Indagine Strutturale sulle Singole Biomolecole e su Allungamento Molecolare Facendo Uso delle Tecniche Atomiche del Microscopio della Forza dagli Strumenti di JPK

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Sfondo

Esperimenti d'Allungamento Molecolari

Caratteristiche delle Macromolecole in soluzione

Elasticità Entropica

Xantano - Allungamento Molecolare Semplice

Bacteriorhodopsin - Estrazione e Spiegamento

Spiegamento di Titin

Applicazioni

Sfondo

La spettroscopia e la Cristallografia a raggi x RMN sono corrente le tecniche più comuni capaci di determinazione delle strutture delle macromolecole biologiche come le proteine e gli acidi nucleici ad un livello atomico di risoluzione. Il microscopio atomico della forza (AFM) principalmente è conosciuto per le sue capacità della rappresentazione, ma è egualmente uno strumento molto sensibile per quantitativamente la misurazione delle forze ad un singolo livello della molecola.

Questa capacità permette l'uso del AFM come tecnica alternativa per l'indagine sulla configurazione strutturale delle macromolecole nelle circostanze indigene. La Misurazione delle forze in seno e tra le singole molecole fornisce un altro approccio alla comprensione dei paesaggi molecolari di energia e della cinetica di reazione chimica. Il AFM può misurare le diverse obbligazioni che si formano e che si rompono, piuttosto che essendo limitando alle medie statistiche sopra una popolazione.

Questo rapporto si concentra sull'uso del AFM manipolare le singole molecole per estrarre le informazioni sulla struttura molecolare o sulla conformazione e sulle forze vincolanti intramolecolari. È egualmente possibile studiare i fenomeni dipendenti dal tempo, quale la dinamica intramolecolare in macromolecole, nel riconoscimento molecolare o nella folding proteico in situ.

Esperimenti d'Allungamento Molecolari

La spettroscopia della Forza è un modo del AFM dove il suggerimento è alzato ed è abbassato sopra un unico sulla superficie, mentre la deformazione o altri beni a mensola è misurato. Ciò dà un profilo delle forze alle altezze differenti sopra la superficie.

Negli esperimenti d'allungamento molecolari, il suggerimento è messo solitamente in contatto con la superficie, le molecole sul substrato sono permesse interagire con il suggerimento e poi la trave a mensola è ritirata. Questo movimento è indicato schematicamente nella serie di immagine nella Figura 1 - verso il campione (l'approccio) e poi via ancora (il ritiro). Mentre la trave a mensola è mossa a partire dalla superficie, la deformazione riflette le forze fra il suggerimento e la superficie. Se una singola molecola è tenuta fra il suggerimento e la superficie, quindi la deformazione della trave a mensola dà una misura della forza esercitata sulla molecola.

Nella rappresentazione schematica nella Figura 1, una singola molecola è indicata l'allungamento fra il suggerimento ed il substrato. La molecola può avere una struttura profilatura tridimensionale definita, per quanto riguarda le proteine, per esempio, o può essere una catena disordinata, quali molti altri polimeri lunghi. L'interazione adesiva fra il suggerimento e la molecola ha luogo solitamente nella parte repellente del contatto della curva della forza, ma le funzionalità di interesse per l'allungamento molecolare sono trovate nella curva di ritiro.

Figura 1.

Le molecole A lunga catena, quali DNA o dextrano, possono essere allungate fra il suggerimento ed il campione. La lunghezza della persistenza e di rigidezza può essere veduta dall'allungamento iniziale della molecola. Le transizioni molecolari Interne possono anche essere studiate, quale la transizione di fusione in DNA mentre la spina dorsale riorganizza nell'ambito di più alta tensione. Le Molecole con la struttura dimensionale del complesso 3, quali molte proteine, possono essere spiegate in un modo controllato in moda da potere studiare le unità strutturali. Titin e il bacteriorhodopsin sono esempi delle proteine che sono state studiate intensivamente. Le proteine della Membrana possono essere estratte della membrana e “schioccare„ dalle diverse alfa-eliche è stato veduto.

Caratteristiche delle Macromolecole in soluzione

Le molecole Lunghe in soluzione sono raramente bastoncine bastoncino o rigide e spesso hanno un'alta flessibilità lungo la spina dorsale della molecola. Anche il DNA a doppia elica, che è pensato solitamente come a molecola “rigida„ a causa della struttura dell'doppio elica, è sistemato come groviglio casuale per le lunghezze oltre alcuni cento nanometri. Ciò significa che c'è una grande differenza fra la lunghezza della molecola misurata lungo la catena o spina dorsale (la lunghezza di contorno) e le dimensioni che tipiche occupa in soluzione (per esempio il raggio della rotazione o della lunghezza faccia a faccia), che sono molto più piccole.

Figura 2.

La disposizione è rappresentata schematicamente nella Figura 2. Nella parte A, Una molecola lunga è indicata in una conformazione estesa. Nella parte B, Una conformazione differente è indicata dove la molecola è in un groviglio casuale rilassato che occupa una dimensione laterale molto più piccola che la lunghezza di contorno. Ci sono molte altre conformazioni simili a quella indicata in B disponibile alla molecola che le conformazioni simili a quella indicata in A e questo piombo alla differenza nell'entropia o nell'energia libera delle conformazioni differenti.

C'è un costo nell'energia libera per raddrizzare fuori una molecola da conformazione B a A, poiché il numero delle conformazioni relative disponibili è diminuito. Questa differenza di energia libera traduce ad una forza che resiste al raddrizzamento ed agisce come “una sorgente„ entropica. Ciò è contrariamente alla situazione su un disgaggio macroscopico, in cui tirare una stringa flessibile non richiede una forza significativa finché non sia diritta e la spina dorsale reale sia allungata.

Quando le molecole lunghe sono tirate, una forza è richiesta per estendere la molecola verso una conformazione diritta anche se le obbligazioni nella spina dorsale non stanno allungande.

Elasticità Entropica

Due modelli di base sono comunemente usati per questa elasticità entropica, dipendendo se una certa rigidezza a catena è inclusa. Nel modello a catena liberamente (FJC) congiunto, la spina dorsale è modellata come piccole unità connesse dalle giunture completamente “libere„, di modo che le unità adiacenti possono avere tutto l'angolo fra loro senza costo energetico extra. Il modello a catena (WLC) del tipo di verme, al contrario, è un filamento continuo con rigidezza a catena integrato ed è un migliore modello per le molecole quale il DNA a doppia elica. Una lunghezza della persistenza è definita, che rappresenta la lunghezza della catena sopra cui l'orientamento iniziale è ripartito con scelta casuale.

Se una curva di forza-estensione è raccolta, quindi può essere misura da uno di questi modelli per ottenere la lunghezza della molecola che è allungata e dalla lunghezza della persistenza per il modello di WLC.

Alcune molecole specializzate, quali le proteine, hanno normalmente una struttura tridimensionale (profilatura) definita in soluzione. Questa struttura è il tasto alla loro funzione biologica come gli enzimi o unità strutturali, per esempio. La catena del polipeptide non è una spirale sciolta rilassata, ma profilatura in una struttura molto più rigida ed è tenuta insieme da molte obbligazioni. Se la proteina è spiegata, con forza, prodotto chimico o il termale cambia, quindi la catena libera del polipeptide si comporta come una molecola lineare semplice. L'allungamento entropico può essere veduto, poichè le obbligazioni lungo la spina dorsale del polipeptide sono altamente flessibili. Le parti Definite della struttura della proteina, quali le alfa-eliche o i domini globulari, possono essere spiegate in sequenza e la lunghezza “libera„ misurata della molecola basata sulle curve d'allungamento aumenterà con ogni evento di spiegamento. I punti di spiegamento della proteina forniscono informazioni sulla struttura profilatura normale e sui sui meccanismi di errore.

Xantano - Allungamento Molecolare Semplice

Il Xantano è un polisaccaride batterico, con una spina dorsale molecolare identica a cellulosa. I beni chimici dei gruppi laterali danno al polimero molte applicazioni industriali, da stabilizzazione dell'alimento al ripristino del petrolio.

Quando la molecola del Xantano è allungata fra il suggerimento e la superficie, i brevi gruppi laterali non hanno un effetto significativo sui beni elastici ed il comportamento è simile ad una singola catena (carboxymethylated) della cellulosa. I polimeri del xantano di Alto peso molecolare possono avere lunghezze di parecchi micron e le curve d'allungamento possono essere usate da esempio per l'estensione molecolare semplice. Per le forze basse, la catena è allungata contro la sorgente entropica. Ad un certo punto, come la lunghezza faccia a faccia si avvicina alla lunghezza di contorno, l'elasticità dell'elasticità della spina dorsale diventa importante.

Figura 3 mostra la curva di ritiro di singola molecola del Xantano che è allungata (in una soluzione del tampone fosfato) facendo uso del NanoWizard® AFM. La deformazione a mensola è stata calibrata facendo uso del metodo termico di disturbo.

Per il confronto con i modelli, la distanza del suggerimento-campione deve anche essere corregta la deformazione della trave a mensola per ottenere un valore reale della separazione, che è indicato qui. Una più grande forza negativa corrisponde al suggerimento che è deviato più verso la superficie e quindi una forza extensional più elevata sulla molecola.

Figura 3.

Una curva dal modello esteso di FJC egualmente è indicata nella Figura 3 per il confronto, calcolata facendo uso di una lunghezza di Kuhn di 6 nanometro e di una lunghezza di contorno di 1,25 micron. La misura per il modello semplice di WLC o di FJC era ragionevole per le piccole forze extensional (sotto intorno a 50pN in questo caso), ma le curve hanno diverso alle forze più elevate. Quindi il modello esteso di FJC con l'elasticità supplementare di segmento è stato usato, per tenere conto della spina dorsale che allunga alle forze extensional più elevate.

Nel caso di Xantano, un singolo collegamento lungo fra il suggerimento e la superficie è allungato. Poiché la molecola è così lunga, la forza per estenderla è molto piccola per gran parte della curva d'allungamento ed il comportamento è dominato dalla alto-forza che allunga dove la lunghezza allungata è vicino alla lunghezza di contorno. Per più le molecole profilatura complesso, quali le proteine, una serie di questi eventi d'allungamento è veduta generalmente mentre le parti differenti della struttura spiegano e sono estese.

Bacteriorhodopsin - Estrazione e Spiegamento

Bacteriorhodopsin è una proteina integrale della membrana dalle celle batteriche, che genera l'energia per le celle dai fotoni leggeri. Ci sono 7 alfa-eliche del transmembrane, con più cicli disorganizzati del peptide fra loro.

Quando un'estremità della proteina è afferrata e tirato, quindi le alfa-eliche sono estratte della membrana e spiegano mentre sono estratte.

La membrana Porpora è la sorgente naturale per il bacteriorhodopsin e consiste dei lipidi di 25% e del bacteriorhodopsin di 75%. La proteina è sistemata come trimeri in un sistema cristallino dimensionale 2, che può essere imaged facendo uso del AFM, secondo le indicazioni di Figura 4 (cortesia del campione di D.J. Müller, TechnicalUniversityDresdenGermany

Figura 4.

Una rappresentazione schematica del trattamento di spiegamento è indicata nella Figura 5. Le sette alfa-eliche sono indicate nella parte A, Con il suggerimento del AFM che prende un'estremità (nota che nella proteina reale, le alfa-eliche sono raggruppate insieme in un gruppo, non una riga). Ci sono molte vie possibili di spiegamento, ma gli eventi più probabili sono che i alphahelices sono estratti nelle paia. Una progressione di tre stati parzialmente spiegati è indicata nella parte B Di Figura 5, con le paia delle alfa-eliche che spiegano mentre sono estratti dalla membrana.

Figura 5.

Figura 6 mostra una sovrapposizione di 10 curve di spiegamento di bacteriorhodopsin, con la forza tracciata contro la separazione corretta del suggerimento-campione. C'è una certa aderenza poichè il suggerimento lascia la superficie, seguita dall'allungamento principale tre ed eventi spiegare, corrispondenti ai tre stati come appare la Figura 5 B. I picchi principali sono intorno a 20-30nm, a 40-50nm e a 60-80nm, che sono d'accordo bene con i valori pubblicati nella letteratura. La trave a mensola è stata calibrata facendo uso del metodo termico di disturbo e degli esperimenti effettuati nell'ambito del buffer (10mM TRIS, KCl di 150mM, pH 7,6).

La posizione esatta degli eventi di errore schiavi varia dalla curva alla curva, che è tipica per le obbligazioni con energia vicino ad energia termica alla temperatura ambiente. Le parti d'allungamento delle curve hanno ricoperto nella Figura 6, indicante che le stesse strutture stanno allungande in ogni caso. Soltanto il momento reale in cui la rottura allungata delle obbligazioni varia dalla curva alla curva. Per un'obbligazione con energia vicino all'energia termica, c'è una certa probabilità di che viene a mancare nei limiti di certo tempo, anche senza la forza applicata. Ciò corrisponde “al fuori rate„ normale veduto liberamente per la reazione obbligatoria in soluzione. Per le obbligazioni con le energie un piccolo sopra l'energia termica, che sono normalmente stabili, la probabilità di loro che vengono a mancare spontaneamente aumenta mentre una forza è applicata.

Figura 6.

Un modo pensare ad un evento d'allungamento, quindi, è che le obbligazioni siano sforzate finché la barriera di energia a spiegare non sia all'interno dell'intervallo termico. Il momento reale quando le obbligazioni vengono a mancare improvvisamente dipende da una fluttuazione termica casuale, che cattura la molecola sopra la barriera di energia di spiegamento. La dipendenza di tempo significa che la tariffa misurata spiegare dipenderà dal tasso di carico, o la velocità con cui il suggerimento sta tirando l'estremità libera della molecola.

Figura 7.

Molti curve di spiegamento del bacteriorhodopsin possono essere raccolti per dare un parere statistico degli eventi di spiegamento. La molecola può spiegare in parecchi modi, in modo da una certa selezione deve essere fatta nelle curve della forza per scegliere un sottoinsieme particolare. In questo caso, soltanto le curve che mostrano i tre eventi d'allungamento principali, quali gli esempi nella Figura 6, sono state selezionate. Nella Figura 7 un istogramma è presentato, mostrante la distribuzione della separazione del suggerimento-campione per i tre picchi (dati per N = 355 curve). L'analisi della curva della forza parzialmente è stata effettuata facendo uso del software di PUNIAS.

Figura 8.

Figura 8 mostra un diagramma dello spargimento della forza di spiegamento contro la posizione dell'evento per lo stesso insieme di dati di nella Figura 7. La forza per il primo evento di spiegamento (Picco 1) è significativamente superiore a per gli eventi successivi (Picchi 2 e 3). Una Volta Che la struttura della proteina è stata interrotta, quindi la forza richiesta per tirare le alfa-eliche restanti dalla membrana è diminuita. Le curve di spiegamento egualmente mostrano le vie differenti affinchè la molecola spieghino e per estrarre della membrana. Da una conoscenza delle lunghezze a catena della struttura e dell'amminoacido della proteina, le curve extensional possono essere misura per mostrare chiaramente quale percorso di spiegamento è contenuto una curva particolare della forza.

Spiegamento di Titin

Titin è una proteina dal tessuto del muscolo, che consiste di parecchi domini globulari ripetuti. All'interno del tessuto del muscolo è responsabile dei beni meccanici su un disgaggio macroscopico. Il AFM permette lo studio sui beni nanomechanical di diverse molecole di titin. Poichè la molecola è allungata, ad un certo punto le obbligazioni che tengono un dominio particolare verranno a mancare insieme. Questo dominio globulare particolare poi spiega, piombo ad una lunghezza più lunga di contorno per la molecola. Con più ulteriormente la trazione, questa sezione degli amminoacidi lineari egualmente è allungata ed uno degli altri domini raggiungerà il suo punto dell'errore. Ciò è illustrata schematicamente nella Figura 9.

Figura 9.

Mentre la proteina è tirata, i domini “schioccano„ si aprono in sequenza, piombo ad una sequenza caratteristica dei picchi nella deformazione curva. La forma di ogni parte curva successiva del tracciato della forza riflette la lunghezza utile aumentata della molecola mentre i domini sono spiegati.

Una spettroscopia tipica della forza di estensione di titin ritira la curva è indicata nella Figura 10 (cortesia di dati di Matthias Amrein, Università di Calgary, di Canada, ottenuti facendo uso del NanoWizard® AFM su una singola proteina di muscolo di titin Ig8). La sequenza caratteristica di titin degli eventi di spiegamento può essere veduta chiaramente. Gli aumenti della forza costantemente, come la tensione nella molecola aumenta. La forza diminuisce Improvvisamente marcato mentre gli schiocchi di un dominio di Ig si aprono e la tensione è allentata. La curva di ogni regione d'estensione può essere misura con il modello di WLC o di FJC per la lunghezza corrispondente dell'amminoacido libero. La dimensione della forza di spiegamento per un singolo dominio è nell'ordine di 190-250pN e la lunghezza di contorno di un dominio (distanza da picco a picco) è 28nm.

Figura 10. di).

Applicazioni

Un'ampia varietà di proteine può essere allungata e spiegata facendo uso del AFM. Due esempi sono stati indicati qui, una proteina della membrana ed una proteina citoplasmica. Questo metodo può essere estendere ad altre proteine, ad informazioni di guadagno sia sulla struttura normale della proteina che sui sui modi di errore. Nel caso del bacteriorhodopsin, la proteina forma le strutture molto altamente imballate nella parete cellulare batterica ed in modo da è una delle poche proteine della membrana che possono essere cristallizzate per la determinazione strutturale ad alta definizione.

Questo metodo può essere più generalmente applicato, tuttavia. Per la maggior parte delle proteine della membrana, la sequenza aminoacidica è molto più facile da determinare che la struttura profilatura, poiché la maggior parte delle proteine della membrana non sono adatte a cristallizzazione.

Gli eventi di Spiegamento misurati con il AFM, che mostrano il cambiamento di lunghezza dell'amminoacido mentre le unità strutturali differenti spiegano, possono essere usati con la sequenza conosciuta per interpretare la struttura terziaria delle proteine della membrana. Il rivestimento Specifico della sonda e la modifica della proteina per avere punti specifici “della raccolta„ possono piombo a tirare la proteina alle posizioni differenti e quindi all'ulteriore informazione circa come le unità strutturali sono connesse insieme nella struttura 3-D.

Così il AFM può dare la comprensione nella configurazione di singola molecola e permettere che una misura indipendente dei beni molecolari raffini le tecniche modellanti molecolari. Il AFM può anche combinarsi con le singole tecniche della fluorescenza della molecola quali TIRF o il CERCHIO.

Sorgente: Strumenti di JPK

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego gli Strumenti di JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:56

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