Espectroscopía de RMN y cristalografía de rayos X son actualmente las técnicas más comunes capaces de determinar las estructuras de macromoléculas biológicas como las proteínas y ácidos nucleicos a nivel atómico de resolución. El microscopio de fuerza atómica (AFM) es sobre todo conocido por sus capacidades de imagen, pero también es una herramienta muy sensible para la medición cuantitativa de fuerzas a nivel sola molécula. Esta capacidad permite el uso de AFM como una técnica alternativa para la investigación de la configuración estructural de las macromoléculas en condiciones nativas. La medición de fuerzas dentro y entre las moléculas individuales proporciona otro enfoque para la comprensión de los paisajes de la energía cinética molecular y de la reacción química. El AFM puede medir bonos individuales formación y ruptura, en lugar de estar limitado a los promedios estadísticos sobre la población. Este informe se centra en el uso de la AFM para manipular moléculas individuales para obtener información sobre la estructura molecular o conformación, y fuerzas de unión intramolecular. También es posible el estudio de los fenómenos dependientes de tiempo, como la dinámica intramolecular en las macromoléculas, reconocimiento molecular o el plegamiento de proteínas in situ. Los experimentos de estiramiento molecular Espectroscopia de la fuerza es un modo de AFM donde se mueve la punta hacia arriba y hacia abajo por encima de un solo punto en la superficie, mientras que la desviación u otras propiedades en voladizo se miden. Esto le da un perfil de las fuerzas a diferentes alturas sobre la superficie. En molecular experimentos de estiramiento, la punta es por lo general entran en contacto con la superficie, las moléculas del sustrato se les permite interactuar con la punta, y luego se retractó de la ménsula es. Este movimiento se muestra esquemáticamente en la serie de imágenes en la Figura 1 - hacia la muestra (el método) y luego otra vez de distancia (de retracción). A medida que el voladizo se aleja de la superficie, refleja la desviación de las fuerzas entre la punta y la superficie. Si una sola molécula se lleva a cabo entre la punta y la superficie, entonces la deflexión del cantilever da una medida de la fuerza ejercida sobre la molécula. En el diagrama esquemático en la Figura 1, una sola molécula se muestra que se extiende entre la punta y el substrato. La molécula puede tener una estructura plegada definido tres dimensiones, como las proteínas, por ejemplo, o puede ser una cadena desordenada, como muchos otros polímeros largos. La interacción adhesiva entre la punta y la molécula por lo general se lleva a cabo en la parte de contacto de repulsión de la curva de la fuerza, pero las características de interés para el estiramiento molecular se encuentran en la curva de retractarse.  Figura 1. Esquema de un experimento de espectroscopia de fuerza donde se utiliza la punta del AFM para estirar una sola molécula Moléculas de cadena larga, como el ADN o el dextrano, se puede estirar entre la punta y la muestra. La rigidez y la persistencia de longitud se puede ver en el estiramiento inicial de la molécula. Transiciones internas molecular también pueden ser estudiados, como la transición de fusión en el ADN como la columna vertebral se reorganiza bajo mayor tensión. Las moléculas complejas en 3 dimensiones la estructura, como muchas proteínas, puede ser desarrollado de una manera controlada para que las unidades estructurales pueden ser investigados. Titin y bacteriorodopsina son ejemplos de proteínas que han sido intensamente estudiados. Proteínas de la membrana se puede sacar de la membrana, y el "estallido" de cada hélices alfa se ha visto. Xantana - molecular simple estiramiento Xantana es un polisacárido bacteriano, con una estructura molecular idéntica a la celulosa. Las propiedades químicas de los grupos laterales dar el polímero industrial muchas aplicaciones, desde la estabilización de alimentos para la recuperación de petróleo. Cuando la molécula de xantano se extiende entre la punta y la superficie, los grupos secundarios a corto no tienen un efecto significativo en las propiedades elásticas, y el comportamiento es similar a una sola cadena de celulosa (carboximetilado). Polímeros de alto peso molecular xantana puede tener longitudes de varios micrones, y las curvas de estiramiento puede ser utilizado como un ejemplo para la extensión molecular simple. Para las fuerzas bajo, la cadena se estira contra el resorte entrópico. En algún momento, como la longitud de extremo a extremo se aproxima a la longitud del contorno, la elasticidad de la elasticidad de la columna vertebral se vuelve importante. La Figura 3 muestra la curva de retracto de una molécula única xantana se estira (en una solución amortiguadora de fosfato), utilizando el NanoWizard ® AFM. La desviación en voladizo se ha calibrado utilizando el método del ruido térmico. Para la comparación con los modelos, la distancia punta-muestra también debe ser corregido para la deflexión del cantilever para obtener un valor real separación, que se muestra aquí. Una fuerza más grande negativo corresponde a la punta se desvía más hacia la superficie, y por lo tanto una mayor fuerza extensional en la molécula.  Figura 3. Espectroscopia de fuerza retractarse de la curva de una molécula de xantana único que se estira. Una curva en el modelo ampliado FJC también se muestra para la comparación. Una curva del modelo FJC extendió también se muestra en la Figura 3 para la comparación, calculado utilizando una longitud de Kuhn, de 6 nm y una longitud de 1,25 micras de contorno. El ajuste por la simple FJC o modelo WLC era razonable para las pequeñas fuerzas extensional (por debajo de alrededor de 50pN en este caso), pero las curvas se separaron a las fuerzas superiores. Por lo tanto, el modelo ampliado FJC con la elasticidad del segmento adicional se utilizó, para tener en cuenta la columna vertebral se extiende a mayores fuerzas extensionales. En el caso de xantana, un solo enlace de largo entre la punta y la superficie se estira. Ya que la molécula es tan larga, la fuerza para extender es muy pequeño para gran parte de la curva de estiramiento, y el comportamiento está dominado por la mayor fuerza de estiramiento en la longitud estirada está cerca de la longitud del contorno. Para moléculas más complejas cruzados, tales como proteínas, una serie de estos eventos se extiende generalmente son vistos como diferentes partes de la estructura se desarrollan y se extienden. Bacteriorodopsina - Extracción y Despliegue Bacteriorodopsina es una proteína de membrana de las células bacterianas, que genera energía para las células de los fotones de luz. Hay 7 hélices alfa transmembrana, con lazos de péptido más desorganizado entre ellos. Cuando uno de los extremos de la proteína es captado y tiró, la alfa-hélices son sacados de la membrana, y se desarrollan a medida que se sacó. Membrana púrpura es la fuente natural de bacteriorhodopsin, y se compone de lípidos 25% y 75% bacteriorodopsina. La proteína se ordena como trímeros en una estructura de cristal de 2 dimensiones, que se pueden visualizar con el AFM, como se muestra en la Figura 4 (cortesía de la muestra de DJ Müller, Técnico Universidad , Dresde , Alemania . La forma característica trimer se puede ver en la imagen. La proteína se pueden obtener imágenes con el AFM y proteínas individuales seleccionados y sacó con la punta. La punta puede ser recubierto especialmente, y las moléculas modificadas para recoger una parte específica de la estructura, o la punta puede ser presionado en la superficie para recoger a una molécula de forma no específica.  Figura 4. Imagen AFM altura de membrana púrpura (lado citoplasmático), tomadas con JPK NanoWizard ® en modo de contacto en solución tampón (170nm x 100 nm, rango de altura de 1 nm) Un diagrama esquemático del proceso de apertura se muestra en la Figura 5. Los siete hélices alfa se muestran en la parte A, con la punta del AFM recoger uno de los extremos (tenga en cuenta que en el real de proteína, la alfa-hélices se agrupan en un paquete, no una línea). Hay muchas posibles vías de desarrollo, pero los acontecimientos más probable es que el alphahelices se sacan de dos en dos. Una progresión de los tres estados parcialmente desplegada se muestra en la parte B de la figura 5, con pares de hélices alfa desarrollando a medida que se extraen de la membrana.  Figura 5. Esquema de la bacteriorodopsina desarrollo con la punta del AFM. Un extremo de la molécula es recogido por la punta (A), y el alfa-hélices se sacó secuencialmente en pares (B). La Figura 6 muestra una superposición de 10 curvas bacteriorodopsina desarrollo, con la fuerza contra el trazado corregido punta-muestra de la separación. Hay algo de adherencia en la punta de las hojas de la superficie, seguido de tres eventos principales de estiramiento y desarrollo, correspondientes a los tres estados que se muestran en la Figura 5 B. Los principales picos son alrededor de 20-30nm, 50nm y 40-60-80nm, lo cual está de acuerdo bien con los valores publicados en la literatura. El voladizo se calibró usando el método del ruido térmico, y los experimentos llevados a cabo en tampón (10 mM Tris, 150 mM KCl, pH 7,6). La posición exacta de los eventos de bonos fracaso varía de curva a curva, lo cual es típico de los bonos con cerca de energía en energía térmica a temperatura ambiente. El estiramiento de la superposición de piezas curvas de la figura 6, que muestran que las mismas estructuras se extendió en cada caso. Sólo el momento actual, cuando la ruptura se extendía bonos varía de curva a curva. De un vínculo con la energía cerca de la energía térmica, hay una cierta probabilidad de que no dentro de cierto tiempo, incluso cuando no hay fuerza aplicada. Esto corresponde a la normal "fuera de ritmo" para ver la reacción de unión libre en solución. Para los bonos con energías un poco por encima de la energía térmica, que son normalmente estables, la probabilidad de que no espontáneamente aumenta a medida que se aplica una fuerza.  Figura 6. Despliegue de curvas bacteriorodopsina que es sacada de la membrana de color púrpura (superposición de las curvas de retracción 10). Una manera de pensar de un evento de estiramiento, por lo tanto, es que los bonos se tensa hasta que la barrera de energía que desarrolla se encuentra dentro del rango térmico. En el momento actual, cuando los lazos de repente no depende de una fluctuación aleatoria térmica, que tiene la molécula de la barrera de energía desarrollando. La dependencia del tiempo significa que la tasa medida despliegue dependerá de la velocidad de carga o la velocidad con la que la punta está tirando del extremo libre de la molécula.  Figura 7. Histograma de la posición de los tres picos desarrollo (separación de la punta de la muestra corregida) para un conjunto de 355 curvas bacteriorodopsina desarrollo. Muchas curvas de desarrollo de la bacteriorodopsina se pueden recoger para dar una visión estadística de los acontecimientos. La molécula puede desarrollarse de varias maneras, por lo que algunos de selección tiene que ser hecho en las curvas de la fuerza para elegir un subconjunto particular. En este caso, sólo curvas que muestran los tres eventos principales de estiramiento, como los ejemplos en la Figura 6, se han seleccionado. En la figura 7 se presenta un histograma, que muestra la distribución de separación punta-muestra de los tres picos (los datos de n = 355 curvas). El análisis de la curva fuerza se realizó parcialmente el uso del software PUNIAS.  Figura 8. Diagrama de dispersión de la fuerza contra la posición (punta-muestra la separación corregida) para el desarrollo de los acontecimientos se muestra en la Figura 6. La figura 8 muestra un diagrama de dispersión de la fuerza de despliegue en comparación con la posición de los eventos para el mismo conjunto de datos como en la figura 7. La fuerza para el primer evento de desarrollo (pico 1) es significativamente mayor que para los eventos posteriores (los picos 2 y 3). Una vez que la estructura de la proteína se ha visto alterada, entonces la fuerza necesaria para tirar el resto de hélices alfa de la membrana se reduce. Las curvas de desarrollo también muestran las diferentes vías de la molécula a desarrollarse y salir de la membrana. A partir de un conocimiento de la estructura de proteínas y aminoácidos longitudes de cadena de ácidos, las curvas extensional puede ser equipado para mostrar con claridad cuál es el camino despliegue se toma en una curva de fuerza particular. Titin Despliegue Titina es una proteína del tejido muscular, que se compone de varios repetidos dominios globulares. Dentro del tejido muscular es responsable de las propiedades mecánicas a escala macroscópica. El AFM permite el estudio de las propiedades de las moléculas de titina nanomecánicos individual. A medida que la molécula se estira, en algún momento los enlaces que mantienen un dominio en particular, junto a fallar. El dominio globular en particular, entonces se despliega, dando lugar a una longitud de contorno más de la molécula. Con más de tracción, esta sección del lineal de aminoácidos también se extendió, y uno de los otros dominios llegará a su punto de falla. Esto se ilustra en la Figura 9.  Figura 9. Esquema de la titina se extiende, como los sucesivos dominios globulares se desarrollan. Como la proteína se tira, los dominios de "pop" abrir de forma secuencial, dando lugar a una secuencia característica de los picos de las curvas de deflexión. La forma de cada parte sucesivas curvas de la gráfica fuerza refleja el aumento de la longitud efectiva de la molécula, los dominios se despliegan. Un grupo de titina extensión típica de espectroscopia retraer curva se muestra en la Figura 10 (datos por cortesía de Matías Amrein de la Universidad de Calgary, Canadá, obtenidos mediante el NanoWizard ® AFM en una sola IG8 proteína muscular titina). La secuencia de titina características de desarrollo de los acontecimientos se puede ver claramente. La fuerza aumenta de manera constante, ya que la tensión aumenta en la molécula. De repente, la fuerza disminuye rápidamente como un dominio Ig aparece abierto y la tensión se libera. La curva de cada región que se extiende puede ser equipado con la FJC o modelo WLC para la correspondiente longitud de aminoácidos libres. El tamaño de la fuerza de despliegue para un solo dominio está en el rango de 190-250pN, y la longitud del contorno de un dominio (de pico a pico de distancia) es de 28nm.  Figura 10. Curva de Fuerza de titina estiramiento, demostrando cortesía de datos secuenciales desarrollo de los dominios globulares (de Matías Amrein, Universidad de Calgary ). Aplicaciones Una amplia variedad de proteínas puede ser estirado y se desarrolló con el AFM. Dos ejemplos se ha demostrado aquí, una proteína de membrana y una proteína citoplasmática. Este método puede ser extendido a otras proteínas, para obtener información tanto sobre la estructura de la proteína normal y sus modos de fallo. En el caso de la bacteriorodopsina, la proteína forma estructuras muy muy lleno en la pared celular bacteriana, por lo que es una de las pocas proteínas de la membrana que se puede cristalizar de alta resolución de determinación estructural. Este método puede ser aplicado de manera más general, sin embargo. Para la mayoría de las proteínas de membrana, la secuencia de aminoácidos es mucho más fácil de determinar que la estructura plegada, ya que la mayoría de las proteínas de membrana no son adecuados para la cristalización. Curso de los acontecimientos medida con el AFM, que muestran el cambio en la longitud de aminoácidos diferentes unidades estructurales se desarrollan, se puede utilizar con la secuencia conocida para interpretar la estructura terciaria de las proteínas de membrana. Recubrimiento específico de la sonda, y la modificación de la proteína específica que "pick-up" puntos puede llevar a tirar de la proteína en diferentes lugares, y por lo tanto, la información adicional sobre cómo las unidades estructurales están conectadas entre sí en la estructura 3-D. Así AFM es capaz de dar una idea de la configuración de una sola molécula y permite una medición independiente de las propiedades moleculares para refinar las técnicas de modelización molecular. AFM también se puede combinar con una sola molécula de técnicas de fluorescencia como TIRF o FRET. |