在活細胞的多維顯微學使用從 JPK 儀器的 Nanowizard 基本強制顯微鏡

包括的事宜

背景

強制分光學分析

顯微學技術

多維顯微學

實驗設置

活細胞圖像

結論

背景

在科學研究的一個持續的趨勢是可能解決系統多個要素在一時光技術的發展。 脫氧核糖核酸微陣列分析提供套的短冷期射擊在細胞內到時表示的基因。 多維蛋白質確定技術被開發確定蛋白質異種範例目錄。

強制分光學分析

強制分光學分析可能通過區分解決細胞粘著的複雜在各自的要素的攤繳之間對這個綁定進程。 在顯微學技術和範例準備的推進對細胞想像擴大此種多成分的途徑。

顯微學技術

信息被生成關於蜂窩電話結構和功能使用多種顯微學技術根據對比如何將有所不同被生成。 通過結合技術,關於这一個範例的不同的屬性的信息可以同時被監控。 JPK Nanowizard® 基本強制顯微鏡在一個被倒置的光學顯微鏡被設計被安裝,啟用範例的同時想像由基本強制顯微學 (AFM),并且從階段的多種光學顯微學技術對比到 epi-flourescence、總內部反射 (TIRF)瀏覽共焦的顯微學 (CLSM) 的熒光顯微法和激光命名一些。 AFM 的此組合和其他顯微學方法為結構作用研究主要,至今,使用。 然而, JPK Nanowizard® 可以用於得到活細胞的優越圖像,同時與另外的微觀技術 (圖 1)。 這做 JPK Nanowizard® 為多維顯微學研究的一個強大和多才多藝的工具。

多維顯微學

多維顯微學隨著時間的推移是指範例的不同的屬性的多重圖像的生成。 为例,多維顯微學用於了不起的作用在焦點黏附力結構構成和動力的研究。

圖 1。

在這種情況下,多個螢光通道用於分析焦點黏附力和他們的配電器要素關於彼此和到在這個細胞內的肌動蛋白。 在可用的 fluorophores 和範例準備技術的預付款意味著多頻道熒光在居住的兩個和被修理的細胞可以執行。

多個螢光通道此同時想像生成關於多個要素的本地化的信息在細胞的,然而這樣途徑可能通過結合 AFM 進一步擴大與熒光顯微法和階段對比顯微學。 除整體細胞形態學之外,以這樣方式,可能一個人不僅調查特殊蛋白質的地點,而且表面結構和表層下細胞骨架動力,同時。 這裡我們有印象的 REF52 細胞,表示 paxillin-GFP,與階段對比、 epi 熒光和 AFM。

實驗設置

為了獲取在活細胞的多個顯微學圖像,細胞在蓋玻片增長,然後被掛接到想像的 JPK Biocell™Biocell™ (圖 2) 被設計優選同時光學和 AFM 圖像的購買,當維護環境反射性生理情況時。

圖 2。

當请允許從 20-60°C. 時的迅速和準確的溫度控制 Biocell 被設計啟用 AFM 和光學方法的最佳的想像條件。

細胞是印象的在包含 HEPES 的媒體的 37°C。 JPK Nanowizard® 在蔡司 200M 倒置光學顯微鏡的 Axiovert 被安裝了。 細胞是印象的在低力常數聯繫模式下,與一個靈活, unsharpened 懸臂。 在每掃描初階段對比和熒光圖像得到了。

活細胞圖像

在表 1 能被看到以上,聯繫模式 AFM 想像使用得到一個全部的細胞的概覽圖像或者可以被管理使用小的掃描範圍解決在常規光學顯微學的解決方法的之外表面結構。 當 AFM 的解決方法和針對噪音的信號定量是此成像技術時的主要好處在更大的掃描範圍的圖像生成的信息可能也是有用和補充的對其他成像技術。 AFM 想像是機械處理,根據非常靈活的 AFM 探測的交往與表面的。 結果,被生成的信息是結構上和機械的。 另外, AFM 是一個表面技術,因此 AFM 圖像 「集中」於細胞和機械結構的表面,例如肌動蛋白細胞骨架,強調它。

想像使用 AFM 的表面和焦點黏附力熒光想像的組合允許這位調查員比較焦點黏附力結構動力在這個細胞的基礎與肌動蛋白結構在這個細胞的表面。 另外的階段對比圖像產生整體印象細胞形態學,并且可能幫助確定結構被觀察在細胞表面是否歸結於在階段對比圖像明顯地形象化的泡。 同樣地,圖像發生在基礎,在機體和在細胞的表面的被生成動力。

在表 3 一系列的圖像存在 - 每行顯示階段對比、 epifluorescence 和聯繫模式錯誤信號圖像被採取在 15 個周詳間隔。 細胞是密集的在這塊蓋玻片,禁止細胞能動性,這樣膠小量移動可能調查。 在胞狀結構上的更大的變化能被看到在階段對比圖像 (盤旋在 A, D, G)。 在這個細胞內的泡能被看見移動了位置。 GFP 被標記的 paxillin 顯示的三個 epi 螢光圖像的比較在每個圖像之間的少量變化。

圖 3。

在螢光形象 (B, E 的空白箭頭, H) 不似乎在掃描中改變的高亮度顯示焦點黏附力結構。 有趣地,當與在 AFM 圖像的肌動蛋白結構比較,焦點黏附力不似乎更改,而有肌動蛋白纖維的明顯的對準線沿這個細胞的機體的。 在原始圖像網絡是可視的在這個 submembranous 細胞骨架。 每個連續的圖像 cytoskeletal 纖維一致 (黑色箭頭) 和高池體。 另外,有在這個細胞的平面的區的許多小,靈活,高動力的伸進 (盤旋在黑色)。 從這些圖像這個表層下細胞骨架比焦點黏附力似乎是顯著地動態在此時間表在這個細胞和技術支持之間的界面。

當這裡熒光團使用時仅一,熒光顯微法可能明顯地被擴大包括多個熒光通道。 在 JPK Nanowizard® 的激光是在這個可見光譜之外的一個波長這樣紅色通道熒光沒有被 AFM 激光的出現打亂。

在更小的掃描範圍,程度物力論在細胞表面能更加清楚被看到。 細胞表面的二個連續的圖像在表 4 存在作為地形學數據的三維投影。 二個圖像分開繼續地被採取了, 15 分鐘。 大 cytoskeletal 結構在兩個圖像頂部是類似的,然而許多這個結構的其餘更改了在圖像之間。 在第一個圖像 (黑色箭頭) 看見的一個靈活的土坎在第二內消失。 更加細致的表層下結構能也被看到有更改嚴重在二個圖像之間。

圖 4。

結論

AFM 可以使用到圖像活細胞在史無前例的解決方法和在適用於論及一定數量的生物學過程的時間表。

JPK Nanowizard® 的設計啟用結合 AFM 的多維顯微學與光學成像技術。

這樣設置可以用於調查,同時,發生用這個細胞的不同的地區的活動。 或者,從不同的對比方法搜集的信息在結構功能關係能用於生成信息。 當 AFM 可能生成關於細胞的有趣和唯一信息作為獨立成像技術時, JPK Nanowizard® 的綜合化到一個完全功能,被倒置的光學顯微鏡裡擴大在 AFM 的潛在細胞想像的。

來源: JPK 儀器

關於此來源的更多信息请請參觀 JPK 儀器

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:38

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