Enquête Structurelle sur les Biomolécules Uniques et Étirement Moléculaire Utilisant des Techniques Atomiques de Microscope de Force des Instruments de JPK

Sujets Couverts

Mouvement Propre

Expériences Moléculaires d'Étirement

Caractéristiques des Macromolécules en solution

Élasticité Entropique

Xanthane - Étirement Moléculaire Simple

Bacteriorhodopsin - Extraction et Déploiement

Déploiement de Titin

Applications

Mouvement Propre

La spectroscopie et la cristallographie RMN de Rayon X sont actuel les techniques les plus communes capables de déterminer les structures des macromolécules biologiques comme des protéines et des acides nucléiques à un niveau atomique de définition. Le microscope atomique de force (AFM) est en grande partie connu pour ses capacités de représentation, mais c'est également un outil très sensible pour mesurer quantitativement des forces à un niveau unique de molécule.

Cette capacité permet l'utilisation de l'AFM comme technique alternative pour l'enquête sur la configuration structurelle des macromolécules dans des conditions indigènes. La Mesure des forces à l'intérieur et entre les molécules uniques fournit un autre élan à la compréhension des horizontaux moléculaires d'énergie et de la théorie cinétique des réactions de réaction chimique. L'AFM peut mesurer différentes obligations formant et se brisant, plutôt qu'étant limité aux moyennes statistiques au-dessus d'une population.

Cet état se concentre sur l'utilisation de l'AFM de manipuler les molécules uniques pour extraire des informations sur la structure moléculaire ou la conformation, et les forces de loi intramoléculaires. Il est également possible d'étudier des phénomènes dépendant du temps, tels que la dynamique intramoléculaire dans les macromolécules, la reconnaissance moléculaire ou le repliement des protéines in situ.

Expériences Moléculaires d'Étirement

La spectroscopie de Force est un mode d'AFM où l'extrémité est déménagée en haut et en bas au-dessus d'un unique sur la surface, alors que le fléchissement ou d'autres propriétés en porte-à-faux sont mesurés. Ceci donne un profil des forces à différentes hauteurs au-dessus de la surface.

Dans des expériences moléculaires d'étirement, l'extrémité est habituellement mise en contact avec la surface, les molécules sur le substrat sont permises d'agir l'un sur l'autre avec l'extrémité, et alors l'encorbellement est rentré. Ce mouvement est affiché schématiquement dans la suite d'image sur le Schéma 1 - vers l'échantillon (l'élan) et puis loin de nouveau (la rétraction). Pendant Que l'encorbellement est éloigné de la surface, le fléchissement réfléchit les forces entre l'extrémité et la surface. Si une molécule unique est retenue entre l'extrémité et la surface, alors le fléchissement de l'encorbellement donne une mesure de la force exercée sur la molécule.

Dans le schéma de principe sur le Schéma 1, une molécule unique est affichée l'étirage entre l'extrémité et le substrat. La molécule peut avoir une structure pliée par tridimensionnel définie, quant aux protéines, par exemple, ou à lui peut être un réseau désordonné, tel que beaucoup d'autres longs polymères. L'interaction adhésive entre l'extrémité et la molécule a lieu habituellement dans la pièce répulsive de contact de la courbure de force, mais les caractéristiques techniques d'intérêt pour l'étirement moléculaire sont trouvées dans la courbure de rétraction.

Le Schéma 1.

Des molécules À longue chaîne, telles que l'ADN ou le dextrane, peuvent être étirées entre l'extrémité et l'échantillon. La longueur de raideur et de persistance peut être vue de l'étirement initial de la molécule. Des passages moléculaires Internes peuvent également être étudiés, comme le passage de fonte dans l'ADN pendant que le circuit principal permute sous une tension plus élevée. Des Molécules avec la structure à trois dimensions complexe, telle que beaucoup de protéines, peuvent être dévoilées d'une voie réglée de sorte que les ensembles structurels puissent être vérifiés. Titin et bacteriorhodopsin sont des exemples des protéines qui ont été intensivement étudiées. Des protéines de Membrane peuvent être retirées de la membrane, et « sauter » hors de différents alpha-hélix a été vu.

Caractéristiques des Macromolécules en solution

Les Longues molécules sont en solution rarement comme une tige ou raides, et ont souvent une souplesse élevée le long du circuit principal de la molécule. Même l'ADN bicaténaire, qui est habituellement considéré comme une molécule « raide » à cause de la structure de double-hélix, est arrangé comme embrouillement irrégulier pour des longueurs au delà de quelques cents nanomètres. Ceci signifie qu'il y a une grande différence entre la longueur de la molécule mesurée le long du réseau ou circuit principal (la longueur de forme) et les cotes typiques qu'il occupe en solution (par exemple le radius de la giration ou de la longueur de bout en bout), qui est beaucoup plus petit.

Le Schéma 2.

L'arrangement est représenté schématiquement sur le Schéma 2. Dans la partie A, Une longue molécule est affichée dans une conformation étendue. Dans la partie B, Une conformation différente est affichée où la molécule est dans un embrouillement irrégulier décontracté qui occupe une cote transversale beaucoup plus petite que la longueur de forme. Il y a beaucoup plus de conformations assimilées à celle affichée dans B disponible à la molécule que des conformations assimilées à celle affichée dans A, et ceci mène à la différence dans l'entropie ou l'énergie libre des différentes conformations.

Il y a un coût dans l'énergie libre pour redresser à l'extérieur une molécule de la conformation B à A, puisque le nombre de conformations relatives disponibles est réduit. Cette différence d'énergie libre traduit à une force qui résiste au redressage, et agit comme une « source » entropique. C'est contrairement à la situation sur une échelle macroscopique, où la traction d'une chaîne de caractères flexible n'exige pas une force significative jusqu'à ce qu'elle soit droite et le circuit principal réel est étiré.

Quand de longues molécules sont tirées, une force est exigée pour étendre la molécule vers une conformation droite même si les obligations dans le circuit principal ne sont pas étirées.

Élasticité Entropique

Deux modèles de base sont utilisés généralement pour cette élasticité entropique, dépendant si de la raideur à chaînes est incluse. Dans le modèle à chaînes librement (FJC) joint, le circuit principal est modélisé en tant que petits ensembles reliés par les articulations complet « libres », de sorte que les ensembles adjacents puissent avoir n'importe quelle cornière entre elles sans coût énergetique supplémentaire. Le modèle à chaînes (WLC) ver de terre ver de terre, en revanche, est un filament continu avec la raideur à chaînes incorporé, et est un meilleur modèle pour des molécules telles que l'ADN bicaténaire. Une longueur de persistance est définie, qui représente la longueur du réseau au-dessus duquel l'orientation initiale est randomisée.

Si une courbure de force-extension est rassemblée, alors elle peut être ajustée par un de ces modèles pour obtenir la longueur de la molécule étant étirée, et la longueur de persistance pour le modèle de WLC.

Quelques molécules spécialisées, telles que des protéines, ont normalement une structure en trois dimensions (pliée) définie en solution. Cette structure est la clé à leur rôle biologique comme enzymes ou ensembles structurels, par exemple. Le réseau de polypeptide n'est pas une bobine desserrée décontractée, mais est plié dans une structure beaucoup plus raide et lié par beaucoup d'obligations. Si la protéine est dévoilée, par la force, produit chimique ou la thermique change, alors le réseau libre de polypeptide se comporte comme une molécule linéaire simple. L'étirement entropique peut être vu, car les obligations le long du circuit principal de polypeptide sont hautement flexibles. Des parties Définies de la structure des protéines, telles que des alpha-hélix ou des domaines globulaires, peuvent être dévoilées séquentiellement, et la longueur « libre » mesurée de la molécule basée sur les courbures d'étirement augmentera avec chaque événement de déploiement. Les phases de déploiement de protéine fournissent des informations au sujet de la structure pliée par normale et de ses mécanismes de défaillance.

Xanthane - Étirement Moléculaire Simple

Le Xanthane est un polysaccharide bactérien, avec un circuit principal moléculaire identique à la cellulose. Les propriétés chimiques des groupes latéraux donnent au polymère beaucoup d'applications industrielles, de stabilisation de nourriture à la reprise de pétrole.

Quand la molécule de Xanthane est étirée entre l'extrémité et la surface, les groupes latéraux courts n'exercent pas un effet significatif sur les propriétés élastiques, et le comportement est assimilé à un réseau (carboxymethylated) unique de cellulose. Les polymères de xanthane de Poids peuvent avoir des longueurs de plusieurs microns, et les courbures d'étirement peuvent être utilisées comme exemple pour l'extension moléculaire simple. Les forces faibles, le réseau est étiré contre la source entropique. À une certaine remarque, comme longueur de bout en bout approche la longueur de forme, l'élasticité de l'élasticité de circuit principal devient important.

Le Schéma 3 expositions la courbure de rétraction d'une molécule unique de Xanthane étant étirée (dans une solution tampon de phosphate) utilisant le NanoWizard® AFM. Le fléchissement en porte-à-faux a été étalonné suivre la méthode thermique de bruit.

Pour la comparaison avec les modèles, la distance d'extrémité-échantillon doit également être rectifiée pour le fléchissement de l'encorbellement pour obtenir une valeur réelle de séparation, qui est affichée ici. Une force négative plus importante correspond à l'extrémité étant guidée plus vers la surface, et par conséquent une force extensional plus élevée sur la molécule.

Le Schéma 3.

Une courbure du modèle étendu de FJC est également affichée sur le Schéma 3 pour la comparaison, prévu utilisant une longueur de Kuhn de 6 nanomètre et une longueur de forme de 1,25 microns. L'ajustement pour le modèle simple de FJC ou de WLC était raisonnable de petites forces extensional (ci-dessous autour de 50pN dans ce cas), mais les courbures ont divergé à des forces plus élevées. Par Conséquent le modèle étendu de FJC avec l'élasticité supplémentaire de segment a été employé, pour tenir compte de l'étirement de circuit principal à des forces extensional plus élevées.

Dans le cas du Xanthane, une longue barrette unique entre l'extrémité et la surface est étirée. Puisque la molécule est si longue, la force pour l'étendre est très petite pour une grande partie de la courbure d'étirement, et le comportement est dominé par l'étirement d'élevé-force où la longueur étirée est près de la longueur de forme. Pour plus les molécules pliées par composé, telles que des protéines, une suite de ces événements d'étirement est généralement vue pendant que les différentes parties de la structure dévoilent et sont étendues.

Bacteriorhodopsin - Extraction et Déploiement

Bacteriorhodopsin est une protéine intégrale de membrane des cellules bactériennes, qui produit de l'énergie pour les cellules des photons légers. Il y a 7 alpha-hélix de transmembrane, avec plus de boucles désorganisées de peptide entre elles.

Quand une extrémité de la protéine est saisie et tiré, alors les alpha-hélix sont retirés de la membrane, et ils dévoilent pendant qu'ils sont retirés.

La membrane Pourprée est la source naturelle pour le bacteriorhodopsin, et se compose des lipides de 25% et du bacteriorhodopsin de 75%. La protéine est arrangée comme trimères dans une structure cristalline à deux dimensions, qui peut être imagée utilisant l'AFM, suivant les indications du Schéma 4 (accueil d'échantillon de D.J. Müller, TechnicalUniversityDresdenGermany

Le Schéma 4.

Un schéma de principe du procédé de déploiement est affiché sur le Schéma 5. Les sept alpha-hélix sont affichés dans la partie A, Avec l'extrémité d'AFM captant une extrémité (la note que dans la protéine réelle, les alpha-hélix sont groupé ensemble dans un paquet, pas une ligne). Il y a beaucoup de voies possibles de déploiement, mais les événements le plus susceptibles sont que les alphahelices sont retirés dans les paires. Une étape progressive de trois conditions partiellement dévoilées est affichée dans la partie B Du Schéma 5, avec des paires d'alpha-hélix dévoilant pendant qu'ils sont extraits de la membrane.

Le Schéma 5.

Le Schéma 6 affiche une superposition de 10 courbures de déploiement de bacteriorhodopsin, avec la force tracée contre la séparation rectifiée d'extrémité-échantillon. Il y a une certaine adhérence car l'extrémité part de la surface, suivie de trois événements principaux d'étirement et de déploiement, correspondant aux trois conditions représentées sur le Schéma 5 B. Les crêtes principales sont autour de 20-30nm, de 40-50nm et de 60-80nm, qui sont conformes bien aux valeurs publiées dans la littérature. L'encorbellement a été étalonné utilisant la méthode thermique de bruit, et les expériences effectuées sous le tampon (10mM TRIS, KCl de 150mM, pH 7,6).

La position exacte des événements de défaillance en esclavage varie de la courbure à la courbure, qui est particulière pour des obligations avec de l'énergie près de l'énergie thermique à la température ambiante. Les parties s'étendantes des courbures ont recouvert sur le Schéma 6, prouvant que les mêmes structures sont étirées dans chaque cas. Seulement le moment réel où la rupture étirée d'obligations varie de la courbure à la courbure. Pour une obligation avec de l'énergie près de l'énergie thermique, il y a une certaine probabilité de elle échouant dans un certain temps, même sans la force appliquée. Ceci correspond au « hors circuit-rate » normal vu pour la réaction obligatoire librement en solution. Pour des obligations avec des énergies au-dessus de l'énergie thermique, qui sont normalement stables, la probabilité de elles défaillant spontanément augmente pendant qu'une force est appliquée.

Le Schéma 6.

Une voie de penser à un événement d'étirement est, pour cette raison, que les obligations sont tendues jusqu'à ce que le barrage d'énergie au dévoilement soit dans la marge thermique. Le moment réel quand les obligations défaillent soudainement dépend d'une variation thermique irrégulière, qui prend la molécule au-dessus du barrage d'énergie de déploiement. La dépendence de temps signifie que les tarifs mesurés de dévoilement dépendront du taux de chargement, ou la vitesse avec laquelle l'extrémité tire l'extrémité libre de la molécule.

Le Schéma 7.

On des courbures de déploiement de bacteriorhodopsin peuvent être rassemblés pour donner un avis statistique des événements de déploiement. La molécule peut dévoiler de plusieurs voies, ainsi une certaine sélection doit être faite dans les courbures de force pour choisir un sous-ensemble particulier. Dans ce cas, seulement des courbures montrant les trois événements principaux d'étirement, tels que les exemples sur le Schéma 6, ont été sélectées. Sur le Schéma 7 un histogramme est présenté, affichant la distribution de séparation d'extrémité-échantillon pour les trois crêtes (données pour n = 355 courbures). L'analyse de courbure de force a été partiellement effectuée utilisant le logiciel de PUNIAS.

Le Schéma 8.

Le Schéma 8 affiche un traçage de dispersion de la force de déploiement contre la position de l'événement pour le même ensemble de données que sur le Schéma 7. La force pour le premier événement de déploiement (la Crête 1) est sensiblement plus élevée que pour les événements ultérieurs (Crêtes 2 et 3). Une Fois Que la structure des protéines a été perturbée, puis la force exigée pour tirer les alpha-hélix restants hors de la membrane est réduite. Les courbures de déploiement affichent également que différentes voies pour que la molécule dévoile et retirait de la membrane. D'une connaissance de la structure des protéines et des portées acides aminées, les courbures extensional peuvent être ajustées pour afficher de manière dégagée quel chemin de déploiement est rentré une courbure particulière de force.

Déploiement de Titin

Titin est une protéine du tissu musculaire, qui se compose de plusieurs domaines globulaires répétés. Dans le tissu musculaire il est responsable des propriétés mécaniques sur une échelle macroscopique. L'AFM permet l'étude des propriétés nanomechanical de différentes molécules de titin. Car la molécule est étirée, à une certaine remarque les obligations retenant un domaine particulier ensemble échoueront. Ce domaine globulaire particulier dévoile alors, menant à une plus longue longueur de forme pour la molécule. Avec tirer davantage, cette partie d'acides aminés linéaires est également étirée, et un des autres domaines atteindra sa remarque de défaillance. Ceci est illustré schématiquement sur le Schéma 9.

Le Schéma 9.

Pendant Que la protéine est tirée, les domaines « sautent » s'ouvrent séquentiellement, menant à une séquence caractéristique des crêtes dans le fléchissement courbe. La forme de chaque partie incurvée successive du traçage de force réfléchit la plus grande longueur utile de la molécule pendant que les domaines sont dévoilés.

Une spectroscopie typique de force d'extension de titin rétractent la courbure est affichée sur le Schéma 10 (accueil de données de Matthias Amrein, Université de Calgary, du Canada, obtenus utilisant le NanoWizard® AFM sur une protéine musculaire unique de titin Ig8). La séquence caractéristique de titin des événements de déploiement peut être de manière dégagée vue. Les augmentations de force solidement, à mesure que la tension de la molécule augmente. Soudainement la force diminue tranchant pendant que les bruits d'un domaine d'Ig s'ouvrent et la tension est relâchée. La courbure de chaque région étendante peut être équipée du modèle de FJC ou de WLC pour la longueur correspondante d'acide aminé libre. La taille de la force de déploiement pour un domaine unique est de l'ordre de 190-250pN, et la longueur de forme d'un domaine (distance de crête à crête) est 28nm.

Le Schéma 10. de).

Applications

Une grande variété de protéines peuvent être étirées et dévoilées utilisant l'AFM. Deux exemples ont été affichés ici, une protéine de membrane et une protéine cytoplasmique. Cette méthode peut être étendue à d'autres protéines, aux informations de gain sur la structure des protéines normale et ses modes de dérangement. Dans le cas du bacteriorhodopsin, la protéine forme les structures très fortement bourrées dans la paroi cellulaire bactérienne, et ainsi est l'une des quelques protéines de membrane qui peuvent être cristallisées pour la détermination structurelle à haute résolution.

Cette méthode peut être plus généralement appliquée, cependant. Pour la plupart des protéines de membrane, il est beaucoup plus facile déterminer la séquence des acides aminés que la structure pliée, puisque la plupart des protéines de membrane ne sont pas adaptées pour la cristallisation.

Des événements de Déploiement mesurés avec l'AFM, qui affichent le changement de la longueur acide aminée pendant que les différents ensembles structurels dévoilent, peuvent être employés avec la séquence connue pour interpréter la structure tertiaire des protéines de membrane. La couche Particulière de la sonde, et la modification de la protéine pour avoir les remarques particulières de « camionnette de livraison » peuvent mener à tirer la protéine à différents emplacements, et par conséquent à informations supplémentaires au sujet de la façon dont les ensembles structurels sont connectés ensemble dans la structure à trois dimensions.

Ainsi l'AFM peut donner l'analyse dans la configuration d'une molécule unique et permettre à une principale mesure des propriétés moléculaires de polir des techniques de modélisation moléculaires. L'AFM peut également être combiné avec des techniques uniques de fluorescence de molécule telles que TIRF ou FRETTE.

Source : Instruments de JPK

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît les Instruments de JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:47

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