Multidimensional Microscopy på Bosatt Celler som Använder Nanowizard det Atom- StyrkaMikroskopet från JPK, Instrumenterar

Täckte Ämnen

Bakgrund

StyrkaSpektroskopiAnalys

MicroscopyTekniker

Multidimensional Microscopy

Experimentellt Ställa In

Den Bosatt Cellen Avbildar

Avslutning

Bakgrund

En pågående trend i vetenskaplig forskning är utvecklingen av tekniker som kan tilltala multipeldelar av ett system på en singeltid. DNA-microarrayanalys ger ett plötsligt som skjutas av uppsättningen av gener som uttrycks inom en cell på en given tid. Multidimensional proteinIDteknologi framkallas för att bestämma tillfredsställer av heterogent tar prov av proteiner.

StyrkaSpektroskopiAnalys

Styrkaspektroskopianalys kan tilltala komplexiteten av celladhesion, genom att skilja mellan bidraget av individbeståndsdelar till det processaa bandet. Befordringar i microscopytekniker och tar prov förberedelser fördjupa denna typ av mång--del- att närma sig till avbilda av celler.

MicroscopyTekniker

Informationen som frambrings om cell- strukturerar och fungerar genom att använda olika ska microscopytekniker skilja sig åt beroende av hur kontrast frambrings. Genom att kombinera tekniker, tar prov information om olik rekvisita av den kan övervakas samtidigt. Det atom- styrkamikroskopet för JPK Nanowizard® planläggs för att installeras på ett inverterat ljust mikroskop och att möjliggöra samtidigt avbilda av en ta prov av atom- styrkamicroscopy, (AFM) och olika optiska microscopytekniker från arrangerar gradvis kontrast till epien-flourescence, sammanlagd inre reflexionsfluorescence (TIRF)microscopy och laser som avläser confocal microscopy (CLSM) för att namnge några. Denna kombination av AFM och andra microscopymetoder har, således långt, främst använt för strukturera fungerar studier. Emellertid kan JPKEN Nanowizard® vara van vid erhåller överman avbildar av bosatt celler, samtidigt med extra mikroskopiska tekniker (figurera 1). Detta gör JPKEN Nanowizard® ett kraftigt och mångsidigt att bearbeta för multidimensional microscopystudier.

Multidimensional Microscopy

Multidimensional microscopy ser till utvecklingen av multipeln avbildar av olik rekvisita av en ta prov med tiden. Som ett exempel har multidimensional microscopy varit den van vid storen verkställer i studien av sammansättningen, och dynamik av fokal- adhesion strukturerar.

Figurera 1.

I detta fall kanaliserar den fluorescerande multipeln var van vid karakteriserar delarna av fokal- adhesions och deras fördelning sinsemellan och till actin inom cellen. Framflyttningar i tillgängliga fluorophores och tar prov förberedelseteknikmedel att multipeln kanaliserar fluorescence kan föras på både att bo och fixade celler.

Detta samtidiga avbilda av multipeln som är fluorescerande, kanaliserar frambringar information om localisationen av multipeldelar i cellen, however en sådan att närma sig kunde vidare fördjupas, genom att kombinera AFM med fluorescencemicroscopy och arrangera gradvis kontrastmicroscopy. I ett sådan sätt inte endast kan man utforska läget av särskilda proteiner, utan också ytbehandlar dynamiken av strukturerar och den under ytan cytoskeletonen förutom den total- cellmorfologin, samtidigt. Här har vi avbildat celler som REF52 uttrycker paxillin-GFP, med arrangerar gradvis kontrast, epi-fluorescence och AFM.

Experimentellt Ställa In

För att att få multipelmicroscopy avbildar på bosatt celler, cellerna var fullvuxet på coverslips, som monterades därefter in i JPKEN Biocell™ för att avbilda. Biocell™en (figurera 2), planläggs för att optimera förvärvet av samtidigt optiskt och AFM avbildar, stunder som underhåller en miljö som är reflekterande av fysiologiskt, villkorar.

Figurera 2.

Biocellen planläggs för att möjliggöra optimalt avbilda villkorar för både AFM, och optiska metodstunder låter foren och preciserar temperatur kontrollerar från 20-60°C.

Cellerna avbildades på 37°C i massmedia som innehåller HEPES. JPKEN Nanowizard® installerades på Zeiss Axiovert ett 200M inverterat ljust mikroskop. Celler avbildades i konstant kontaktfunktionsläge för låg styrka, med en böjlig unsharpened cantilever. På början av varje bildläsning avbildar en arrangera gradviskontrast och fluorescence erhölls.

Den Bosatt Cellen Avbildar

Figurera in 1, kan att avbilda för AFM för kontaktfunktionsläget vara van vid erhåller överblick avbildar av en hel cell eller kan fungeras genom att använda liten bildläsning storleksanpassar för att lösa ytbehandlar strukturerar det okända upplösningen av konventionell ljus microscopy, Som synes ovanför. Fördriva upplösningen och signalera för att stoja ransonerar av AFM är ha som huvudämne fördelar av denna avbilda teknik som informationen som in frambrings, avbildar av större bildläsning storleksanpassar kan också vara användbar, och kompletterande till andra avbilda tekniker. Att avbilda för AFM är ett mekaniskt processaa, baserat på växelverkan av den mycket böjliga AFM-sonden med ytbehandla. Därför är den frambragda informationen strukturell och mekanisk. Dessutom är AFM en ytbehandlateknik, så AFM avbildar ”fokuseras” på ytbehandla av cellen, och det mekaniskt strukturerar, liksom actincytoskeletonen, som underligger den.

Kombinationen av att avbilda ytbehandla genom att använda AFM och att avbilda för fluorescence av fokal- adhesions låter utredaren jämföra dynamiken av fokal- adhesion strukturerar på basera av cellen med actinen strukturerar på ytbehandla av cellen. De extra arrangerar gradvis kontrast avbildar ger en total- intryckcellmorfologi och kan hjälpa att bestämma huruvida strukturerar observerat på cellen ytbehandlar är tack vare vesicles som visualiseras klart i arrangera gradviskontrasten avbildar. Som sådan, avbildar frambrings av dynamik som händer på basera, i förkroppsliga och på ytbehandla av cellen.

I figurera 3 som en serie av avbildar framläggas - varje ror shows arrangerar gradvis kontrast, epifluorescence, och felet för kontaktfunktionsläget signalerar avbildar taget på 15 minimala mellanrum. Cellerna var täta på coverslipen, att förhindra cellmotilitet som var sådan att mindre fjällrörelse kunde utforskas. Större ändringar i cell strukturerar kan ses i arrangera gradviskontrasten avbildar (cirklat i A, D, G). Vesicles inom cellen kan ses för att ha rört placerar. En jämförelse av defluorescerande trena avbildar av GFP-märkt ändring för paxillinshow mellan varje avbildar lite.

Figurera 3.

Vitpilarna i de fluorescerande avbildar (B, E, H) viktig som fokal- adhesion strukturerar, som inte verkar för att ändra över jaga av bildläsningarna. Interestingly när du jämförs till actinen, strukturera i AFMEN avbildar, de fokal- adhesionsna verkar inte för att ändra, eftersom det finns en distinkt justering av actinfibrerna längs förkroppsliga av cellen. I original avbilda en knyta kontakt är synligt i den submembranous cytoskeletonen. Med varje som är på varandra följande, avbilda de cytoskeletal fibrerna blir mer arrangera i rak linje (svart pilar), och cellen förkroppsligar higher. I tillägg finns det många lilla, böjliga, högt dynamiska framstickanden på lägenhetområdena av cellen (som cirklas i svart). Från dessa avbildar den under ytan cytoskeletonen verkar för att vara betydligt mer dynamisk över detta tidfjäll än de fokal- adhesionsna på ha kontakt mellan cellen och servicen.

Stund här endast en som är fluorophore, används, självfallet fluorescencemicroscopyen kunde fördjupas för att inkludera multipelfluorescence kanaliserar. Laseren i JPKEN Nanowizard® är av en våglängddet okända den sådan synliga spectrumen att rött kanalisera fluorescence inte avbryts av närvaroen av AFM-laseren.

På mindre bildläsning storleksanpassar, graden av dynamism på cellen ytbehandlar kan klarare ses. På varandra följande Två avbildar av cellen ytbehandlar framläggas in figurerar 4 som tredimensionella projektioner av topographic data. Tvåna avbildar togs löpande, 15 noterar ifrån varandra. Det stora cytoskeletal strukturerar av båda avbildar upptill är liknande, however mycket av vila av strukturera har ändrat between avbildar. En böjlig kant (svart pil) som ses i första, avbildar har försvunnit i understödja. mer Fin under-ytbehandla strukturerar kan också ses för att ha ändringar som är betydliga mellan tvåna, avbildar.

Figurera 4.

Avslutning

AFMEN kan vara van vid avbildar bosatt celler på aldrig tidigare skådad upplösning, och på ett tidfjäll, som är passande för att tilltala ett nummer av biologiskt, bearbetar.

Designen av JPKEN Nanowizard® möjliggör multidimensional microscopy som kombinerar AFM med optiska avbilda tekniker.

En Sådan ställa in kan vara van vid utforskar, samtidigt, händelser som uppstår i olika regioner av cellen. Alternativt kunde information som plocka ax från de olika kontrastmetoderna, vara van vid frambringar information strukturera-fungerar på förhållanden. Stunder AFM kan frambringa intressant, och unik information om celler som en fristående avbilda teknik, integrationen av JPKEN Nanowizard® in i a fullständigt - det funktionella inverterade ljusa mikroskopet fördjupa det potentiellt för AFM för att avbilda för cell.

Källa: JPK Instrumenterar

För mer information på denna källa behaga besök JPK Instrumenterar

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:32

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit