NMR spektroskopi og røntgen-krystallografi er i øjeblikket den mest almindelige teknikker i stand til bestemmelse af strukturer af biologiske makromolekyler som proteiner og nukleinsyrer på et atomart niveau af opløsning. Den atomic force mikroskop (AFM) er mest kendt for sin billeddannelse kapaciteter, men det er også et meget følsomt værktøj til kvantitativt at måle kræfter på et enkelt molekyle niveau. Denne funktion giver mulighed for brug af AFM som en alternativ teknik til undersøgelse af de strukturelle konfiguration af makromolekyler under indfødte betingelser. Måling af kræfter inden for og mellem enkelte molekyler giver en anden tilgang til forståelsen af molekylær energi landskaber og kemisk reaktionskinetik. AFM kan måle enkelte obligationer formning og bryde, snarere end at være begrænset til statistiske gennemsnit over en population. Denne rapport koncentrerer sig om brugen af AFM til at manipulere enkelte molekyler at trække oplysninger om den molekylære struktur eller kropsbygning, og intramolekylære bindende kræfter. Det er også muligt at studere tid fænomener, som f.eks intramolekylære dynamik i makromolekyler, molekylær genkendelse eller proteinfoldning in situ. Molekylær Stretching Eksperimenter Tving spektroskopi er et AFM mode, hvor spidsen er flyttet op og ned over et enkelt punkt på overfladen, mens den deformation eller andre cantilever egenskaber måles. Dette giver en profil af de kræfter i forskellige højder over overfladen. I molekylær stretching eksperimenter, er spidsen normalt kommer i kontakt med overfladen, er de molekyler på underlaget lov til at interagere med spidsen, og derefter cantilever er trukket tilbage. Denne bevægelse er vist skematisk i billedet serie i figur 1 - mod prøven (den tilgang) og så væk igen (trække). Da cantilever er flyttet væk fra overfladen, udbøjningen afspejler kræfter mellem spidsen og overfladen. Hvis et enkelt molekyle er afholdt mellem spidsen og overfladen, så den afbøjning af cantilever giver et mål for den kraft, der virker på molekylet. I den skematiske diagram i figur 1, er en enkelt molekyle vist at være udspændt mellem spids og underlaget. Molekylet kan have en defineret tre dimensionel foldede struktur, som for proteiner, for eksempel, eller det kan være en uordnet kæde, som mange andre længe polymerer. Limen samspillet mellem spidsen og molekylet finder normalt sted i den frastødende kontakt del af styrken kurven, men funktionerne af interesse for den molekylære strække findes i trække kurven.  Figur 1. Skematisk diagram af en kraft spektroskopi eksperiment, hvor AFM spids bruges til at strække et enkelt molekyle Langkædede molekyler, såsom DNA eller dextran, kan strækkes mellem spidsen og prøven. Den stivhed og vedholdenhed længde kan ses fra den første strækning af molekylet. Intern molekylære overgange kan også undersøges, såsom smeltning overgangen i DNA som rygraden omarrangerer under højere spænding. Molekyler med komplekse 3-dimensionelle struktur, som mange proteiner, der kan foldes ud på en kontrolleret måde, således at de strukturelle enheder kan undersøges. Titin og bacteriorhodopsin er eksempler på proteiner, der er blevet intensivt undersøgt. Membranproteiner kan trækkes ud af membranen, og "popping" ud af de enkelte alfa-helices er blevet set. Karakteristik af makromolekyler i Solution Lange molekyler i opløsning er sjældent stang-lignende eller stiv, og har ofte en høj fleksibilitet langs rygraden af molekylet. Selv dobbelt strandede DNA, der normalt opfattes som en "stiv" molekyle på grund af dobbelt-helix struktur, er indrettet som en tilfældig virvar af længder ud over et par hundrede nanometer. Det betyder, at der er en stor forskel mellem længden af molekylet målt langs kæden eller rygrad (konturen længde), og den typiske dimensioner, den indtager i opløsning (f.eks radius af Gyration eller end-to-end længde), som er meget mindre.  Figur 2. Skematisk diagram af to mulige konformationer af en lang molekyle. I A, er molekylet strakt ud i en usandsynlig kropsbygning for et molekyle i opløsning. B viser en mere typisk kropsbygning, hvor molekylet på en uorganiseret virvar. Ordningen er repræsenteret skematisk i Figur 2. I del A, er en lang molekyle vist i en udvidet kropsbygning. I del B, er en anden kropsbygning vist, hvor molekylet er i en afslappet tilfældig virvar, der indtager en langt mindre lateral dimension end den kontur længde. Der er mange flere konformationer ligner den, der vises i B til rådighed for molekyle end konformationer svarende til den, er vist i A, og det fører til forskellen i entropi og fri energi for de forskellige konformationer. Der er en omkostning i fri energi at rette et molekyle fra kropsbygning B til A, da antallet af tilgængelige relaterede konformationer er reduceret. Denne fri energi forskel svarer til en kraft, der modstår opretning, og virker som en entropisk "forår". Dette er i kontrast til situationen på en makroskopisk skala, hvor trække en fleksibel streng ikke kræver en betydelig kraft, indtil den er lige og den egentlige rygrad er strakt. Når lange molekyler er trukket, er en kraft der kræves for at udvide molekyle i retning af en lige kropsbygning, selvom obligationerne i rygraden ikke bliver strakt. Entropiske Elasticitet To grundmodeller er almindeligt anvendt til dette entropiske elasticitet, alt efter om nogle kæde stivhed er inkluderet. I frit ende kæden (FJC) model, er rygraden modelleres som små enheder er forbundet med helt "gratis" leddene, således at tilstødende enheder kan have enhver vinkel mellem dem uden ekstra energi omkostninger. Ormen-lignende kæde (WLC) model, i modsætning er en kontinuerlig filament med kæde stivhed indbygget, og er en bedre model for molekyler såsom dobbelt-strenget DNA. En persistens længde er defineret, som repræsenterer længden af kæden over, hvor den oprindelige orientering er randomiseret. Hvis en force-forlængelse kurven er indsamlet, så det kan monteres af én af disse modeller for at få længden af molekylet bliver strakt, og de vedvarende længde for WLC model. Nogle specialiserede molekyler, såsom proteiner, normalt har en defineret (foldet) tre-dimensionelle struktur i opløsning. Denne struktur er nøglen til deres biologiske funktion som enzymer eller strukturelle enheder, f.eks. Den polypeptid kæde er ikke en afslappet løs spole, men er foldet ind i en meget stivere struktur og holdes sammen af mange obligationer. Hvis proteinet er udfoldet, med magt, kemiske eller termiske ændringer, så den frie polypeptid kæden opfører sig som en simpel lineær molekyle. Den entropisk strækker kan ses, da obligationerne langs polypeptid backbone er meget fleksible. Defineret dele af protein struktur, såsom alfa-helices eller kugleformet domæner, kan foldes ud sekventielt, og de målte "gratis" længde af molekylet er baseret på den strækning kurverne vil stige med hver udfoldelse begivenhed. Proteinet udfoldning trin giver oplysninger om den normale foldede struktur og dets manglende mekanismer. Xanthan - Simple Molekylær Stretching Xanthan er en bakteriel polysakkarid, med en molekylær rygrad identisk med cellulose. De kemiske egenskaber side grupper giver polymeren mange industrielle applikationer, fra fødevare-stabilisering til olieindvinding. Når xanthan molekyle er spændt ud mellem spidsen og overfladen, gør den korte side grupper ikke har en signifikant effekt på den elastiske egenskaber, og den adfærd, der svarer til et enkelt (carboxymethyleret) cellulose kæde. Høj molekylvægt xanthan polymerer kan have længder af flere mikron, og den strækker kurver kan bruges som eksempel for simple molekylære forlængelse. For lav kræfter, er kæden strækkes mod entropiske foråret. På et tidspunkt, som end-to-end længden tilgange konturen længden elasticiteten i rygraden elasticitet bliver vigtigt. Figur 3 viser trække kurven for en enkelt Xanthan molekyle, der strakte (i en fosfatbuffer) ved hjælp af NanoWizard ® AFM. Cantilever afbøjning er kalibreret ved hjælp af termisk støj-metoden. Til sammenligning med de modeller, skal den tip-prøve afstand også korrigeres for afbøjning af cantilever at opnå en reel adskillelse værdi, som er vist her. En større negativ kraft svarer til spidsen bliver afbøjet mere mod overfladen, og dermed en højere ekstensionelle kraft på molekyle.  Figur 3. Kraft spektroskopi trække kurve af en enkelt Xanthan molekyle bliver strakt. En kurve for den udvidede FJC model er også vist til sammenligning. En kurve fra den udvidede FJC model er også vist i figur 3 til sammenligning, beregnet ved hjælp af en Kuhn længde på 6 nm og en kontur længde på 1,25 mikron. Det passer til den enkle FJC eller WLC model var rimelig for lille ekstensionelle kræfter (nedenfor rundt 50pN i dette tilfælde), men kurverne afveg ved højere kræfter. Derfor udvidede FJC model med ekstra segmentet elasticitet blev brugt, for at tage hensyn rygraden strækker sig ved højere ekstensionelle kræfter. I tilfælde af Xanthan, er en enkelt lang forbindelse mellem spidsen og overfladen strækkes. Da molekylet er så lang, at den kraft udvide den er meget lille for en stor del af stretching kurve, og den adfærd er domineret af den højere kraft, der strækker sig, hvor den strakte længde er nær konturen længde. For mere komplekse foldet molekyler, såsom proteiner, er en række af disse strækker begivenheder generelt betragtes som forskellige dele af strukturen udfolde sig, og er udvidet. Bacteriorhodopsin - Udvinding og Unfolding Bacteriorhodopsin er en integreret membran protein fra bakterieceller, der genererer energi til cellerne mod lys fotoner. Der er 7 transmembrane alfa-helices, med mere uorganiseret peptid sløjfer mellem dem. Når den ene ende af proteinet er fattet og trak, så er alfa-helices trækkes ud af membranen, og de folder sig ud som de er trukket ud. Purple membran er den naturlige kilde til bacteriorhodopsin, og består af 25% fedt og 75% bacteriorhodopsin. Proteinet er indrettet som trimerer i en 2-dimensionel krystalstruktur, som kan afbildes ved hjælp af AFM, som vist i Figur 4 (stikprøve høflighed af DJ-Müller, Teknisk Universitet , Dresden , Tyskland . Den karakteristiske trimer form kan ses i billedet. Proteinet kan afbildes ved hjælp af AFM og derefter individuelle proteiner udvalgt og trak ved hjælp af spidsen. Spidsen kan være beklædt specielt, og molekylerne ændret for at afhente en bestemt del af strukturen, eller spidsen kan presses ind i overfladen for at hente et molekyle non-specifikt.  Figur 4. AFM højde billede af lilla membran (cytoplasmatisk side), taget med JPK NanoWizard ® i kontakt mode i bufferopløsning (170nm x 100 nm, 1NM højde interval) En skematisk diagram over udfoldelsen processen er vist i figur 5. De syv alpha-helices er vist i del A, med AFM spidsen afhente den ene ende (bemærk, at i selve protein, er alfa-helices samles i et bundt, ikke en linje). Der er mange mulige udfoldelse veje, men det mest sandsynlige begivenheder er, at alphahelices trækkes ud i par. En progression af tre delvist udfoldet stater er vist i del B i figur 5, med par af alfa-helices udfolder sig, som de er udvundet af membranen.  Figur 5. Skematisk diagram af bacteriorhodopsin udfoldelse ved hjælp af AFM spidsen. Den ene ende af molekylet er samlet op af spidsen (A), og alfa-helices trækkes ud sekventielt i par (B). Figur 6 viser en superposition af 10 bacteriorhodopsin udfolde kurver, med den kraft plottes mod den korrigerede tip-prøve separation. Der er en vis vedhæftning som spidsen forlader overfladen, efterfulgt af tre vigtigste stretching og udfoldning begivenheder, svarende til de tre stater er vist i Figur 5 B. De vigtigste toppe er omkring 20-30 nanometer, 40-50Nm og 60-80nm, som er enige godt med værdier publiceret i litteraturen. Cantilever blev kalibreret ved hjælp af den termiske støj-metoden, og forsøg udført under buffer (10mm TRIS, 150mm KCl, pH 7.6). Den nøjagtige placering af obligationen svigt begivenheder varierer fra kurve til kurve, hvilket er typisk for obligationer med energi tæt på termisk energi ved stuetemperatur. Den strækker sig dele af kurver overlay i Figur 6, viser, at de samme strukturer er ved at blive strakt i hvert enkelt tilfælde. Kun de faktiske øjeblik, hvor den strakte obligationerne pause varierer fra kurve til kurve. For en obligation med energi nær den termiske energi, er der en vis sandsynlighed for at det ikke inden for en bestemt tid, selv uden påførte kraft. Dette svarer til det normale "off-rate" set for de bindende reaktionen fri i opløsning. For obligationer med energier lidt over den termiske energi, som normalt er stabile, spontant sandsynligheden af dem ikke stiger som påføres.  Figur 6. Unfolding kurver bacteriorhodopsin trækkes ud af lilla membran (superposition af 10 tilbagekalde kurver). En måde at tænke på en strækning begivenhed er derfor, at obligationerne er anstrengt, indtil den energi barriere for udfoldelse er inden for det termiske område. Det faktiske tidspunkt, hvor obligationerne pludselig ikke er afhængig af en tilfældig termisk udsving, som tager molekylet over udfoldelsen energi barriere. Tiden afhængighed betyder, at den målte udfoldelsen sats vil afhænge af belastningsgraden, eller den hastighed, hvormed spidsen er at trække den frie ende af molekylet.  Figur 7. Histogram af placeringen af de tre udfoldelsen toppe (tip prøve korrigeret separation) for et sæt af 355 bacteriorhodopsin udfoldelse kurver. Mange udfoldning kurver bacteriorhodopsin kan samles for at give et statistisk billede af den igangværende begivenheder. Molekylet kan udfolde sig på flere måder, så nogle valg der skal foretages i kraft kurverne til at vælge en bestemt delmængde. I dette tilfælde var det kun kurver viser de tre vigtigste strække begivenheder, som eksemplerne i Figur 6, valgt. I Figur 7 et histogram præsenteres, viser den tip-prøven separation distribution til de tre toppe (data for n = 355 kurver). Styrken kurven Analysen blev delvist gennemført ved hjælp af PUNIAS software.  Figur 8. Scatter plot af magt mod stilling (tip-prøve korrigeret separation) for udfoldelse begivenheder vist i Figur 6. Figur 8 viser et scatter plot af udfoldelsen kraft kontra placeringen af begivenhed for de samme datasæt som i figur 7. Den kraft for første udfoldelsen begivenhed (Peak 1) er betydeligt højere end for de efterfølgende begivenheder (Peaks 2 og 3). Når protein struktur er blevet forstyrret, da den kraft, der kræves for at trække de resterende alfa-helices ud af membranen reduceres. Udfoldelsen kurver viser også forskellige veje for molekylet at udfolde sig og trække sig ud af membranen. Fra et kendskab til proteiners struktur og aminosyre kæde længder, kan ekstensionelle kurver monteres klart at vise, hvilke udfoldning sti er taget i en særlig kraft kurve. Titin Unfolding Titin er et protein fra muskelvæv, der består af flere gentagne kugleformet domæner. Inden for muskelvæv den er ansvarlig for de mekaniske egenskaber på en makroskopisk skala. AFM gør det muligt at studiet af nanomechanical egenskaberne af de enkelte titin molekyler. Da molekylet er strakt, på et tidspunkt obligationerne i besiddelse af en bestemt domæne sammen vil mislykkes. Denne særlige kugleformede domæne så udfolder sig, hvilket fører til en længere kontur længde for molekyle. Med yderligere træk, er denne del af lineære aminosyrer, der også strakt, og en af de andre domæner vil nå sine fejl punkt. Dette er illustreret skematisk i Figur 9.  Figur 9. Skematisk diagram af titin stretching, som efterfølgende kugleformet domæner udfolde sig. Da protein er trukket, den domæner "pop" åben sekventielt, hvilket fører til en karakteristisk sekvens af toppe i afbøjning kurver. Formen på hver af de efterfølgende buede del af kraften plottet afspejler den øgede effektive længde af molekylet, da domæner er udfoldet. En typisk titin forlængelse kraft spektroskopi trække kurve er vist i Figur 10 (Misbrug af Matthias Amrein, University of Calgary, Canada, opnås ved brug af NanoWizard ® AFM på et enkelt Ig8 titin muskel protein). Den karakteristiske titin sekvens af Begivenhederne kan tydeligt ses. Den kraft stiger støt, som spændinger i molekylet stiger. Pludselig kraften aftager kraftigt som en Ig-domæne springer åben og spændingen udløses. Kurven for hver udvidelse af området kan være udstyret med FJC eller WLC model for den tilsvarende frie aminosyre længde. Størrelsen af de udfolder sig gældende for et enkelt domæne er i intervallet 190-250pN, og konturen længden af et domæne (peak-to-peak afstand) er 28nm.  Figur 10. Kraft kurve af titin stretching, viser fortløbende udfoldelse af de kugleformede domæner (data stillet til rådighed af Matthias Amrein, Universitet af Calgary ). Applikationer En bred vifte af proteiner kan strækkes og foldes ud ved hjælp af AFM. To eksempler er vist her, en membran protein og en cytoplasmatisk protein. Denne metode kan udvides til andre proteiner, for at få oplysninger om både den normale proteiners struktur og dens manglende tilstande. I tilfælde af bacteriorhodopsin, danner proteinet meget højt pakket strukturer i den bakterielle cellevæg, og så er en af de få membranproteiner, der kan krystalliseret til høj opløsning strukturelle beslutsomhed. Denne metode kan være mere generelt anvendes, dog. For de fleste membranproteiner, er aminosyresekvens meget lettere at bestemme end den foldede struktur, da de fleste membranproteiner ikke er egnet til krystallisering. Begivenhederne målt med AFM, der viser ændringen i aminosyre længde som forskellige strukturelle enheder udfolde sig, kan bruges med den kendte sekvens for at fortolke den tertiære struktur af membranproteiner. Specifikke belægning af sonden, og ændring af protein til at have specifikke "pick-up" punkter kan føre til, at trække det protein på forskellige steder, og dermed yderligere oplysninger om, hvordan de strukturelle enheder er koblet sammen i 3-D struktur. Således AFM er i stand til at give et indblik i konfigurationen af et enkelt molekyle, og tillade en uafhængig måling af molekylære egenskaber til at raffinere molekylær modellering teknikker. AFM kan også kombineres med enkelt molekyle fluorescens teknikker såsom TIRF eller FRET. |