Spectroscopie RMN et cristallographie aux rayons X sont actuellement les techniques les plus communes capables de déterminer les structures des macromolécules biologiques comme les protéines et les acides nucléiques à un niveau atomique de résolution. Le microscope à force atomique (AFM) est surtout connu pour ses capacités d'imagerie, mais elle est aussi un outil très sensible pour la mesure quantitative de forces sur une échelle de la molécule unique. Cette capacité permet l'utilisation de l'AFM comme une technique alternative pour l'étude de la configuration structurelle des macromolécules dans des conditions natives. Mesure de forces au sein et entre les molécules unique offre une autre approche pour la compréhension des paysages de l'énergie moléculaire et cinétique des réactions chimiques. L'AFM peut mesurer obligations individuelles formant et la rupture, plutôt que d'être limité à des moyennes statistiques sur une population. Ce rapport se concentre sur l'utilisation de l'AFM pour manipuler les molécules simples pour extraire des informations sur la structure moléculaire ou la conformation, et intramoléculaires forces de liaison. Il est également possible d'étudier à temps les phénomènes dépendent, tels que la dynamique intramoléculaire dans les macromolécules, la reconnaissance moléculaire ou le repliement des protéines in situ. Molecular expériences Stretching Spectroscopie de force est un mode AFM, où la pointe est déplacée de haut en bas au dessus d'un point unique à la surface, tandis que la déflexion ou cantilevers autres propriétés sont mesurées. Cela donne un profil des forces à différentes hauteurs au-dessus de la surface. En moléculaires expériences d'étirement, la pointe est habituellement mis en contact avec la surface, les molécules sur le substrat sont autorisés à interagir avec la pointe, puis le cantilever est rétracté. Ce mouvement est représenté schématiquement à la série d'images dans la Figure 1 - vers l'échantillon (l'approche), puis à nouveau l'écart (la rétraction). Comme le cantilever est éloigné de la surface, la déflexion reflète les forces entre la pointe et la surface. Si une seule molécule est maintenu entre la pointe et la surface, puis la déviation du cantilever donne une mesure de la force exercée sur la molécule. Dans le schéma de la figure 1, une seule molécule est représenté comme étant tendu entre la pointe et le substrat. La molécule peut avoir une structure tridimensionnelle définie plié, comme pour les protéines, par exemple, ou il peut être une chaîne désordonnée, comme beaucoup d'autres polymères de long. L'interaction adhésive entre la pointe et la molécule a généralement lieu dans la partie contact répulsive de la courbe de la force, mais les caractéristiques d'intérêt pour les mécanismes moléculaires d'étirement sont trouvés dans la courbe de se rétracter.  Figure 1. Schéma d'une expérience de spectroscopie de force où la pointe de l'AFM est utilisée pour étirer une molécule unique Molécules à longue chaîne, comme l'ADN ou le dextrane, peut être étiré entre la pointe et l'échantillon. La rigidité et la longueur de persistance peut être vu de l'étirement initial de la molécule. Interne transitions moléculaires peuvent également être étudiés, tels que la transition de fusion de l'ADN comme l'épine dorsale réorganise sous haute tension. Molécules avec des complexes en 3 dimensions la structure, comme beaucoup de protéines, peut être déplié de façon contrôlée afin que les unités structurelles peuvent être étudiés. Titin et bactériorhodopsine sont des exemples de protéines qui ont été intensivement étudiés. Les protéines membranaires peuvent être retirés de la membrane, et le "popping" hors de l'individu alpha-hélices a été vu. Caractéristiques des macromolécules en solution Longues molécules en solution sont rarement tiges ou raide, et ont souvent une grande souplesse le long du squelette de la molécule. Même l'ADN double brin, qui est généralement considéré comme un "raide" molécule en raison de la structure en double hélice, est disposée comme un enchevêtrement aléatoire pour des longueurs au-delà de quelques centaines de nanomètres. Cela signifie qu'il ya une grande différence entre la longueur de la molécule mesurée le long de la chaîne ou le backbone (la longueur du contour) et les dimensions typiques qu'il occupe dans la solution (par exemple, le rayon de giration ou la longueur de bout en bout), qui sont beaucoup plus petits.  Figure 2. Schéma de deux conformations possibles d'une longue molécule. En A, la molécule est allongé dans une conformation peu probable pour une molécule en solution. B montre une conformation plus typique, où la molécule est dans un enchevêtrement désordonné. L'arrangement est représenté schématiquement à la figure 2. Dans la partie A, une molécule longue est montré dans une conformation étendue. Dans la partie B, une conformation différente est représentée où la molécule est dans un enchevêtrement aléatoire détendue qui occupe une dimension beaucoup plus petite que la longueur latérale de contours. Il ya beaucoup plus de conformations semblables à celui indiqué dans la disposition de la molécule que conformations semblables à celui présenté en A, B, et cela mène à la différence d'énergie libre de l'entropie ou les différentes conformations. Il ya un coût en énergie libre pour redresser une molécule de B à A la conformation, puisque le nombre de conformations disponibles connexe est réduite. Cette différence d'énergie libre se traduit par une force qui résiste à la redresser, et agit comme une entropique "printemps". Ceci est en contraste avec la situation à l'échelle macroscopique, où tirant une corde flexible ne nécessite pas une force importante jusqu'à ce qu'il soit droit et la colonne vertébrale est étirée réelle. Quand les molécules longues sont tirés, une force est nécessaire pour étendre la molécule vers une conformation linéaire, même si les liens dans la colonne vertébrale ne sont pas tendus. Élasticité entropique Deux modèles de base sont couramment utilisés pour cette élasticité entropique, selon que certaine rigidité de la chaîne est incluse. Dans la chaîne (CJF) modèle librement articulées, l'épine dorsale est modélisée comme de petites unités reliées par complètement «libre» des articulations, de sorte que les unités adjacentes peuvent avoir n'importe quel angle entre eux, sans coût énergétique supplémentaire. Le ver-comme la chaîne (WLC) modèle, au contraire, est un filament continu avec la rigidité de la chaîne intégré, et est un meilleur modèle pour des molécules telles que ADN double brin. Une longueur de persistance est définie, ce qui représente la longueur de la chaîne sur laquelle l'orientation initiale est aléatoire. Si une courbe force-extension est recueilli, puis il peut être monté par un de ces modèles pour obtenir la longueur de la molécule étant tendu, et la longueur de persistance pour le modèle de WLC. Certaines molécules spécialisées, telles que les protéines, ont normalement une définie (plié) structure tridimensionnelle en solution. Cette structure est la clé de leur fonction biologique des enzymes ou des unités structurelles, par exemple. La chaîne polypeptidique n'est pas une bobine détendue lâche, mais il est plié en une structure beaucoup plus rigide et maintenues ensemble par de nombreux liens. Si la protéine est déplié, par des changements vigueur, chimique ou thermique, puis la chaîne gratuite polypeptide se comporte comme une simple molécule linéaire. L'étirement entropique peut être vu, que les liens le long du squelette polypeptidique sont très flexibles. Parties définies de la structure des protéines, comme les hélices alpha ou des domaines globulaires, peut être déplié de manière séquentielle, et la mesure "libre" longueur de la molécule sur la base des courbes d'étirement va augmenter avec chaque événement qui se déroule. La protéine se déroule les étapes de fournir des informations sur la structure normale repliées et ses mécanismes de défaillance. Xanthane - moléculaire simple étirement Xanthane est un polysaccharide bactérien, avec un squelette moléculaire identique à la cellulose. Les propriétés chimiques des groupes latéraux donner le polymère de nombreuses applications industrielles, de la stabilisation des aliments à la récupération du pétrole. Lorsque la molécule de xanthane est tendu entre la pointe et la surface, les groupes latéraux courts n'ont pas un effet significatif sur les propriétés élastiques, et le comportement est similaire à une chaîne de cellulose (carboxyméthylée) unique. Moléculaire élevé des polymères de xanthane poids peut avoir des longueurs de quelques microns, et les courbes d'étirement peut être utilisé comme un exemple pour l'extension moléculaires simples. Pour des forces faibles, la chaîne est tendue contre le ressort entropique. À un certain point, comme la longueur de bout en bout des approches de la longueur du contour, l'élasticité de l'épine dorsale de l'élasticité devient important. La figure 3 montre la courbe de rétraction d'une molécule de xanthane seul être étiré (dans une solution tampon phosphate) en utilisant le NanoWizard ® AFM. La déflection du cantilever a été étalonné selon la méthode du bruit thermique. Par comparaison avec les modèles, la distance pointe-échantillon doit également être corrigé pour la déviation du cantilever pour obtenir une valeur réelle séparation, ce qui est montré ici. Une plus grande force négative correspond à l'extrémité étant déviés plus vers la surface, et donc une force supérieure extensionnel sur la molécule.  Figure 3. Spectroscopie de force rétracter la courbe d'une molécule de xanthane seul être étirée. Une courbe pour le modèle étendu FJC est également montré pour la comparaison. Une courbe à partir du modèle étendu FJC est également montré dans la figure 3 pour la comparaison, calculée en utilisant une longueur de Kuhn de 6 nm et une longueur de contour de 1,25 microns. L'ajustement pour la simple FJC ou WLC modèle était raisonnable pour les petites forces d'extension (en dessous autour 50pN dans ce cas), mais les courbes ont divergé à des forces supérieures. Ainsi le modèle étendu CJF avec l'élasticité segment supplémentaire a été utilisé, pour tenir compte de l'épine dorsale qui s'étend à des forces supérieures en extension. Dans le cas du xanthane, un seul lien à long entre la pointe et la surface est étirée. Comme la molécule est tellement longue, la force de prolonger, il est très petit pour une grande partie de la courbe des étirements, et le comportement est dominé par la plus forte force d'étirement dont la longueur étirée est proche de la longueur du contour. Pour plus de molécules complexes plié, comme les protéines, une série d'étirements ces événements sont généralement considérés comme les différentes parties de la structure de déplier et sont étendues. Bactériorhodopsine - Extraction et dépliage La bactériorhodopsine est une protéine membranaire intégrale de cellules bactériennes, ce qui génère de l'énergie pour les cellules à partir de photons de lumière. Il ya 7 hélices alpha transmembranaires, avec des boucles peptidiques plus désorganisé entre eux. Lorsque l'une des extrémités de la protéine est saisi et a tiré, puis les hélices alpha sont retirés de la membrane, et qu'ils se déroulent comme elles sont retirées. Membrane pourpre est la source naturelle pour la bactériorhodopsine, et se compose de lipides 25% et 75% bactériorhodopsine. La protéine est disposée comme trimères dans une structure cristalline en 2 dimensions, qui peuvent être imagées par l'AFM, comme le montre la figure 4 (gracieuseté échantillon de DJ Müller, Technique Université , Dresde , Allemagne . La forme trimère caractéristique peut être vu dans l'image. La protéine peut être imagée en utilisant l'AFM et des protéines individuelles sélectionnées et tiré à l'aide de la pointe. La pointe peut être enduit spécialement, et les molécules modifiées pour ramasser une partie particulière de la structure, ou la pointe peut être pressés dans la surface pour ramasser une molécule non spécifique.  Figure 4. Image de la hauteur de la membrane pourpre AFM (côté cytoplasmique), prises à l'aide JPK NanoWizard ® en mode contact dans une solution tampon (170nm x 100 nm, portée en hauteur 1nm) Un diagramme schématique du processus de déroulement est montré dans la Figure 5. Les sept hélices alpha sont présentés dans la partie A, avec la pointe AFM ramasser un bout (à noter que dans la protéine réelle, l'alpha-hélices sont regroupés dans un ensemble, pas une ligne). Il ya beaucoup de voies possibles déroulement, mais les événements les plus probables sont que la alphahelices sont retirés dans les paires. Une progression de trois états partiellement dépliée est montré dans la partie B de la figure 5, avec des paires de hélices alpha déroule comme elles sont extraites de la membrane.  Figure 5. Schéma de la bactériorhodopsine déroulement en utilisant la pointe de l'AFM. Une extrémité de la molécule est capté par l'extrémité (A), et les hélices alpha sont retirés de façon séquentielle par paires (B). La figure 6 montre une superposition des courbes de bactériorhodopsine 10 dépliage, avec la force comploté contre l'corrigées pointe-échantillon de séparation. Il ya une certaine adhérence comme la pointe quitte la surface, suivie de trois événements d'étirement et de déroulement principal, correspondant aux trois états de la figure 5 B. Les pics principaux sont autour de 20-30nm, 50nm et 40-60-80nm, qui conviennent bien avec les valeurs publiées dans la littérature. Le cantilever a été étalonné selon la méthode du bruit thermique, et les expériences menées dans le cadre de tampon (10 mM TRIS, 150 mM KCl, pH 7,6). La position exacte de la rupture de liaison des événements varie de courbe à courbe, ce qui est typique pour les obligations avec près d'énergie pour l'énergie thermique à température ambiante. L'étirement des pièces de la superposition des courbes dans la figure 6, montrant que les mêmes structures sont étirés dans chaque cas. Seul le moment réel où la rupture des liens tendus varie de courbe à courbe. Pour un lien avec l'énergie à proximité de l'énergie thermique, il ya une certaine probabilité d'échec dans un certain temps, même sans la force appliquée. Cela correspond à la normale "hors-taux" vu pour la réaction de liaison libre en solution. Pour les liens avec les énergies d'un peu plus l'énergie thermique, qui sont normalement stables, la probabilité d'avoir trahi leur confiance augmente spontanément comme une force est appliquée.  Figure 6. Dépliage courbes de la bactériorhodopsine étant sorti de membrane pourpre (superposition des courbes 10 se rétractent). Une façon de penser à un événement d'étirement, donc, est que les liens sont tendus jusqu'à la barrière d'énergie pour déplier est dans la gamme thermique. Le moment réel où les liens ne dépend soudainement une fluctuation aléatoire thermique, qui prend la molécule au cours de la barrière d'énergie se déroule. La dépendance du temps signifie que le taux mesuré déroulement dépendra de la vitesse de chargement, ou la rapidité avec laquelle la pointe est en tirant l'extrémité libre de la molécule.  Figure 7. Histogramme de la position des trois pics déroulement (séparation de l'échantillon pointe corrigée) pour un ensemble de courbes bactériorhodopsine 355 dépliage. Beaucoup de courbes déroulement de la bactériorhodopsine peuvent être collectées pour donner une vision statistique du déroulement des événements. La molécule peut se dérouler de plusieurs façons, de sorte que certains de sélection doit être faite dans les courbes de la force de choisir un sous-ensemble particulier. Dans ce cas, seuls les courbes montrant les trois principaux événements de l'étirement, comme dans les exemples à la figure 6, ont été sélectionnés. Dans la figure 7 un histogramme est présenté, montrant la répartition de séparation pointe-échantillon pour les trois pics (données pour n = 355 courbes). L'analyse de la courbe force a été partiellement réalisée en utilisant le logiciel PUNIAS.  Figure 8. Diagramme de dispersion de la force contre la position (pointe-échantillon de séparation corrigée) pour le déroulement des événements montre la figure 6. La figure 8 montre un diagramme de dispersion de la force de déroulement par rapport à la position de l'événement pour le même ensemble de données comme dans la Figure 7. La force pour le premier événement se déroule (pic 1) est significativement plus élevé que pour les événements ultérieurs (pics 2 et 3). Une fois la structure de la protéine a été perturbé, alors la force nécessaire pour tirer le reste hélices alpha de la membrane est réduite. Les courbes montrent aussi déplier les différentes voies pour la molécule de se dérouler et se retirer de la membrane. De la connaissance de la structure des protéines et des acides aminés des longueurs de chaînes d'acides, les courbes d'extension peut être équipé de montrer clairement quelle voie se déroule est pris dans une courbe de force particulière. Titin Dépliage Titin est une protéine du tissu musculaire, qui se compose de plusieurs domaines globulaires répétés. Dans le tissu musculaire, il est responsable des propriétés mécaniques à l'échelle macroscopique. L'AFM permet d'étudier les propriétés des molécules titine nanomécaniques individuels. Comme la molécule est étirée, à un certain moment de la détention d'obligations d'un domaine particulier ainsi que va échouer. Ce domaine particulier globulaires se déploie alors, conduisant à une plus grande longueur de contour pour la molécule. Avec plus de traction, cette section de linéaires d'acides aminés est également tendue, et l'un des autres domaines atteindra son point de défaillance. Ceci est illustré schématiquement à la figure 9.  Figure 9. Schéma de titine étirement, comme successives domaines globulaires se dérouler. Comme la protéine est tiré, les domaines "pop" ouverts de façon séquentielle, ce qui conduit à une séquence caractéristique des pics dans les courbes de déflexion. La forme de chaque partie incurvée successifs de la parcelle de force reflète l'augmentation de la longueur effective de la molécule dans les domaines sont dépliées. Une force titine typiques d'extension spectroscopie rétracte courbe est représentée à la figure 10 (gracieuseté de données de Matthias Amrein, Université de Calgary, au Canada, obtenus en utilisant la NanoWizard ® AFM sur une seule IG8 protéines musculaires titine). La séquence titine caractéristique de déroulement des événements peut être clairement vu. La force augmente de façon constante, que la tension augmente dans la molécule. Soudain, la force diminue fortement comme un domaine Ig s'ouvre automatiquement et la tension est relâchée. La courbe de chaque région s'étendant peut être équipé avec le CJF ou modèle WLC pour la durée correspondante d'acides aminés libres. La taille de la force de déroulement d'un seul domaine est dans la gamme de 190-250pN, et la longueur du contour d'un domaine (crête à crête à distance) est 28nm.  Figure 10. Courbe de force d'étirement titine, montrant séquentielle déroulement des domaines globulaires (gracieuseté de données de Matthias Amrein, Université des Calgary ). Applications Une grande variété de protéines peut être étiré et déplié en utilisant l'AFM. Deux exemples ont été présentés ici, une protéine membranaire et une protéine cytoplasmique. Cette méthode peut être étendue à d'autres protéines, pour obtenir des informations sur la fois la structure des protéines normales et ses modes de défaillance. Dans le cas de la bactériorhodopsine, la protéine forme des structures très fortement emballé dans la paroi cellulaire bactérienne, et est donc l'une des protéines membranaires rares peut être cristallisé à haute résolution pour la détermination de structure. Cette méthode peut être appliquée plus généralement, cependant. Pour la plupart des protéines membranaires, la séquence d'acides aminés est beaucoup plus facile à déterminer que la structure repliée, puisque plupart des protéines membranaires ne sont pas appropriés pour la cristallisation. Déroulement des événements mesurés avec l'AFM, qui montrent le changement de longueur d'acides aminés que les différentes unités structurelles se dérouler, peut être utilisé avec la séquence connue pour interpréter la structure tertiaire des protéines membranaires. Revêtement spécifique de la sonde, et la modification de la protéine d'avoir spécifique "pick-up» peut conduire à des points en tirant la protéine à différents endroits, et des informations supplémentaires sur la façon donc les unités structurelles sont reliés entre eux dans la structure 3-D. Ainsi l'AFM est capable de donner un aperçu de la configuration d'une seule molécule et permettre une mesure indépendante des propriétés moléculaires d'affiner les techniques de modélisation moléculaire. AFM peut aussi être combinée avec des techniques de fluorescence seule molécule comme FRBR ou FRET. |