяют над курсом разверток. Интересно, сравнивано к структуре актина в изображениях AFM, не кажется, что изменяют фокусные прилипания, тогда как определенное выравнивание волокон актина вдоль тела клетки. В первоначально изображении сеть видима в submembranous цитоскелете. С каждым последовательным изображением цитоскелетные волокна будут выравниватьле (черные стрелки) и тело клетки более высоко. В добавлении, много малых, гибких, сильно динамических выступаний на плоских зонах клетки (объезжанной в черноте). От этих изображений кажется, что будет близповерхностный цитоскелет значительно более динамическим над этим масштабом времени чем фокусные прилипания на интерфейсе между клеткой и поддержкой.

Пока здесь только одно fluorophore использовано, очевидно микроскопия флуоресцирования смогла быть расширена для того чтобы включить множественные каналы флуоресцирования. Лазер в JPK Nanowizard® длины волны за видимым спектром такое что красное флуоресцирование канала не нарушено присутсвием лазера AFM.

На более малых размерах развертки, степень динамизма на поверхности клетки можно ясно увидеть. 2 последовательных изображения поверхности клетки в диаграмме 4 как трехмерные проекции топографических данных. 2 изображения были приняты подряд, 15 минут врозь. Большие цитоскелетные структуры вверху оба изображения подобны, тем ме менее много из остальноев структуры изменяло между изображениями. Гибкая зига (черная стрелка) увиденная в первом изображении исчезала в втором. Более Точная близповерхностная структура можно также увидеть, что имела изменения значительные между 2 изображениями.

Диаграмма 4.

Заключение

AFM можно использовать к клеткам изображения живущим на беспрецедентном разрешении и на масштабе времени который соответствующ для адресовать несколько биологических процессов.

Конструкция JPK Nanowizard® включает многомерную микроскопию совмещая AFM с оптически методами воображения.

Такое настроение можно использовать для того чтобы расследовать, одновременно, случаи происходя в различных зонах клетки. Альтернативно, информация gleaned от различных методов контраста смогла быть использована для того чтобы произвести информацию на отношениях структур-функции. Пока AFM может произвести интересную и уникально информацию о клетках как отдельно стоящий метод воображения, внедрение JPK Nanowizard® в a полно - функциональный, перевернутый светлый микроскоп расширяет потенциал для AFM для воображения клетки.

Источник: Аппаратуры JPK

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Аппаратуры JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:23

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit