Investigación Estructural de Únicas Biomoléculas y de Estirar Molecular Usando Técnicas Atómicas del Microscopio de la Fuerza de los Instrumentos de JPK

Temas Revestidos

Antecedentes

Experimentos Que Estiran Moleculares

Características de Macromoléculas en la Solución

Elasticidad Entrópica

Xantano - el Estirar Molecular Simple

Bacteriorhodopsin - Extracción y Despliegue

Despliegue de Titin

Aplicaciones

Antecedentes

La espectroscopia del RMN y la cristalografía de la Radiografía son actualmente las técnicas mas comunes capaces de determinar las estructuras de macromoléculas biológicas como las proteínas y los ácidos nucléicos en un nivel atómico de resolución. El microscopio atómico de la fuerza (AFM) se sabe sobre todo para sus capacidades de la proyección de imagen, pero es también una herramienta muy sensible para cuantitativo medir fuerzas en un único nivel de la molécula.

Esta capacidad permite el uso del AFM como técnica alternativa para la investigación de la configuración estructural de macromoléculas bajo condiciones nativas. La Medición de fuerzas en y entre las únicas moléculas proporciona a otra aproximación a la comprensión de los paisajes moleculares de la energía y de la cinética de reacción química. El AFM puede medir los bonos individuales que forman y que se rompen, bastante que siendo limitado a los promedios estadísticos sobre una población.

Este parte concentra en el uso del AFM de manipular las únicas moléculas para extraer la información sobre la estructura molecular o la conformación, y las fuerzas de enlace intramoleculares. Es también posible estudiar fenómenos dependientes del tiempo, tales como dinámica intramolecular en macromoléculas, el reconocimiento molecular o el plegamiento de proteína in situ.

Experimentos Que Estiran Moleculares

La espectroscopia de la Fuerza es un modo del AFM donde la punta se mueve hacia arriba y hacia abajo encima de un monopunto en la superficie, mientras que se mide la desviación u otras propiedades voladizas. Esto da un perfil de las fuerzas en diversas alturas encima de la superficie.

En experimentos que estiran moleculares, la punta se trae generalmente en contacto con la superficie, las moléculas en el substrato se permiten obrar recíprocamente con la punta, y entonces el voladizo se retracta. Este movimiento se muestra esquemáticamente en la serie de la imagen en el Cuadro 1 - hacia la muestra (la aproximación) y entonces de distancia otra vez (el retractar). Mientras Que el voladizo se mueve lejos de la superficie, la desviación refleja las fuerzas entre la punta y la superficie. Si una única molécula está sujetada entre la punta y la superficie, después la desviación del voladizo da una dimensión de la fuerza ejercida en la molécula.

En el diagrama esquemático en el Cuadro 1, una única molécula se muestra ser estirado entre la punta y el substrato. La molécula puede tener una estructura plegable tridimensional definida, en cuanto a proteínas, por ejemplo, o a él puede estar un encadenamiento desordenado, tal como muchos otros polímeros largos. La acción recíproca adhesiva entre la punta y la molécula ocurre generalmente en la pieza repulsiva del contacto de la curva de la fuerza, pero las características del interés para estirar molecular se encuentran en la curva del retractar.

Cuadro 1.

Las moléculas Con cadena larga, tales como DNA o dextrano, se pueden estirar entre la punta y la muestra. La longitud de la rigidez y de la persistencia se puede considerar de estirar inicial de la molécula. Las transiciones moleculares Internas se pueden también estudiar, por ejemplo la transición que funde en la DNA mientras que la espina dorsal cambia bajo tensión más alta. Las Moléculas con la estructura de 3 dimensiones compleja, tal como muchas proteínas, se pueden revelar de una manera controlada para poder investigar las unidades estructurales. Titin y el bacteriorhodopsin son ejemplos de las proteínas que se han estudiado intensivo. Las proteínas de la Membrana se pueden sacar de la membrana, y la “detonación” fuera de alfa-hélices individuales se ha considerado.

Características de Macromoléculas en la Solución

Las moléculas Largas en la solución están raramente varilla-como o derecho, y tienen a menudo una alta adaptabilidad a lo largo de la espina dorsal de la molécula. Incluso duplique la DNA trenzada, que se piensa generalmente en como molécula “derecha” debido a la estructura de doble hélice, se arregla como enredo al azar para las longitudes más allá de unas centenas nanómetros. Esto significa que hay una diferencia grande entre la longitud de la molécula medida a lo largo del encadenamiento o espina dorsal (la longitud del contorno) y las dimensiones típicas que ocupa en la solución (e.g el radio del giro o de la longitud de punta a punta), que son mucho más pequeña.

Cuadro 2.

La ordenación se representa esquemáticamente en el Cuadro 2. En la parte A, una molécula larga se muestra en una conformación extendida. En parte B, se muestra una diversa conformación donde está la molécula en un enredo al azar relajado que ocupe una dimensión lateral mucho más pequeña que la longitud del contorno. Hay muchas más conformaciones similares a la que está mostrada en B disponible para la molécula que las conformaciones similares a la que está mostrada en A, y éste lleva a la diferencia en entropía o la energía libre de las diversas conformaciones.

Hay un costo en la energía libre para enderezar fuera una molécula de la conformación B a A, puesto que el número de conformaciones relacionadas disponibles se reduce. Esta diferencia de la energía libre traduce a una fuerza que resista enderezarse, y actúa como un “muelle entrópico”. Esto está al contrario de la situación en una escala macroscópica, donde la tracción de una cadena flexible no requiere una fuerza importante hasta que sea derecha y se estira la espina dorsal real.

Cuando se tiran las moléculas largas, una fuerza se requiere para extender la molécula hacia una conformación derecha incluso si los bonos en la espina dorsal no se están estirando.

Elasticidad Entrópica

Dos modelos básicos son de uso general para esta elasticidad entrópica, dependiendo si una cierta rigidez de cadena es incluida. En el modelo de cadena libremente (FJC) juntado, la espina dorsal se modela como pequeñas unidades conectadas por las juntas totalmente “libres”, de modo que las unidades adyacentes puedan tener cualquier ángulo entre ellas sin coste energético extra. Tornillo sin fin-como el modelo (WLC) de cadena, en cambio, es un filamento contínuo con la rigidez de cadena incorporada, y es un mejor modelo para las moléculas tales como DNA doble-trenzada. Se define una longitud de la persistencia, que representa la longitud del encadenamiento sobre el cual se selecciona al azar la orientación inicial.

Si una curva de la fuerza-extensión cerco, después puede ser ajustada por uno de estos modelos para obtener la longitud de la molécula que es estirada, y la longitud de la persistencia para el modelo de WLC.

Algunas moléculas especializadas, tales como proteínas, tienen normalmente una estructura tridimensional (plegable) definida en la solución. Esta estructura es el clave a su función biológica como las enzimas o unidades estructurales, por ejemplo. El encadenamiento del polipéptido no es una bobina suelta relajada, sino plegable en una estructura mucho más derecha y es ligado por muchos bonos. Si la proteína es revelada, por la fuerza, substancia química o la termal cambia, después el encadenamiento libre del polipéptido se comporta como una molécula lineal simple. El estirar entrópico puede ser considerado, pues los bonos a lo largo de la espina dorsal del polipéptido son altamente flexibles. Las partes Definidas de la estructura de la proteína, tales como alfa-hélices o dominios globulares, se pueden revelar secuencialmente, y la longitud “libre” medida de la molécula basada en las curvas que estiran aumentará con cada acción del despliegue. Los pasos de progresión del despliegue de la proteína proporcionan a la información sobre la estructura plegable normal y sus mecanismos de incidente.

Xantano - el Estirar Molecular Simple

El Xantano es un polisacárido bacteriano, con una espina dorsal molecular idéntica a la celulosa. Las propiedades químicas de los grupos laterales dan a polímero muchas aplicaciones industriales, de la estabilización de la comida a la recuperación del aceite.

Cuando la molécula del Xantano se estira entre la punta y la superficie, los grupos laterales cortos no tienen un efecto importante sobre las propiedades elásticos, y el comportamiento es similar a un único encadenamiento (carboxymethylated) de la celulosa. Los polímeros De Molecularidad Elevada del xantano del peso pueden tener longitudes de varios micrones, y las curvas que estiran se pueden utilizar como primer medio para la extensión molecular simple. Para las fuerzas inferiores, el encadenamiento se estira contra el muelle entrópico. En algún momento, como la longitud de punta a punta se acerca a la longitud del contorno, la elasticidad de la elasticidad de la espina dorsal llega a ser importante.

El Cuadro 3 muestra la curva del retractar de una única molécula del Xantano que es estirada (en una solución tampón de fosfato) usando el NanoWizard® AFM. La desviación voladiza se ha calibrado usando el método térmico del ruido.

Para la comparación con los modelos, la distancia de la punta-muestra se debe también corregir para la desviación del voladizo para obtener un valor real de la separación, que se muestra aquí. Una fuerza negativa más grande corresponde a la punta que es desviada más hacia la superficie, y por lo tanto una fuerza extensional más alta en la molécula.

Cuadro 3.

Una curva del modelo extendido de FJC también se muestra en el Cuadro 3 para la comparación, calculado usando una longitud de Kuhn de 6 nanómetro y una longitud del contorno de 1,25 micrones. El ajuste para el modelo simple de FJC o de WLC era razonable para las pequeñas fuerzas extensional (debajo alrededor de 50pN en este caso), pero las curvas divergieron en fuerzas más altas. Por Lo Tanto el modelo extendido de FJC con la elasticidad adicional del segmento fue utilizado, para tener en cuenta la espina dorsal que estiraba en fuerzas extensional más altas.

En el caso del Xantano, una única conexión larga entre la punta y la superficie se estira. Puesto Que la molécula es tan larga, la fuerza para extenderla es muy pequeña para mucha de la curva que estira, y el comportamiento es dominado por la alto-fuerza que estira donde está la longitud estirada cerca de la longitud del contorno. Para más las moléculas plegables complejo, tales como proteínas, una serie de estas acciones que estiran se considera generalmente mientras que diversas partes de la estructura revelan y son extendidas.

Bacteriorhodopsin - Extracción y Despliegue

Bacteriorhodopsin es una proteína integral de la membrana de las células bacterianas, que genera la energía para las células de los fotones pálidos. Hay 7 alfa-hélices de la transmembrana, con más bucles desorganizados del péptido entre ellos.

Cuando un extremo de la proteína se agarra y tirado, después las alfa-hélices se sacan de la membrana, y revelan mientras que se sacan.

La membrana Púrpura es la fuente natural para el bacteriorhodopsin, y consiste en los lípidos del 25% y bacteriorhodopsin del 75%. La proteína se arregla como trímeros en una estructura cristalina de 2 dimensiones, que puede ser reflejada usando el AFM, tal y como se muestra en del Cuadro 4 (cortesía de la muestra de D.J. Müller, TechnicalUniversityDresdenGermany

Cuadro 4.

Un diagrama esquemático del proceso del despliegue se muestra en el Cuadro 5. Las siete alfa-hélices se muestran en la parte A, con la punta del AFM tomando un extremo (la nota que en la proteína real, las alfa-hélices se agrupan juntas en un manojo, no una línea). Hay muchos caminos posibles del despliegue, pero las acciones más probable son que los alphahelices están sacados en pares. Una progresión de tres estados parcialmente revelados se muestra en la parte B del Cuadro 5, con pares de alfa-hélices revelando mientras que se extraen de la membrana.

Cuadro 5.

El Cuadro 6 muestra una superposición de 10 curvas del despliegue del bacteriorhodopsin, con la fuerza trazada contra la separación corregida de la punta-muestra. Hay una cierta adherencia como la punta sale de la superficie, seguida por estirar principal tres y las acciones del despliegue, correspondiente a los tres estados mostrados en el Cuadro 5 B. Los picos principales están alrededor de 20-30nm, de 40-50nm y de 60-80nm, que están de acuerdo bien con los valores publicados en la literatura. El voladizo fue calibrado usando el método térmico del ruido, y los experimentos realizados bajo almacenador intermediaro (10mM TRIS, KCl 150mM, pH 7,6).

La posición exacta de las acciones de incidente en enlace varía de curva a la curva, que es típica para los bonos con energía cerca de la energía térmica en la temperatura ambiente. Las partes que estiraban de las curvas cubrieron en el Cuadro 6, mostrando que las mismas estructuras se están estirando en cada caso. Solamente el momento real en que el interruptor estirado de los bonos varía de curva a la curva. Para un bono con energía cerca de la energía térmica, hay una cierta probabilidad de ella que falla dentro de cierto tiempo, incluso sin fuerza aplicada. Esto corresponde al “lejos-tipo normal” visto para la reacción obligatoria libremente en la solución. Para los bonos con las energías un poco encima de la energía térmica, que son normalmente estables, la probabilidad de ellas que fallan espontáneamente aumenta mientras que una fuerza es aplicada.

Cuadro 6.

Una manera de pensar en una acción que estira, por lo tanto, es que los bonos están esforzados hasta que la barrera de energía al despliegue esté dentro del rango térmico. El momento real cuando los bonos fallan repentinamente depende de una fluctuación térmica al azar, que toma la molécula sobre la barrera de energía del despliegue. La función del tiempo significa que el tipo medido del despliegue dependerá de la velocidad de carga, o la velocidad con la cual la punta está tirando del extremo libre de la molécula.

Cuadro 7.

Muchos las curvas del despliegue del bacteriorhodopsin se pueden cerco para dar una vista estadística de las acciones del despliegue. La molécula puede revelar de varias maneras, así que una cierta selección tiene que ser hecha en las curvas de la fuerza para elegir un subconjunto determinado. En este caso, solamente las curvas que mostraban las tres acciones que estiraban principales, tales como los ejemplos en el Cuadro 6, fueron seleccionadas. En el Cuadro 7 un histograma se presenta, mostrando la distribución de la separación de la punta-muestra para los tres picos (datos para n = 355 curvas). El análisis de la curva de la fuerza fue realizado parcialmente usando el software de PUNIAS.

Cuadro 8.

El Cuadro 8 muestra un gráfico de la dispersión de la fuerza del despliegue comparado con la posición de la acción para el mismo conjunto de datos que en el Cuadro 7. La fuerza para la primera acción del despliegue (el Pico 1) es importante más alto que para las acciones subsiguientes (Picos 2 y 3). Una Vez Que se ha roto la estructura de la proteína, después la fuerza requerida para sacar de las alfa-hélices restantes la membrana se reduce. Las curvas del despliegue también muestran diversos caminos para que la molécula revele y saque de la membrana. De un conocimiento de las longitudes de cadena de la estructura y del aminoácido de la proteína, las curvas extensional se pueden ajustar para mostrar sin obstrucción qué camino del despliegue se admite una curva determinada de la fuerza.

Despliegue de Titin

Titin es una proteína del tejido del músculo, que consiste en varios dominios globulares relanzados. Dentro del tejido del músculo es responsable de las propiedades mecánicas en una escala macroscópica. El AFM permite el estudio de las propiedades nanomechanical de las moléculas individuales del titin. Pues se estira la molécula, en algún momento los bonos que llevan a cabo un dominio determinado juntos fallarán. Este dominio globular determinado entonces revela, llevando a una longitud más larga del contorno para la molécula. Con más lejos la tracción, esta sección de aminoácidos lineales también se estira, y uno de los otros dominios alcanzará su punta del incidente. Esto se ilustra esquemáticamente en el Cuadro 9.

Cuadro 9.

Mientras Que se tira la proteína, los dominios “se disparan” se abren secuencialmente, llevando a una serie característica de picos en la desviación curvan. La dimensión de una variable de cada parte curvada sucesiva del gráfico de la fuerza refleja la longitud útil creciente de la molécula mientras que se revelan los dominios.

Una espectroscopia típica de la fuerza de la extensión del titin se retracta la curva se muestra en el Cuadro 10 (cortesía de los datos de Matías Amrein, Universidad de Calgary, de Canadá, obtenidos usando el NanoWizard® AFM en una única proteína de músculo del titin Ig8). La serie característica del titin de las acciones del despliegue puede ser considerada sin obstrucción. Los aumentos de la fuerza constantemente, como la tensión en la molécula aumentan. La fuerza disminuye Repentinamente sostenidamente mientras que los estallidos de un dominio de Ig se abren y se afloja la tensión. La curva de cada región que extiende se puede ajustar con el modelo de FJC o de WLC para la longitud correspondiente del aminoácido libre. La talla de la fuerza del despliegue para un único dominio está en el rango de 190-250pN, y la longitud del contorno de un dominio (distancia de pico a pico) es 28nm.

Cuadro 10. de).

Aplicaciones

Una amplia variedad de proteínas se pueden estirar y revelar usando el AFM. Dos ejemplos se han mostrado aquí, una proteína de la membrana y una proteína citoplásmica. Este método se puede ampliar a otras proteínas, a la información del avance sobre la estructura normal de la proteína y sus modos de fallo. En el caso de bacteriorhodopsin, la proteína forma las estructuras muy altamente pila de discos en la pared celular bacteriana, y así que es una de las pocas proteínas de la membrana que se pueden cristalizar para la determinación estructural de alta resolución.

Este método puede ser más generalmente aplicado, sin embargo. Para la mayoría de las proteínas de la membrana, la serie de aminoácido es mucho más fácil de determinar que la estructura plegable, puesto que la mayoría de las proteínas de la membrana no son convenientes para la cristalización.

Las acciones del Despliegue medidas con el AFM, que muestran el cambio en longitud del aminoácido mientras que diversas unidades estructurales revelan, se pueden utilizar con la serie sabida para interpretar la estructura terciaria de las proteínas de la membrana. La capa Específica de la antena, y la modificación de la proteína para tener puntas específicas de la “captación” pueden llevar a tirar la proteína en las ubicaciones diferentes, y por lo tanto la información adicional sobre cómo las unidades estructurales se conectan juntas en la estructura tridimensional.

Así el AFM puede dar discernimiento en la configuración de una única molécula y permitir que una medición independiente de propiedades moleculares refine técnicas de modelado moleculares. El AFM se puede también combinar con únicas técnicas de la fluorescencia de la molécula tales como TIRF o TRASTE.

Fuente: Instrumentos de JPK

Para más información sobre esta fuente visite por favor los Instrumentos de JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:28

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