الرنين المغناطيسي النووي التحليل الطيفي ، والبلورات بالأشعة السينية في الوقت الراهن التقنيات الأكثر شيوعا قادرة على تحديد هياكل الجزيئات البيولوجية مثل البروتينات والأحماض النووية على المستوى الذري من القرار. ومن المعروف في معظمها مجهر القوة الذرية (AFM) لقدرات التصوير ، لكنها أيضا أداة لقياس حساسة جدا من الناحية الكمية على مستوى القوات جزيء واحد. هذه القدرة يسمح باستخدام فؤاد كأسلوب بديل للتحقيق في التكوين الهيكلي للالجزيئات في ظل الظروف المحلية. قياس القوى داخل الجزيئات ، وبين واحد ويوفر نهج آخر لفهم من المناظر الطبيعية والطاقة الجزيئية حركية التفاعل الكيميائي. يمكن قياس AFM السندات الفردية التشكيل والانهيار ، بدلا من أن تقتصر على المعدلات الإحصائية أكثر من السكان. هذا التقرير يركز على استخدام جزيئات فؤاد لمعالجة واحدة لانتزاع معلومات عن التركيب الجزيئي أو التشكل ، وقوات ملزمة ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ. ومن الممكن أيضا لدراسة الظواهر التي تعتمد الوقت ، مثل ديناميات ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ في الجزيئات ، والاعتراف الجزيئية أو طي البروتين في الموقع. الجزيئية تجارب تمتد قوة التحليل الطيفي هو وضع فؤاد حيث يتم نقل معلومات سرية صعودا وهبوطا أعلاه نقطة واحدة على السطح ، بينما يتم قياس الانحراف ناتئ أو خصائص أخرى. وهذا يعطي لمحة عن القوات على ارتفاعات مختلفة فوق السطح. في التجارب التي تمتد الجزيئية ، وعادة ما يتم إحضارها غيض في اتصال مع السطح ، ويسمح للجزيئات على الركيزة للتفاعل مع معلومات سرية ، ومن ثم يتم التراجع عنها في ناتئ. ويظهر هذا التحرك تخطيطي في سلسلة الصور في الشكل 1 -- نحو نموذج (النهج) ثم مرة أخرى بعيدا (لسحب). كما يتم نقل ناتئ بعيدا عن السطح ، وانحراف يعكس القوات بين طرف والسطح. إذا تم عقد جزيء واحد بين طرف والسطح ، ثم انحراف للناتئ يعطي قدرا من القوة التي مورست على الجزيء. في الرسم التخطيطي في الشكل 1 ، ويظهر جزيء واحد مشدودا بين التلميح والركيزة ل. قد يكون هذا الجزيء ثلاثي الابعاد تعريف بنية مطوية ، كما للبروتينات ، على سبيل المثال ، أو أنها قد تكون سلسلة المختلين ، مثل البوليمرات أخرى طويلة. التفاعل بين طرف لاصقة وجزيء يتم عادة في الجزء الاتصال اشمئزاز من منحنى القوة ، ولكن توجد ملامح الفائدة للالجزيئية تمتد في منحنى التراجع.  الشكل 1. رسم تخطيطي لقوة التجربة الطيفي حيث يتم استخدام غيض فؤاد لتمتد جزيء واحد يمكن أن تمدد جزيئات طويلة السلسلة ، مثل الحمض النووي أو دكستران ، بين تلميح والعينة. ويمكن أن ينظر إلى صلابة وإصرار من طول تمتد الأولى من الجزيء. ويمكن أيضا أن تكون التحولات الجزيئية الداخلية التي تمت دراستها ، مثل الانتقال ذوبان في الحمض النووي باعتبارها العمود الفقري تعيد ترتيب أعلى في إطار التوتر. يمكن أن تكون الجزيئات مع هيكل 3 الأبعاد المعقدة ، مثل العديد من البروتينات ، تكشفت بطريقة مسيطر عليها بحيث يمكن التحقيق في وحدات هيكلية. Titin رودوبسين جرثومي وأمثلة من البروتينات التي تم دراستها بشكل مكثف. يمكن سحب بروتينات غشاء من الغشاء ، وكان ينظر إلى "تفرقع" من اللوالب ألفا الفردية. خصائص الجزيئات الكبيرة في الحل جزيئات طويلة في حل نادرا ما تكون مثل قضيب أو شديدة ، وغالبا ما يكون لها مرونة عالية على طول العمود الفقري للجزيء. حتى يتم ترتيب الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ، والتي يعتقد عادة من كناقل "شديدة" بسبب الهيكل الحلزوني المزدوج ، على تشابك عشوائي لفترات تتجاوز بضع مئات من نانومتر. وهذا يعني أن هناك فرقا كبيرا بين طول جزيء يقاس على طول العمود الفقري أو سلسلة (طول محيط) ، وأبعاد النموذجية التي تحتلها في الحل (على سبيل المثال في دائرة نصف قطرها من التفاف أو طول من النهاية إلى النهاية) ، والتي هي أصغر من ذلك بكثير.  الشكل 2. رسم تخطيطي اثنين من التشكل ممكن من جزيء طويل. في ألف ، ويمتد هذا الجزيء في التشكل من غير المرجح للجزيء في الحل. B يظهر التشكل أكثر نموذجية ، حيث الجزيء في مجموعة متشابكة غير منظم. ويمثل هذا الترتيب تخطيطي في الشكل 2. في الجزء ألف ، يظهر جزيء طويل في التشكل الموسعة. في الجزء باء ، تظهر التشكل مختلفة حيث هو جزيء في تشابك عشوائي الاسترخاء التي تحتل بعدا أصغر بكثير من طول الوحشي كفاف. هناك العديد من التشكل مماثلة لتلك التي تظهر في B المتاحة للجزيء من التشكل مماثلة لتلك التي تظهر في ألف ، وهذا يؤدي إلى اختلاف في الكون أو الطاقة خالية من التشكل مختلفة. هناك تكلفة في الطاقة الحرة لتصويب جزيء من B إلى A التشكل ، حيث يتم تخفيض عدد التشكل ذات الصلة المتاحة. هذا الاختلاف الطاقة الحرة يترجم إلى القوة التي تقاوم واستقامة ، وأعمال مثل "الربيع" التدهور الحتمي. هذا هو على النقيض من الوضع على نطاق والعيانية ، حيث سحب سلسلة مرنة لا تحتاج إلى قوة كبيرة حتى أنه مستقيم وتمدد العمود الفقري الفعلي. عندما يتم سحب جزيئات طويلة ، لا بد من القوة لتمديد جزيء نحو التشكل مباشرة حتى لو لم يتم سداد السندات في العمود الفقري مشدودا. التدهور الحتمي المرونة ويشيع استخدام نموذجين الأساسية لهذا التدهور الحتمي مرونة ، حسب ما إذا كان يتم تضمين بعض صلابة السلسلة. في النموذج صوتها بحرية (FJC) السلسلة ، على غرار العمود الفقري وحدات صغيرة متصلة بواسطة المفاصل تماما "حرة" ، حتى أن وحدات متجاورة يمكن أن يكون لها أي زاوية بينهما دون تكلفة الطاقة الإضافية. الدودة تشبه نموذج (WLC) السلسلة ، في المقابل ، هو خيط متواصل مع تصلب بنيت في سلسلة ، وأفضل نموذج لجزيئات مثل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. يتم تعريف طول المثابرة ، والذي يمثل طول السلسلة التي هي أكثر عشوائية التوجه الأولي. إذا تم جمعها منحنى القوة والإرشاد ، ثم يمكن تركيبها من قبل واحدة من هذه النماذج للحصول على طول جزيء مشدودا ، وطول استمرار للنموذج WLC. بعض جزيئات متخصصة ، مثل البروتينات ، وعادة ما يكون لها تعريف (مطوية) هيكل ثلاثي الأبعاد في الحل. هذا الهيكل هو مفتاح وظيفتها البيولوجية والانزيمات أو وحدات الهيكلي ، على سبيل المثال. سلسلة ببتيد ليس لفائف مريحة فضفاضة ، ولكن مطوية في هيكل أقسى بكثير ، وعقد العديد من السندات معا. إذا تكشفت البروتين ، عن طريق تغييرات القوة أو الكيميائية أو الحرارية ، ثم سلسلة ببتيد مجانا يتصرف مثل جزيء خطية بسيطة. ويمكن أن ينظر إلى التدهور الحتمي وتمتد ، والسندات على طول العمود الفقري ببتيد مرنة للغاية. ويمكن تعريف أجزاء من هيكل البروتين ، مثل ألفا اللوالب أو المجالات الكروية ، تكشفت تباعا ، و "الحرة" قياس طول جزيء بناء على منحنيات تمتد سيزيد مع كل حدث تتكشف. بروتين تتكشف الخطوات توفير معلومات حول بنية وآليات طبيعية مطوية فشلها. زنتان -- جزيئية بسيطة تمتد زنتان هو السكاريد الجرثومي ، مع العمود الفقري الجزيئية مماثلة لالسليلوز. الخصائص الكيميائية للمجموعات الجانب تعطي العديد من تطبيقات البوليمر الصناعي ، وتحقيق الاستقرار من الغذاء لاستخراج النفط. عندما يتمدد كانثان جزيء بين التلميح والسطح ، ومجموعات الجانب القصير لا يكون لها تأثير كبير على خصائص المرونة ، وسلوك مشابه لسلسلة واحدة السليلوز (carboxymethylated). يمكن أن ارتفاع الوزن الجزيئي زنتان البوليمرات وأطوال عدة ميكرون ، ويمكن استخدام منحنيات تمتد كمثال لتمديد جزيئية بسيطة. بالنسبة للقوات منخفضة ، تمتد سلسلة الربيع ضد التدهور الحتمي. عند نقطة ما ، وطول نهاية إلى نهاية النهج طول كفاف ، ومرونة مرونة العمود الفقري أمرا هاما. الشكل 3 يبين منحنى التراجع من جزيء واحد كانثان مشدودا (الفوسفات في حل العازلة) باستخدام NanoWizard ® فؤاد. تم معايرة انحراف ناتئ باستخدام أسلوب الضجيج الحراري. وعلى سبيل المقارنة مع النماذج ، لا بد أيضا المسافة غيض عينة يتم تصحيح للانحراف من ناتئ إلى الحصول على قيمة حقيقية الانفصال ، والذي يظهر هنا. وأكبر قوة سلبية يناظر غيض يجري نحيد أكثر نحو السطح ، وبالتالي زيادة قوة الممتدة على الجزيء.  الشكل 3. الطيفي قوة سحب منحنى كانثان جزيء واحد مشدودا. ويظهر أيضا لنموذج منحنى FJC الموسعة للمقارنة. ويظهر أيضا منحنى عن النموذج FJC الموسعة في الشكل (3) للمقارنة ، وتحسب باستخدام طول كوهن من 6 نانومتر ، ويبلغ طوله 1.25 ميكرون كفاف. كان لائقا للFJC بسيطة أو نموذج معقول للقوات WLC الممتدة الصغيرة (أقل من حوالي 50pN في هذه الحالة) ، ولكن اختلفت في أعلى منحنيات القوات. ومن ثم تم استخدام نموذج تمديد FJC مع مرونة قطعة إضافية ، لتأخذ في الاعتبار العمود الفقري تمتد على القوات العالي الممتدة. في حالة كانثان ، ويمتد وجود صلة بين واحد طويل ورأس السطح. منذ جزيء طويل جدا ، والقوة لتمديد انها صغيرة جدا لكثير من منحنى الشد ، وتهيمن على السلوك من قبل قوة أعلى ، حيث تمتد على طول تمتد بالقرب من طول كفاف. لجزيئات أكثر تعقيدا مطوية ، مثل البروتينات ، وينظر عموما سلسلة من هذه الأحداث تمتد إلى أجزاء مختلفة من الهيكل وتتكشف الموسعة. رودوبسين جرثومي -- استخراج وبسط رودوبسين جرثومي هو بروتين الغشاء لا يتجزأ من الخلايا البكتيرية ، والذي يولد الطاقة للخلايا من فوتونات الضوء. هناك 7 عبر الغشاء ألفا اللوالب ، مع حلقات الببتيد غير منظم أكثر بينهما. عندما يتم اغتنامها واحدة من نهاية البروتين وسحبها ، ثم يتم سحب ألفا اللوالب من الغشاء ، وظهورها كما هي فقد انسحب الاسرائيليون. الغشاء الأرجواني هو المصدر الطبيعي لرودوبسين جرثومي ، ويتكون من 25 ٪ ، والدهون 75 ٪ رودوبسين جرثومي. يتم ترتيب البروتين كما trimers في بنية الكريستال 2 الأبعاد ، التي يمكن تصويرها باستخدام فؤاد ، كما هو مبين في الشكل 4 (مجاملة عينة من مولر DJ ، تقني جامعة ، دريسدن ، ألمانيا . ويمكن رؤية شكل ترايمر مميزة في الصورة. ولا يمكن تصوير هذا البروتين باستخدام فؤاد ثم البروتينات الفردية المحددة وسحبها باستخدام معلومات سرية. يمكن أن تكون مغلفة غيض خصيصا ، والجزيئات تعديل لالتقاط جزء معين من الهيكل ، أو يمكن الضغط على تلميح إلى السطح لالتقاط جزيء غير محدد.  الشكل 4. AFM صورة ارتفاع الغشاء الأرجواني (الجانب هيولي) ، ويؤخذ به JPK NanoWizard ® في وضع الاتصال في حل العازلة (170nm × 100 نانومتر ، ومجموعة ارتفاع 1nm) ويظهر رسم تخطيطي للعملية الجارية في الشكل 5. وترد السبعة ألفا اللوالب في الجزء ألف ، مع تلميح فؤاد التقاط طرف واحد (لاحظ أنه في البروتين الفعلي ، ويتم تجميع ألفا اللوالب معا في حزمة وليس الخط). هناك العديد من المسارات الممكنة تتكشف ، ولكن الأحداث الأكثر احتمالا هي أن سحبت alphahelices في أزواج. وتقدم ثلاثة من كشف جزئيا هو مبين الدول في الجزء باء من الشكل 5 ، مع أزواج من اللوالب تتكشف ألفا كما يتم استخراج أنها من الغشاء.  الشكل 5. رسم تخطيطي لرودوبسين جرثومي تتكشف به غيض فؤاد. يتم اختيار واحدة من نهاية جزيء من قبل الطرف (أ) ، ويتم سحبها ألفا اللوالب بالتتابع في أزواج (B). الشكل 6 يظهر تراكب المنحنيات رودوبسين جرثومي 10 تتكشف ، مع قوة فصل يحاك ضد طرف عينة تصحيحها. هناك بعض التصاق كما غيض يترك السطح ، تليها ثلاثة أحداث رئيسية تمتد وتتكشف ، المقابلة لهذه الدول الثلاث هو موضح في الشكل 5 باء قمم الرئيسية هي حول 30nm - 20 ، 40 و 60 50nm 80nm ، التي توافق تماما مع القيم المنشورة في الأدبيات. تم معايرة ناتئ باستخدام أسلوب الضوضاء الحرارية ، والتجارب التي نفذت في إطار العازلة (10MM TRIS ، 150mM بوكل ، ودرجة الحموضة 7.6). الموضع الدقيق للأحداث فشل السندات يختلف من منحنى لمنحنى ، والذي هو الحال بالنسبة للسندات وثيق مع الطاقة إلى طاقة حرارية في درجة حرارة الغرفة. وتمتد أجزاء من تراكب المنحنيات في الشكل (6) ، والتي تبين أن يجري توسيع الهياكل نفسها في كل حالة. فقط لحظة الفعلية عندما كسر السندات امتدت يختلف من منحنى إلى منحنى. لالسندات مع الطاقة قرب الطاقة الحرارية ، وهناك بعض الاحتمالات منها فشله في غضون فترة زمنية معينة ، حتى مع عدم وجود قوة تطبيقها. هذا يتوافق مع طبيعية "معدل قبالة" ينظر للتفاعل ملزمة الحرة في الحل. بالنسبة للسندات مع الطاقات قليلا فوق الطاقة الحرارية ، والتي عادة ما تكون مستقرة ، واحتمال فشلها منهم يزيد تلقائيا كما هو تطبيق القوة.  الشكل 6. بسط منحنيات رودوبسين جرثومي التي انسحبت من الغشاء الأرجواني (10 تراكب التراجع المنحنيات). طريقة واحدة للتفكير في هذا الحدث تمتد ، وبالتالي ، هو أن السندات المتوترة حتى حاجز الطاقة لتتكشف داخل النطاق الحراري. لحظة الفعلية عندما تفشل السندات فجأة يتوقف على تقلبات حرارية العشوائية ، والتي تأخذ الجزيء على حاجز الطاقة تتكشف. الاعتماد الوقت يعني أن معدل قياس تتكشف سيعتمد على معدل التحميل ، أو السرعة التي يتم سحب طرف الطرف الحر للجزيء.  الشكل 7. الرسم البياني للموقف من قمم three تتكشف (نصيحة فصل تصحيح عينة) لمجموعة من المنحنيات رودوبسين جرثومي 355 تتكشف. ويمكن جمع الكثير من المنحنيات التي تتكشف من رودوبسين جرثومي لإعطاء رأي الإحصائية للأحداث الجارية. الجزيء قد تتكشف في عدة طرق ، وحتى بعض الاختيار يجب أن يكون المحرز في منحنيات القوة لاختيار مجموعة فرعية معينة. في هذه الحالة ، تم اختيار المنحنيات فقط تظهر الأحداث الرئيسية الثلاثة تمتد ، ومثل الأمثلة في الشكل 6. في الشكل 7 يتم تقديم الرسم البياني الذي يبين توزيع عينة فصل بلاغ للقمم الثلاث (بيانات عن منحنيات ن = 355). ونفذ جزئيا تحليل منحنى القوة خارج باستخدام البرمجيات PUNIAS.  الشكل 8. مؤامرة مبعثر القوة ضد موقف (نصيحة فصل تصحيح عينة) عن الأحداث التي تتكشف هو مبين في الشكل 6. ويبين الشكل 8 مؤامرة مبعثر من قوة الجارية مقابل موقف من هذا الحدث لنفس البيانات كما في الشكل 7. قوة من أجل الحدث الأول تتكشف (الذروة 1) هو أعلى بكثير مما كانت عليه في الأحداث اللاحقة (بيكس 2 و 3). مرة واحدة وقد تعطلت بنية البروتين ، ثم القوة المطلوبة لسحب ما تبقى من اللوالب ألفا من أصل يتم تقليل الغشاء. منحنيات تتكشف أيضا إظهار مسارات مختلفة للجزيء لتتكشف والانسحاب من الغشاء. من معرفة بنية البروتين والأحماض الأمينية أطوال السلسلة ، ويمكن تركيبها على منحنيات الممتدة لتبين بوضوح المسار الذي أخذ يتكشف في منحنى قوة معينة. Titin بسط Titin هو بروتين من الأنسجة العضلية ، والذي يتألف من عدة مجالات الكروية المتكررة. داخل الأنسجة العضلية وهي مسؤولة عن الخواص الميكانيكية على نطاق والعيانية. ويسمح فؤاد دراسة خصائص ميكانيكية نانوية من جزيئات titin الفردية. كما امتدت الجزيء ، عند نقطة ما سوف السندات عقد مجال معين معا تفشل. هذا المجال ولا سيما كروي ثم تتكشف ، مما يؤدي إلى طول فترة أطول لكفاف الجزيء. مع سحب مزيد من تمدد هذا الجزء أيضا من الأحماض الأمينية الخطية ، واحدة من المجالات الأخرى وسوف يصل إلى نقطة الفشل. ويتضح هذا بشكل تخطيطي في الشكل 9.  الرقم 9. رسم تخطيطي لtitin تمتد ، كما تتكشف المجالات الكروية المتعاقبة. كما يتم سحبها من البروتين ، والمجالات "البوب" فتح بالتسلسل ، مما أدى إلى سلسلة من القمم مميزة في المنحنيات انحراف. شكل منحني كل جزء من المؤامرة على التوالي يعكس قوة وازدياد طول الفعال للجزيء حيث تكشفت المجالات. ملحق titin نموذجي القوة يتراجع المنحنى الطيفي هو مبين في الشكل 10 (بيانات من باب المجاملة Amrein ماتياس ، جامعة كالغاري ، كندا ، يتم الحصول عليها باستخدام NanoWizard ® فؤاد على احد Ig8 titin بروتين العضلات). يمكن أن يكون تسلسل الأحداث المميزة titin تتكشف بوضوح. قوة يزداد بشكل مطرد ، كما يزيد من حدة التوتر في الجزيء. فجأة انخفاض حاد في القوة كمجال الإيج انبثاق فتح والافراج عن التوتر. يمكن تركيبها على منحنى كل المنطقة الممتدة مع FJC WLC أو النموذج المطابق لمدة الأحماض الأمينية الحرة. حجم القوة التي تتكشف عن مجال واحد هو في نطاق 250pN - 190 ، وطول محيط مجال واحد (الذروة إلى الذروة بعد) هو 28nm.  الرقم 10. titin منحنى قوة الشد ، تظهر متسلسلة تتكشف من المجالات كروي (بيانات من باب المجاملة Amrein ماتياس ، جامعة من كالغاري ). تطبيقات يمكن أن تمتد لمجموعة واسعة من البروتينات وكشف باستخدام فؤاد. وقد تبين أن اثنين من الأمثلة هنا ، واحد من البروتين وبروتين واحد غشاء هيولي. ويمكن تمديد هذه الطريقة لبروتينات أخرى ، للحصول على معلومات حول كل من بنية البروتين الطبيعي وسائط فشلها. في حالة رودوبسين جرثومي ، وبروتين عالية جدا أشكال هياكل معبأة في جدار الخلية البكتيرية ، وذلك هو واحد من البروتينات الغشاء القليلة التي يمكن أن تبلور عالية الدقة لتحديد الهيكلية. يمكن أن يكون هذا الأسلوب أكثر عموما والمطبقة ، ولكن. لمعظم البروتينات الغشاء ، تسلسل الأحماض الأمينية هي أسهل بكثير من تحديد بنية مطوية ، منذ أكثر بروتينات غشاء ليست مناسبة لبلورة. ويمكن قياس تطور الأحداث مع فؤاد ، والتي تظهر أن التغير في طول الأحماض الأمينية وحدات هيكلية مختلفة تتكشف ، يمكن استخدامه مع تسلسل معروف لتفسير هيكل التعليم العالي للبروتينات الغشاء. ويمكن طلاء معينة من التحقيق ، وتعديل بروتين معين أن يكون "البيك اب" نقاط تؤدي إلى سحب البروتين في مواقع مختلفة ، وبالتالي مزيد من المعلومات حول كيفية توصيل وحدات معا الهيكلية في بنية 3 - D. وهكذا فؤاد قادر على ان يعطي نظرة ثاقبة على تكوين جزيء واحد ، وتسمح لقياس مستقل من الخصائص الجزيئية لتحسين تقنيات النمذجة الجزيئية. ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع فؤاد واحدة تقنيات مضان جزيء مثل TIRF أو الحنق. |