NMR-Spektroskopie und Röntgenstrukturanalyse sind derzeit die am häufigsten verwendeten Techniken ermöglicht die Bestimmung der Strukturen von biologischen Makromolekülen wie Proteine und Nukleinsäuren auf atomarer Ebene der Auflösung. Das Rasterkraftmikroskop (AFM) ist vor allem für seine Imaging-Funktionen bekannt, aber es ist auch ein sehr empfindliches Instrument zur quantitativen Messung von Kräften auf einem einzelnen Molekül. Diese Fähigkeit ermöglicht den Einsatz von AFM als alternative Technik zur Untersuchung der strukturellen Konfiguration von Makromolekülen unter nativen Bedingungen. Messen von Kräften innerhalb und zwischen den einzelnen Molekülen bietet einen weiteren Ansatz zum Verständnis der molekularen Energie Landschaften und chemischen Reaktionskinetik. Die AFM messen können einzelne Anleihen bilden und zu brechen, anstatt auf statistische Durchschnittswerte über eine Bevölkerung beschränkt. Dieser Bericht konzentriert sich auf die Verwendung des AFM, einzelne Moleküle zu manipulieren, um Informationen über die molekulare Struktur oder Konformation, und intramolekularen Bindungskräfte zu extrahieren. Es ist auch möglich, zeitabhängige Phänomene, wie intramolekulare Dynamik in Makromolekülen, molekulare Erkennung oder Proteinfaltung in situ zu untersuchen. Molecular Stretching Experimente Force-Spektroskopie ist eine AFM-Modus, bei dem die Spitze nach oben und nach unten bewegt wird über einen einzigen Punkt auf der Oberfläche, während die Ablenkung oder andere Cantilever Eigenschaften gemessen werden. Das gibt ein Profil der Kräfte in verschiedenen Höhen über der Oberfläche. In der molekularen Stretching Experimente, die Spitze ist in der Regel in Kontakt mit der Oberfläche gebracht, sind die Moleküle auf dem Substrat erlaubt, mit der Spitze zu interagieren, und dann den Ausleger eingefahren ist. Diese Bewegung ist schematisch in der Bildserie in Abbildung 1 dargestellt - auf die Probe (das Konzept) und dann wieder weg (das Einfahren). Da der Ausleger von der Oberfläche weg bewegt wird, spiegelt die Ablenkung der Kräfte zwischen Spitze und Oberfläche. Wenn ein einzelnes Molekül zwischen der Spitze und der Oberfläche gehalten wird, dann ist die Auslenkung des Cantilevers liefert ein Maß für die Kraft auf das Molekül ausgeübt. In der schematischen Darstellung in Abbildung 1 ist ein einzelnes Molekül gezeigt, dass zwischen der Spitze und dem Substrat gestreckt. Das Molekül kann eine definierte dreidimensionale Struktur gefaltet, wie Proteine, zum Beispiel, oder es kann eine ungeordnete Kette, wie viele andere lange Polymere sein. Der Klebstoff Wechselwirkung zwischen Spitze und das Molekül erfolgt in der Regel in die abstoßende kontaktieren Teil der Kraftkurve, aber die Features von Interesse für die molekulare Stretching sind in der Kurve einfahren gefunden.  Abbildung 1. Schematische Darstellung einer Kraft-Experiment, wo die AFM-Spitze verwendet, um ein einzelnes Molekül Strecke ist Langkettige Moleküle wie DNA oder Dextran, kann zwischen der Spitze und der Probe gestreckt werden. Die Steifigkeit und Beharrlichkeit Länge kann von der ersten Streckung des Moleküls zu sehen. Interne molekularen Übergängen kann auch untersucht werden, wie das Abschmelzen Übergang in DNA als Rückgrat unter höherer Spannung umlagert. Moleküle mit komplexen 3-dimensionalen Struktur, wie viele Proteine, können in einer kontrollierten Art und Weise entfaltet werden, so dass die strukturellen Einheiten untersucht werden können. Titin und Bakteriorhodopsin sind Beispiele für Proteine, die intensiv studiert haben. Membranproteine können aus der Membran gezogen werden, und die "Pop" aus einzelnen alpha-Helices gesehen worden ist. Eigenschaften von Makromolekülen in Lösung Lange Moleküle in Lösung sind selten stab-oder steif, und haben oft eine hohe Flexibilität entlang der Hauptkette des Moleküls. Auch doppelsträngigen DNA, die in der Regel der als "steif" Molekül, weil der Doppelhelix-Struktur gedacht, als eine zufällige Knäuel für Längen über ein paar hundert Nanometer angeordnet. Dies bedeutet, dass es einen großen Unterschied zwischen der Länge des Moleküls entlang der Kette oder Backbone (der Kontur Länge) und die typischen Dimensionen einnimmt in Lösung (z. B. der Trägheitsradius oder die End-to-End-Länge) gemessen, die sind viel kleiner.  Abbildung 2. Schematische Darstellung von zwei möglichen Konformationen ein langes Molekül. In A ist das Molekül in eine unwahrscheinliche Konformation eines Moleküls in Lösung gespannt. B zeigt eine typische Konformation, wo das Molekül in eine ungeordnete Durcheinander. Die Anordnung ist schematisch in Abbildung 2 dargestellt. In Teil A, ist ein langes Molekül in einer gestreckten Konformation gezeigt. In Teil B, ist eine andere Konformation gezeigt, wo das Molekül in einer entspannten zufälligen Gewirr, dass eine viel kleinere laterale Ausdehnung als die Kontur Länge einnimmt. Es gibt viele weitere Konformationen ähnlich dem in B zur Verfügung, um das Molekül als Konformationen ähnlich der in A gezeigten, und dies führt zu dem Unterschied in der Entropie oder freie Energie der verschiedenen Konformationen. Es ist eine kostengünstige der freien Energie zu begradigen eines Moleküls aus Konformation B nach A, da die Anzahl der verfügbaren verwandten Konformationen wird reduziert. Diese freie Energie Unterschied entspricht einer Kraft, die Begradigung widersteht, und verhält sich wie eine entropische "Frühling". Dies steht im Gegensatz zu der Situation auf einer makroskopischen Skala, wo das Ziehen eines flexiblen string nicht erforderlich ist eine bedeutende Kraft, bis es gerade ist und das eigentliche Rückgrat gestreckt wird. Bei langen Moleküle gezogen werden, ist eine Kraft erforderlich, um das Molekül zu einer geraden Konformation verlängern, auch wenn die Bindungen in der Hauptkette nicht gedehnt werden. Entropieelastizität Zwei grundlegende Modelle sind üblicherweise für diesen Entropieelastizität verwendet, je nachdem, ob einige Kettensteifigkeit enthalten ist. In der frei gegliederten Kette (FJC)-Modell, ist das Rückgrat als kleine Einheiten völlig "freien" Gelenke verbunden modelliert, so dass benachbarte Einheiten können beliebige Winkel zwischen ihnen ohne zusätzliche Energie gekostet haben. Der Wurm-ähnliche Kette (WLC)-Modell, ist dagegen ein kontinuierliches Filament mit Kettensteifigkeit gebaut und ist ein besseres Modell für Moleküle wie doppelsträngige DNA. Ein Persistenzlänge wird definiert, welche die Länge der Kette, über die die erste Orientierung ist randomisiert. Wenn eine Kraft-Dehnungs-Kurve erhoben werden, dann kann es durch eines dieser Modelle, um die Länge des Moleküls gestreckt zu erhalten, und die Persistenz Länge für den WLC-Modell eingebaut werden. Einige spezialisierte Moleküle, wie Proteine, haben in der Regel eine definierte (gefaltet) dreidimensionale Struktur in Lösung. Diese Struktur ist der Schlüssel zu ihrer biologischen Funktion als Enzyme oder strukturellen Einheiten, zum Beispiel. Die Polypeptidkette ist nicht eine entspannte lose Spule, sondern in einem viel steiferen Struktur gefaltet und zusammen gehalten durch viele Bindungen. Ist das Protein entfaltet, mit Gewalt, chemische oder thermische Veränderungen, dann ist die freie Polypeptidkette verhält sich wie ein einfaches lineares Molekül. Die entropischen Stretching zu sehen, wie die Bindungen entlang der Polypeptidrückgrat sehr flexibel sind. Definierte Teile der Proteinstruktur, wie alpha-Helices oder globulären Domänen, können nacheinander entfaltet werden, und die gemessene "freien" Länge des Moleküls auf die Dehnung Kurven wird mit jedem Entfaltung Veranstaltung zu erhöhen. Das Protein entfaltet Schritte geben Auskunft über den normalen gefaltete Struktur und ihre Versagensmechanismen. Xanthan - Einfache molekulare Stretching Xanthan ist eine bakterielle Polysaccharid, mit einer molekularen Rückgrat identisch mit Zellulose. Die chemischen Eigenschaften der Seitengruppen verleihen dem Polymer vielen industriellen Anwendungen, von der Nahrung Stabilisierung Ölgewinnung. Wenn die Xanthan-Molekül zwischen der Spitze und der Oberfläche gestreckt wird, führen Sie die kurze Seite Gruppen keinen signifikanten Einfluss auf die elastischen Eigenschaften und das Verhalten ist vergleichbar mit einem einzigen (carboxymethylierten) Cellulose-Kette. Hochmolekulare Xanthan Polymere können Längen von mehreren Mikrometern, und die Dehnung Kurven kann als Beispiel für eine einfache molekulare Erweiterung verwendet werden. Für niedrige Kräfte, wird die Kette gegen den entropischen Feder gespannt. An einem gewissen Punkt, da die End-to-End-Länge nähert sich der Kontur Länge, wird die Elastizität der Wirbelsäule Elastizität wichtig. Abbildung 3 zeigt die Kurve einfahren eines einzelnen Xanthan Molekül gestreckt (in einem Phosphat-Puffer-Lösung) mit dem NanoWizard ® AFM. Die Federauslen kalibriert wurde mit dem thermischen Rauschen Methode. Zum Vergleich mit den Modellen, müssen die Spitzen-Proben-Abstand auch für die Auslenkung des Cantilevers korrigiert werden, um eine wirkliche Trennung Wert, der hier gezeigt zu erhalten. Eine größere negative Kraft entspricht der Spitze abgelenkt mehr an die Oberfläche und damit eine höhere extensional Kraft auf das Molekül.  Abbildung 3. Force-Spektroskopie einfahren Kurve aus einem einzigen Molekül Xanthan gestreckt. Eine Kurve für den erweiterten FJC-Modell ist auch zum Vergleich dargestellt. Eine Kurve aus dem erweiterten FJC-Modell ist auch in Abbildung 3 zum Vergleich gezeigt, berechnet unter Verwendung eines Kuhn Länge von 6 nm und eine Kontur Länge von 1,25 Mikron. Die fit für die einfache FJC oder WLC-Modell war angemessen für kleine extensional Kräfte (unter etwa 50pN in diesem Fall), aber die Kurven auseinander bei höheren Kräften. Daher die erweiterten FJC-Modell mit den zusätzlichen Segment Elastizität verwendet wurde, zu berücksichtigen, die das Rückgrat Stretching bei höheren extensional Kräfte zu nehmen. Im Falle von Xanthan ist ein einziger langer Verbindung zwischen der Spitze und der Oberfläche gestreckt. Da das Molekül ist so lang, um die Kraft zu verlängern ist es sehr klein für einen Großteil der Strecken-Kurve, und das Verhalten wird durch die höhere Kraft Stretching denen die gestreckte Länge in der Nähe des Konturlänge dominiert. Für komplexere gefaltete Moleküle, wie Proteine, sind eine Reihe dieser Strecken Veranstaltungen in der Regel als verschiedene Teile der Struktur entfalten gesehen und erweitert werden. Bacteriorhodopsin - Extraktion und Entfaltung Bakteriorhodopsin ist ein integrales Membranprotein aus Bakterienzellen, die Energie erzeugt für die Zellen, die aus Photonen. Es gibt 7 transmembranen alpha-Helices, mit mehr unorganisiert Peptidschleifen zwischen ihnen. Wenn man Ende des Proteins begriffen ist und zog dann den alpha-Helices sind aus der Membran gezogen, und sie entfalten, wie sie herausgezogen werden. Purpurmembran ist die natürliche Quelle für Bakteriorhodopsin und besteht aus 25% Lipiden und 75% Bakteriorhodopsin. Das Protein wird als Trimere in einem 2-dimensionalen Kristallstruktur, die aufgenommen mit dem AFM werden können, wie in Abbildung 4 dargestellt (Probe mit freundlicher Genehmigung von DJ Müller angeordnet, Technisch Universität , Dresden , Deutschland . Die charakteristischen Trimer Form kann in das Bild zu sehen. Das Protein kann aufgenommen mit dem AFM und dann einzelne Proteine ausgewählt und zog mit der Spitze sein. Die Spitze kann speziell beschichtet werden, und die Moleküle modifiziert abholen einen bestimmten Teil der Struktur, oder die Spitze in die Oberfläche gedrückt werden abholen ein Molekül unspezifisch.  Abbildung 4. AFM Höhe Bild Purpurmembran (cytoplasmatische Seite), aufgenommen mit JPK NanoWizard ® in Kontakt-Modus in Pufferlösung (170nm x 100 nm, 1 nm Höhenbereich) Eine schematische Darstellung des sich entfaltenden Prozess ist in Abbildung 5 dargestellt. Die sieben alpha-Helices sind in Teil A dargestellt, mit der AFM-Spitze Aufnehmen einem Ende (beachten Sie, dass in der eigentlichen Protein, das alpha-Helices zusammen in einem Bundle, nicht eine Zeile zusammengefasst). Es gibt viele mögliche Entfaltungspfade, aber die wahrscheinlichste Ereignisse sind, dass die alphahelices aus paarweise gezogen. Ein Fortschreiten der drei teilweise entfalteten Zuständen in Teil B der Abbildung 5 dargestellt ist, mit Paaren von alpha-Helices Entfaltung, wie sie aus der Membran extrahiert werden.  Abbildung 5. Schematische Darstellung von Bakteriorhodopsin Entfaltung mit der AFM-Spitze. Ein Ende des Moleküls wird durch die Spitze (A) aufgenommen, und der alpha-Helices sind nacheinander paarweise gezogen (B). Abbildung 6 zeigt eine Überlagerung von 10 Bakteriorhodopsin Entfaltung Kurven, mit der Kraft aufgetragen gegen die korrigierten Spitzen-Proben-Trennung. Es gibt einige Haftung als die Spitze verlässt die Oberfläche, gefolgt von drei Strecken und aktuellen Ereignisse, entsprechend der drei Staaten in Abbildung 5 dargestellt B. Die wichtigsten Gipfel sind rund 20-30nm, 50nm und 40-60-80nm, die zustimmen gut mit den Werten in der Literatur veröffentlicht. Der Ausleger wurde unter Verwendung des thermischen Rauschens Methode, und die durchgeführten Experimente unter-Puffer (10 mM TRIS, 150 mM KCl, pH 7,6). Die genaue Position der Anleihe Fehlerereignisse variiert von Kurve zu Kurve, die typisch für Anleihen mit Energie nahe thermische Energie bei Raumtemperatur ist. Das Dehnen Teile der Kurven Overlay in Abbildung 6 zeigt, dass die gleichen Strukturen, die sich in jedem Fall gespannt. Nur der eigentliche Moment der gestreckten Bindungen zu brechen von Kurve zu Kurve ändert. Für eine Anleihe mit Energie in der Nähe der thermischen Energie, besteht eine gewisse Wahrscheinlichkeit davon andernfalls innerhalb einer bestimmten Zeit, auch ohne Krafteinwirkung. Dies entspricht dem normalen "off-rate" für die Bindungsreaktion frei in Lösung gesehen. Bei Anleihen mit Energien ein wenig über die thermische Energie, die normalerweise stabil sind, ist die Wahrscheinlichkeit von ihnen andernfalls spontan erhöht als eine Kraft aufgebracht wird.  Abbildung 6. Unfolding Kurven von Bakteriorhodopsin wird aus Purpurmembran (Überlagerung von 10 einfahren Kurven) gezogen. Ein Weg, der eine Streckung Ereignis zu denken, ist daher, dass die Anleihen belastet werden, bis die Energie Hindernis für Entfaltung innerhalb der thermischen Bereich. Der eigentliche Moment, wenn die Anleihen plötzlich ausfällt, hängt von einer zufälligen thermischen Schwankungen, die das Molekül übernimmt die Entfaltung Energiebarriere. Die Zeitabhängigkeit bedeutet, dass die gemessene Entfaltung Rate wird auf der Ladefläche Rate oder die Geschwindigkeit, mit der die Spitze ziehen das freie Ende des Moleküls ab.  Abbildung 7. Histogramm der Position der drei Entfaltung Gipfel (Spitze Probe korrigiert Trennung) für eine Menge von 355 Bakteriorhodopsin Entfaltung Kurven. Viele Entfaltung Kurven von Bakteriorhodopsin kann gesammelt werden, um eine statistische Blick auf die aktuellen Ereignisse zu geben. Das Molekül kann auf verschiedene Weise zu entfalten, so dass einige Auswahl hat, um in der Kraft-Kurven vorgenommen werden, um eine bestimmte Untergruppe wählen. In diesem Fall wurden nur Kurven, welche die drei wichtigsten Strecken Veranstaltungen, wie die Beispiele in Abbildung 6, ausgewählt. In Abbildung 7 ein Histogramm wird, aus der Spitzen-Proben-Abstand Verteilung für die drei Gipfel (Daten für n = 355 Kurven). Die Kraftkurve Analyse wurde teilweise mit Hilfe des PUNIAS Software.  Abbildung 8. Streudiagramm von Gewalt gegen Position (Spitze-Probe korrigiert Trennung) für die aktuellen Ereignisse in Abbildung 6 dargestellt. Abbildung 8 zeigt ein Streudiagramm der Entfaltung Kraft gegen die Position des Ereignisses für die gleichen Daten wie in Abbildung 7 dargestellt. Die Kraft für die erste Entfaltung Veranstaltung (Peak 1) ist deutlich höher als für die nachfolgenden Ereignisse (Peaks 2 und 3). Sobald die Protein-Struktur wurde aufgebrochen, dann ist die erforderliche Kraft, um die restlichen alpha-Helices herausziehen der Membran reduziert wird. Die Entfaltung Kurven zeigen auch verschiedene Wege für das Molekül zu entfalten, und ziehen Sie aus der Membran. Aus der Kenntnis der Proteinstruktur-und Aminosäure-Kettenlängen, kann der extensionalen Kurven ausgestattet, zeigen deutlich, welche Entfaltung Weg in eine bestimmte Kraft-Kurve entnommen werden. Titin Unfolding Titin ist ein Protein aus dem Muskelgewebe, das aus mehreren wiederholten globulären Domänen besteht. Innerhalb des Muskelgewebes ist verantwortlich für die mechanischen Eigenschaften auf makroskopischer Ebene. Die AFM ermöglicht die Untersuchung der nanomechanischen Eigenschaften einzelner Moleküle Titin. Wie ist das Molekül gestreckt, an einem gewissen Punkt die Bindungen, die eine bestimmte Domäne gemeinsam scheitern. Diese besondere globuläre Domäne entfaltet sich dann, was zu einer längeren Konturlänge für das Molekül. Mit weiterem Ziehen, ist dieser Abschnitt der linearen Aminosäuren auch gespannt, und einer der anderen Domänen wird ihr Scheitern Punkt zu erreichen. Dies ist schematisch in Abbildung 9 dargestellt.  Abbildung 9. Schematische Darstellung der Titin-Stretching, als aufeinander globulären Domänen entfalten. Da das Protein gezogen wird, die Domains "pop" nacheinander öffnen, was zu einer charakteristischen Sequenz von Peaks in der Ablenkung Kurven. Die Form der einzelnen aufeinander folgenden gebogenen Teil der Kraft Handlung spiegelt die größere effektive Länge des Moleküls als die Domains entfaltet werden. Ein typisches Titin Erweiterung Kraftspektroskopie einfahren Kurve in Abbildung 10 dargestellt (mit freundlicher Genehmigung von Matthias Amrein, University of Calgary, Kanada, erhalten mit dem NanoWizard ® AFM auf einer einzigen IG8 Titin Muskelprotein). Die charakteristische Abfolge von Titin entfaltenden Ereignisse ist deutlich zu erkennen. Die Kraft nimmt stetig zu, da die Spannung im Molekül erhöht. Plötzlich wurde die Kraft stark abnimmt als Ig-Domäne aufspringt und die Spannung löst sich. Die Kurve der einzelnen verlaufenden Bereich kann mit dem FJC oder WLC-Modell für die entsprechenden freien Aminosäuren Länge ausgestattet werden. Die Größe des sich entfaltenden Kraft für eine einzelne Domain wird im Bereich von 190-250pN, und die Kontur Länge einer Domain (peak-to-Peak-Abstand) ist 28nm.  Abbildung 10. Kraftkurve von Titin Stretching, zeigt sequentielle Entfaltung der globulären Domänen (mit freundlicher Genehmigung von Matthias Amrein, Universität von Calgary ). Anwendungen Eine Vielzahl von Proteinen kann gedehnt und entfaltet werden mit dem AFM. Zwei Beispiele wurden hier gezeigt, eine Membran-Protein und einem cytoplasmatischen Protein. Diese Methode kann zu anderen Proteinen erweitert werden, um Informationen über die normale Protein-Struktur und seine Versagensarten zu gewinnen. Im Fall von Bakteriorhodopsin, bildet das Protein sehr hoch gepackte Strukturen in der bakteriellen Zellwand, und so ist eine der wenigen Membranproteine, die für hochauflösende Strukturbestimmung kristallisiert werden kann. Diese Methode kann allgemein angewendet werden, jedoch. Für die meisten Membranproteine, ist die Aminosäure-Sequenz viel leichter zu bestimmen als die gefaltete Struktur, da die meisten Membranproteine sind nicht geeignet für die Kristallisation. Unfolding Veranstaltungen mit der AFM, die die Veränderung der Aminosäure Länge wie unterschiedliche Struktureinheiten entfalten zeigen, gemessen mit der bekannten Sequenz verwendet werden, um die Tertiärstruktur von Membranproteinen zu interpretieren. Spezielle Beschichtung der Sonde und Modifikation des Proteins auf bestimmte "pick-up" Punkte haben können, zum Ziehen des Proteins an unterschiedlichen Standorten und damit weitere Informationen über die strukturellen Einheiten sind in der 3-D-Struktur verbunden führen. So AFM in der Lage ist, einen Einblick in die Konfiguration eines einzelnen Moleküls zu geben und damit eine unabhängige Messung von molekularen Eigenschaften zu Molecular Modelling-Techniken zu verfeinern. AFM kann auch mit einzelnen Fluoreszenz-Techniken wie TIRF oder FRET kombiniert werden. |