Strukturelle Untersuchung von Einzelnen Biomolekülen und von Molekularem Ausdehnen Unter Verwendung der AtomKraft-Mikroskop-Techniken von JPK-Instrumenten

Themen Umfaßt

Hintergrund

Molekulare Ausdehnende Experimente

Eigenschaften von Makromolekülen in gelöster Form

Entropic Elastizität

Xanthan - Einfaches Molekulares Ausdehnen

Bacteriorhodopsin - Extraktion und Ausbreiten

Titin-Ausbreiten

Anwendungen

Hintergrund

NMR-Spektroskopie und Röntgenstrahlkristallographie sind aktuell die geläufigsten Techniken, die zur Bestimmung der Zellen der biologischen Makromoleküle wie Proteine und Nukleinsäuren auf einem Atomniveau der Auflösung fähig sind. Das Atomkraftmikroskop (AFM) bekannt größtenteils für seine Darstellungsfähigkeiten, aber es ist auch ein sehr empfindliches Hilfsmittel für Kräfte auf einer einzelnen Molekülstufe quantitativ messen.

Diese Fähigkeit erlaubt den Gebrauch FLUGHANDBUCHS als alternative Technik für die Untersuchung der strukturellen Konfiguration der Makromoleküle unter gediegenen Bedingungen. Das Messen von Kräften innerhalb und zwischen einzelnen Molekülen stellt einen anderen Anflug zum Verständnis von molekularen Energielandschaften und von Kinetik der chemischen Reaktion zur Verfügung. Das FLUGHANDBUCH kann die einzelnen Anleihen messen, die sich bilden und brechen, eher als, begrenzend auf statistische Durchschnitte über einer Bevölkerung.

Dieser Bericht konzentriert sich auf den Gebrauch des FLUGHANDBUCHS, einzelne Moleküle zu manipulieren, um Informationen über die Molekülstruktur oder die Anpassung zu extrahieren und die intramolekularen verbindlichen Kräfte. Es ist auch möglich, zeitabhängige Phänomene, wie intramolekulare Dynamik in den Makromolekülen, in der molekularen Anerkennung oder in der Proteinfaltung in situ zu studieren.

Molekulare Ausdehnende Experimente

Kraftspektroskopie ist ein FLUGHANDBUCH-Modus, in dem die Spitze über ein Einpunkt auf der Oberfläche hoch- und runterrückget wird, während der Ausschlag oder andere freitragende Eigenschaften gemessen werden. Dieses gibt ein Profil der Kräfte auf verschiedenen Höhen über der Oberfläche.

In den molekularen ausdehnenden Experimenten wird die Spitze normalerweise in Kontakt mit der Oberfläche geholt, werden die Moleküle auf der Substratfläche auf die Spitze einwirken lassen, und dann wird der Kragbalken eingefahren. Diese Bewegung wird schematisch in der Bildserie in Abbildung 1 - in Richtung zur Probe (der Anflug) und dann weg wieder gezeigt (das Einfahrung). Während der Kragbalken weg von der Oberfläche verschoben wird, reflektiert der Ausschlag die Kräfte zwischen der Spitze und der Oberfläche. Wenn ein einzelnes Molekül zwischen der Spitze und der Oberfläche angehalten wird, dann gibt der Ausschlag des Kragbalkens eine Maßnahme der Kraft, die auf dem Molekül ausgeübt wird.

Im schematischen Diagramm in Abbildung 1, wird ein einzelnes Molekül zwischen die Spitze und die Substratfläche ausgedehnt werden gezeigt. Das Molekül hat möglicherweise eine definierte dreidimensionale gefaltete Zelle, was Proteine, zum Beispiel, oder sie anbetrifft sein mag eine zerrüttete Kette, wie viele anderen langen Polymere. Die klebende Interaktion zwischen der Spitze und dem Molekül findet normalerweise im abstoßenden Kontaktteil der Kraftkurve statt, aber die Merkmale von Zinsen für das molekulare Ausdehnen werden in der Einfahrungskurve gefunden.

Abbildung 1.

Langkettige Moleküle, wie DNS oder Dextran, können zwischen die Spitze und die Probe ausgedehnt werden. Die Steifheits- und Ausdauerlänge kann vom Anfangsausdehnen des Moleküls gesehen werden. Interne molekulare Übergänge können, wie der schmelzende Übergang in DNS auch studiert werden, während das Rückgrat unter Hochspannung umordnet. Moleküle mit Maßzelle des Komplexes 3, wie vielen Proteinen, können auf eine esteuerte Art aufgeklappt werden, damit die Struktureinheiten nachgeforscht werden können. Titin und bacteriorhodopsin sind Beispiele von Proteinen, die steigernd studiert worden sind. Membranproteine können von der Membran ausgezogen werden, und das „Herausspringen“ aus einzelnen Alphahelixen heraus ist gesehen worden.

Eigenschaften von Makromolekülen in gelöster Form

Lange Moleküle sind in gelöster Form selten Gestänge ähnlich oder steif und haben häufig eine hohe Flexibilität entlang dem Rückgrat des Moleküls. Sogar wird doppelsträngige DNS, die normalerweise für ein „steifes“ Molekül wegen der Doppelhelixzelle gehalten wird, als gelegentliche Verwicklung für Längen über einigen hundert nm hinaus angeordnet. Dies heißt, dass es einen großen Unterschied zwischen der Länge des Moleküls gibt, das entlang der Kette gemessen wird oder Rückgrat (die Konturnlänge) und die typischen Abmessungen, die es in gelöster Form (z.B. der Radius der Drehung oder der aufeinander folgenden Länge) besetzt, die viel kleiner sind.

Abbildung 2.

Die Anordnung wird schematisch in Abbildung 2. dargestellt. In Teil A, wird ein langes Molekül in einer erweiterten Anpassung gezeigt. In Teil B, wird eine andere Anpassung gezeigt, wo das Molekül in einer entspannten gelegentlichen Verwicklung ist, die eine viel kleinere seitliche Abmessung als die Konturnlänge besetzt. Es gibt viele mehr Anpassungen, die bis die ähnlich sind, die in B gezeigt wird, das für das Molekül als die Anpassungen erhältlich ist, die bis die ähnlich sind, die in A gezeigt wird, und dieses führt zu den Unterschied bezüglich der Entropie oder der freien Energie der verschiedenen Anpassungen.

Es gibt Kosten in der freien Energie, zum eines Moleküls von Anpassung B zu A heraus geradezurichten, da die Anzahl von erhältlichen in Verbindung stehenden Anpassungen verringert wird. Diese freie Energiedifferenz überträgt zu einer Kraft, die dem Geraderichten widersteht, und wirkt wie eine entropic „Feder“. Dieses ist im Gegensatz zu der Situation auf einer makroskopischen Schuppe, in der das Ziehen einer flexiblen Zeichenkette keine beträchtliche Kraft benötigt, bis es gerade ist und das tatsächliche Rückgrat ausgedehnt wird.

Wenn lange Moleküle gezogen werden, wird eine Kraft gefordert, um das Molekül in Richtung zu einer geraden Anpassung auszudehnen, selbst wenn die Anleihen im Rückgrat nicht ausgedehnt werden.

Entropic Elastizität

Zwei grundlegende Baumuster sind für diese entropic Elastizität allgemein verwendet und abhängen, ob etwas Kettensteifheit enthalten ist. Im frei verbundenen Ketten (FJC)baumuster wird das Rückgrat als kleine Geräte geformt, die durch vollständig „freie“ Gelenke angeschlossen werden, damit anliegende Geräte jeden möglichen Winkel zwischen ihnen ohne Extraenergiekosten haben können. Das Endlosschraube ähnliche Ketten (WLC)baumuster ist demgegenüber ein kontinuierlicher Faden mit Kettensteifheit eingebaut und ist ein besseres Baumuster für Moleküle wie doppelsträngige DNS. Eine Ausdauerlänge wird definiert, die die Länge der Kette darstellt, über der die Anfangsorientierung randomisiert wird.

Wenn eine Kraftextension Kurve montiert wird, dann kann sie durch eins dieser Baumuster, um die Länge des Moleküls zu erhalten, das ausgedehnt wird, und die Ausdauerlänge für das WLC-Baumuster befestigt werden.

Einige fachkundige Moleküle, wie Proteine, haben normalerweise eine definierte (gefaltete) dreidimensionale Zelle in gelöster Form. Diese Zelle ist die Taste zu ihrer biologischen Funktion als Enzyme oder Struktureinheiten, zum Beispiel. Die Polypeptidkette ist kein entspannter loser Ring, aber wird in eine viel steifere Zelle gefaltet und gehalten durch viele Anleihen zusammen. Wenn das Protein, durch Kraft, Chemikalie aufgeklappt wird, oder Thermal ändert, dann benimmt sich die freie Polypeptidkette wie ein einfaches lineares Molekül. Das entropic Ausdehnen kann gesehen werden, da die Anleihen entlang dem Polypeptidrückgrat in hohem Grade flexibel sind. Definierte Teile der Proteinzelle, wie Alphahelixe oder kugelförmige Gebiete, können sequenziell aufgeklappt werden, und die gemessene „freie“ Länge des Moleküls, das auf den ausdehnenden Kurven basiert, erhöht mit jedem Ausbreitenereignis. Die Proteinausbreitenschritte liefern Informationen über die Normal gefaltete Zelle und seine Versagenvorrichtungen.

Xanthan - Einfaches Molekulares Ausdehnen

Xanthan ist ein bakterielles Polysaccharid, mit einem molekularen Rückgrat, das zur Zellulose identisch ist. Die chemischen Eigenschaften der Seitengruppen geben dem Polymer viele industriellen Anwendungen, von Nahrungsmittelstabilisierung zu Schmierölbergung.

Wenn das Xanthanmolekül zwischen die Spitze und die Oberfläche ausgedehnt wird, haben die kurzen Seitengruppen keine erhebliche Auswirkung auf die elastischen Eigenschaften, und das Verhalten ist einer einzelnen (carboxymethylated) Zellulosekette ähnlich. Xanthanpolymere des Hohen Molekulargewichts können Längen einiger Mikrons haben, und die ausdehnenden Kurven können für einfache molekulare Extension als Beispiel verwendet werden. Für niedrige Kräfte wird die Kette gegen die entropic Feder ausgedehnt. Zu einem bestimmten Zeitpunkt während die aufeinander folgende Länge der Konturnlänge sich nähert, wird die Elastizität der Rückgratselastizität wichtig.

Abbildung 3 zeigt die Einfahrungskurve eines einzelnen Xanthanmoleküls, das ausgedehnt wird (in einer Phosphatpufferlösung) unter Verwendung des NanoWizard® FLUGHANDBUCHS. Der freitragende Ausschlag ist unter Verwendung der Methode des thermischen Rauschens kalibriert worden.

Für Vergleich mit den Baumustern, muss der Spitzeprobe Abstand für den Ausschlag des Kragbalkens auch korrigiert werden, um einen wirklichen Trennungswert zu erhalten, der hier gezeigt wird. Eine größere negative Kraft entspricht der Spitze, die mehr in Richtung zur Oberfläche und folglich zu einer höheren extensional Kraft auf dem Molekül abgelenkt wird.

Abbildung 3.

Eine Kurve vom erweiterten FJC-Baumuster wird auch in der Abbildung 3 für Vergleich gezeigt, berechnet unter Verwendung einer Kuhn-Länge von 6 nm und einer Konturnlänge von 1,25 Mikrons. Der Sitz für das einfache FJC- oder WLC-Baumuster war für kleine extensional Kräfte (unter um 50pN in diesem Fall) angemessen, aber die Kurven liefen an den höheren Kräften auseinander. Folglich wurde das erweiterte FJC-Baumuster mit der zusätzlichen Abschnittelastizität verwendet, um das Rückgrat zu berücksichtigen, das an den höheren extensional Kräften ausdehnt.

Im Falle des Xanthans wird ein einzelnes langes Link zwischen der Spitze und der Oberfläche ausgedehnt. Da das Molekül so lang ist, ist die Kraft, zum es auszudehnen für viel der ausdehnenden Kurve sehr klein, und das Verhalten wird durch die Hochkraft beherrscht, die ausdehnt, wohin die ausgedehnte Länge nahe der Konturnlänge ist. Für mehr Komplex gefaltete Moleküle wie Proteine, werden eine Reihe dieser ausdehnenden Ereignisse im Allgemeinen gesehen, während verschiedene Teile der Zelle erweitert aufklappen und sind.

Bacteriorhodopsin - Extraktion und Ausbreiten

Bacteriorhodopsin ist ein integrales Membranprotein von den bakteriellen Zellen, das Energie für die Zellen von den hellen Photonen erzeugt. Es gibt 7 Transmembrane Alphahelixe, mit mehr durcheinandergebrachten Peptidregelkreisen zwischen ihnen.

Wenn ein Ende des Proteins und gezogen gefasst wird, dann werden die Alphahelixe von der Membran ausgezogen, und sie klappen auf, während sie ausgezogen werden.

Purpurrote Membran ist die natürliche Quelle für bacteriorhodopsin und besteht 25% Lipiden und aus 75% bacteriorhodopsin. Das Protein wird als Trimere in einer dimensionalkristallstruktur 2, die unter Verwendung des FLUGHANDBUCHS abgebildet sein kann, wie in Abbildung 4 gezeigt angeordnet (Beispielhöflichkeit von D.J. Müller, TechnicalUniversityDresdenGermany

Abbildung 4.

Ein schematisches Diagramm des Ausbreitenprozesses wird in Abbildung 5. gezeigt. Die sieben Alphahelixe werden in Teil A gezeigt, wenn die FLUGHANDBUCH-Spitze ein Ende aufhebt (Anmerkung, die im tatsächlichen Protein, die Alphahelixe werden gruppiert zusammen in einem Bündel, keine Zeile). Es gibt viele möglichen Ausbreitenbahnen, aber die höchstwahrscheinlichen Ereignisse sind, dass die alphahelices in den Paaren ausgezogen werden. Eine Weiterentwicklung von drei teilweise entfalteten Zuständen wird in Teil B von Abbildung 5 gezeigt, mit Paaren Alphahelixen aufklappend, während sie von der Membran extrahiert werden.

Abbildung 5.

Abbildung 6 zeigt einen Superposition von 10 bacteriorhodopsin Ausbreitenkurven, wenn die Kraft gegen die korrigierte Spitzeprobe Trennung grafisch dargestellt ist. Es gibt etwas Beitritt, da die Spitze die Oberfläche verlässt, gefolgt von Hauptausdehnen drei und Aufklappenereignisse, entsprechend den drei Zuständen, die in der Abbildung 5 B. gezeigt werden. Die Hauptspitzen sind um 20-30nm, 40-50nm und 60-80nm, die gut mit den Werten übereinstimmen, die in der Literatur veröffentlicht werden. Der Kragbalken wurde unter Verwendung der Methode des thermischen Rauschens und der Experimente, die unter Buffer durchgeführt wurden kalibriert (10mM TRIS, 150mM KCl, pH 7,6).

Die genaue Stellung der Bondfehlerereignisse schwankt von Kurve zu Kurve, die für Anleihen mit Energie nah an Wärme bei Zimmertemperatur typisch ist. Die ausdehnenden Teile der Kurven überlagerten in der Abbildung 6 und zeigten, dass die gleichen Zellen in jedem Fall ausgedehnt werden. Nur der tatsächliche Moment, als der ausgedehnte Anleihenbruch von Kurve zu Kurve schwankt. Für ein Anleihe mit Energie nahe der Wärme, gibt es irgendeine Wahrscheinlichkeit von ihr ausfallend innerhalb einer bestimmten Zeit, sogar ohne angewandte Kraft. Dieses entspricht dem normalen „AusRate“, der frei für die verbindliche Reaktion in gelöster Form gesehen wird. Für Anleihen mit Energie erhöht wenig über der Wärme, die normalerweise stabil sind, die Wahrscheinlichkeit von ihnen spontan ausfallend, während eine Kraft angewandt ist.

Abbildung 6.

Eine Möglichkeit, an ein ausdehnendes Ereignis zu denken ist deshalb, dass die Anleihen belastet sind, bis die Energiesperre zum Aufklappen innerhalb des thermischen Bereiches ist. Der tatsächliche Moment, wenn die Anleihen plötzlich ausfallen, hängt von einem gelegentlichen thermischen Fluktuieren ab, das das Molekül über der Ausbreitenenergiesperre nimmt. Die Zeitabhängigkeit bedeutet, dass die gemessene Aufklappenkinetik von der Belastungsrate abhängt, oder die Drehzahl, mit der die Spitze das freie Ende des Moleküls zieht.

Abbildung 7.

Viele Ausbreitenkurven von bacteriorhodopsin können montiert werden, um eine statistische Ansicht der Ausbreitenereignisse zu geben. Das Molekül klappt auf einige Arten auf, also muss irgendeine Auswahl in den Kraftkurven gemacht werden, um eine bestimmte Teilmenge zu wählen. In diesem Fall wurden die nur Kurven, welche die drei ausdehnenden Hauptereignisse, wie die Beispiele in Abbildung 6 zeigen, ausgewählt. In Abbildung 7 wird ein Histogramm dargestellt und zeigt die Spitzeprobe Trennungsverteilung für die drei Spitzen (Daten für N = 355 Kurven). Die Kraftkurvenanalyse wurde teilweise unter Verwendung der PUNIAS-Software durchgeführt.

Abbildung 8.

Abbildung 8 zeigt einen Streuungsplan der Ausbreitenkraft gegen die Stellung des Ereignisses für die gleiche Datei wie in Abbildung 7. Die Kraft für das erste Ausbreitenereignis (Spitze 1) ist beträchtlich höher als für die nachfolgenden Ereignisse (Spitzen 2 und 3). Sobald die Proteinzelle gestört worden ist, dann wird die Kraft, die benötigt wird, um die restlichen Alphahelixe die Membran herauszuziehen, verringert. Die Ausbreitenkurven zeigen auch verschiedene Bahnen, damit das Molekül von der Membran aufklappt und auszieht. Von Kenntnissen der Kettenlängen der Proteinzelle und -aminosäure, können die extensional Kurven befestigt werden, um offenbar zu zeigen, welchem Ausbreitenpfad eine bestimmte Kraftkurve eingelassen wird.

Titin-Ausbreiten

Titin ist ein Protein vom Muskelgewebe, das aus einigen wiederholten kugelförmigen Gebieten besteht. Innerhalb des Muskelgewebes ist es für die mechanischen Eigenschaften auf einer makroskopischen Schuppe verantwortlich. Das FLUGHANDBUCH erlaubt die Studie der nanomechanical Eigenschaften einzelner titin Moleküle. Da das Molekül ausgedehnt wird, zu einem bestimmten Zeitpunkt fallen die Anleihen, die ein bestimmtes Gebiet zusammen anhalten, aus. Dieses bestimmte kugelförmige Gebiet klappt dann auf und führt zu eine längere Konturnlänge für das Molekül. Mit weiter ziehen wird dieses Kapitel von linearen Aminosäuren auch ausgedehnt, und eins der anderen Gebiete erreicht seine Schwachstelle. Dieses wird schematisch in Abbildung 9. dargestellt.

Abbildung 9.

Während das Protein gezogen wird, „springen“ die Gebiete sich öffnen sequenziell heraus und führen zu eine charakteristische Reihenfolge von Spitzen im Ausschlag, kurvt. Die Form jedes aufeinander folgenden gebogenen Teils des Kraftplans reflektiert die erhöhte Nutzlänge des Moleküls, während die Gebiete aufgeklappt werden.

Eine typische titin Extensions-Kraftspektroskopie fahren Kurve wird gezeigt in Abbildung 10 ein (Datenhöflichkeit von Matthias Amrein, Universität von Calgary, von Kanada, erreicht unter Verwendung des NanoWizard® FLUGHANDBUCHS auf einem einzelnen titin Ig8 Muskelprotein). Die charakteristische titin Reihenfolge von Ausbreitenereignissen kann offenbar gesehen werden. Die Kraftzunahmen ständig, als die Spannkraft des Moleküls erhöht. Plötzlich verringert sich die Kraft scharf, während Knalle eines Ig-Gebietes sich öffnen und die Spannung gelöst wird. Die Kurve jeder ausdehnenden Region kann mit dem FJC- oder WLC-Baumuster für die entsprechende Länge der freien Aminosäure befestigt werden. Die Größe der Ausbreitenkraft für ein einzelnes Gebiet ist im Bereich von 190-250pN, und die Konturnlänge von einem Gebiet (Spitzen-Spitzenabstand) ist 28nm.

Abbildung 10. von).

Anwendungen

Eine große Vielfalt von Proteinen kann unter Verwendung des FLUGHANDBUCHS ausgedehnt werden und aufgeklappt werden. Zwei Beispiele sind hier, ein Membranprotein und ein zellplasmatisches Protein gezeigt worden. Diese Methode kann auf andere Proteine, zu den Verstärkungsinformationen über die normale Proteinzelle und seine Versagenmodi ausgedehnt werden. Im Falle des bacteriorhodopsin bildet das Protein sehr in hohem Grade gepackte Zellen in der bakteriellen Zellwand und also ist eins der wenigen Membranproteine, die für hochauflösende strukturelle Bestimmung kristallisiert werden können.

Diese Methode kann im Allgemeinen angewandt sein, jedoch. Für die meisten Membranproteine ist die Aminosäurereihenfolge viel einfacher als die gefaltete Zelle zu bestimmen, da die meisten Membranproteine nicht für Kristallisation geeignet sind.

Die Ausbreitenereignisse, die mit dem FLUGHANDBUCH gemessen werden, die die Änderung in der Aminosäurelänge zeigen, während verschiedene Struktureinheiten aufklappen, können mit der bekannten Reihenfolge verwendet werden, um die tertiäre Zelle von Membranproteinen zu übersetzen. Spezifische Beschichtung des Fühlers und Modifikation des Proteins zum Haben von spezifische „Aufnahmen“ Punkte können führen zu das Ziehen des Proteins an den verschiedenen Einbauorten und folglich an der weiteren Information über, wie die Struktureinheiten zusammen in der 3-D Zelle angeschlossen werden.

So ist FLUGHANDBUCH in der Lage, Einblick in die Konfiguration eines einzelnen Moleküls zu geben und ein unabhängiges Maß von molekularen Eigenschaften molekulare Formungstechniken weiter entwickeln zu lassen. FLUGHANDBUCH kann mit einzelnen Molekülfluoreszenztechniken wie TIRF oder GITTERWERK auch kombiniert werden.

Quelle: JPK-Instrumente

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte JPK-Instrumente

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:52

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