NMR分光法とX線結晶学は、現在の解像度の原子レベルでタンパク質や核酸などの生体高分子の構造を決定することができるもっとも一般的なテクニックです。原子間力顕微鏡（AFM）は、主に、そのイメージング機能のために知られていますが、それはまた、定量的に、単一分子レベルで力を測定するための非常に敏感なツールです。 この機能は、ネイティブ条件下での高分子の構造配置の調査のための代替技術として、AFMを使用することができます。単一分子内との間の力を測定することは分子のエネルギー地形と化学反応速度論の理解に別のアプローチを提供します。 AFMは、むしろ人口以上の統計的平均に限定されるより、個々の債券形成と破壊を測定することができます。 このレポートは、分子構造やコンフォメーション、および分子内の結合力に関する情報を抽出するために、単一の分子を操作するためにAFMを使用することに集中。それは、このような高分子の分子ダイナミクス、in situで分子認識やタンパク質の折りたたみのような時間依存現象を、研究することも可能です。 分子ストレッチ実験 たわみや他のカンチレバーの特性を測定している間力分光法は、先端が表面上の単一のポイントを超えて上下に移動しているAFMモードです。これは表面上の異なる高さで力のプロファイルを提供する。 分子伸張の実験では、先端は通常表面に接触され、基板上に分子が先端との対話が許可され、その後、カンチレバーが収納されています。この動きは、図1の画像のシリーズに模式的に示す-サンプルに向かって（アプローチ）してから離れて再び（撤回）。カンチレバーが離れて表面から移動すると、たわみは、先端と表面の間の力を反映している。単一分子の先端と表面の間に保持されている場合は、カンチレバーのたわみは、分子に加わる力の尺度を与える。 図1の回路図では、単一分子をチップと基板の間に張られて示されています。分子は、例えば、タンパク質のように、定義された三次元折り畳み構造を持っていること、またはそのような他の多くの長いポリマーなどの無秩序鎖であってもよい。先端と分子の間に接着剤の相互作用は、通常、フォースカーブの反発の接触部分で行われますが、分子伸張のために関心のある機能は、退避曲線に記載されています。  図1 AFMチップは、単一の分子を伸ばすために使用される力の分光実験の模式図 このようなDNAまたはデキストランなどの長鎖分子は、チップと試料の間に引き伸ばすことができます。剛性と持続長は、初期の分子の引き伸ばしから見ることができます。バックボーンは、より高い張力下で再配置するように内部の分子の遷移はまた、DNAの融解転移として、研究することができる。構造単位を調査できるように、そのような多くのタンパク質などの複雑な3次元構造を持つ分子は、制御された方法で展開することができます。タイチンとバクテリオロドプシンは、集中的に研究されているタンパク質の例です。膜タンパク質は、膜から取り出すことができ、個々のα-ヘリックスの"ポッピング"外が見られている。 溶液中の高分子の特性 ソリューションの長い分子はほとんど棒状や硬いものではなく、多くの場合、分子の骨格に沿った高い柔軟性を持っている。ため、通常二重らせん構造の"硬い"分子として考えていても、二本鎖DNAは、、数百ナノメートルを超える長さのランダムなもつれとして配置されている。これは、チェーンまたはバックボーン（輪郭の長さ）とそれが溶液中で占める典型的な次元に沿って測定された分子の長さに大きな差があることを意味する（旋回またはエンドツーエンドの長さの半径など）、そのはるかに小さいです。  図2。 長い分子の2つの可能な立体構造の模式図。で、分子は、溶液中の分子のためにそうコンフォメーションを伸ばしている。 Bは、分子が無秩序もつれになって、より一般的なコンフォメーションを示しています。 配置を図2に模式的に表されます。一部では、長い分子が拡張されたコンフォメーションに示されています。パートBでは、異なるコンフォメーションは分子が輪郭の長さよりはるかに小さい横寸法を占有しているリラックスしたランダム昆布のどこにあるか示されています。そこに示すようなコンフォメーションより分子に利用できるBに示すような、より多くのコンホメーションがあり、これは異なるコンフォメーションのエントロピーや自由エネルギーの差につながる。 利用可能な関連のコンフォメーションの数が減少するので、コンフォメーションBからに分子をまっすぐに自由エネルギーのコストがかかります。この自由エネルギー差は、矯正に抵抗する、とエントロピー"春"のように作用する力に変換されます。これはまっすぐであり、実際のバックボーンが引き伸ばされるまで、柔軟な文字列を引くことはかなりの力を必要としない巨視的スケール、上の状況と対照的である。 長い分子が引っ張られている場合、力がバックボーンの結合は引き伸ばされていない場合でも、ストレートコンフォメーションに向かって分子を拡張するために必要です。 エントロピー弾性 二つの基本的なモデルは、一般的にいくつかチェーンの剛性が含まれているかどうかによって、このエントロピー弾性のために使用されています。自由にジョイントチェーン（FJC）モデルでは、バックボーンは、隣接するユニットは、余分なエネルギーコストなしでそれらの間の任意の角度を持つことができるように、完全に"自由な"ジョイントで接続された小さなユニットとしてモデル化されます。ワームのようなチェーン（WLC）モデル、対照的に、年に建てチェーンの剛性を持つ連続フィラメントであり、そしてそのような二本鎖DNAなどの分子のためのより良いモデルです。持続長は、初期配向がランダム化されているその上、チェーンの長さを表す、定義されています。 力-伸展曲線が収集されている場合、それは伸縮される分子の長さを得るためには、これらのモデルのいずれか、およびWLCモデルの持続長により取り付けることができます。 タンパク質などの一部の特殊な分子は、通常は溶液中で（折り返し）の三次元構造を定義している。この構造は、例えば、酵素や構造単位としての生物学的機能の鍵となります。ポリペプチド鎖は、リラックスした緩いコイルではないが、かなり硬めの構造に折り畳まれ、多くの結合によって一緒に保持される。タンパク質が折り畳まれている場合、力、化学的または熱的変化によって、その後フリーのポリペプチド鎖は、単純な直鎖状分子のように動作します。ポリペプチド骨格に沿った結合が非常に柔軟であるため、ストレッチエントロピーは、見ることができます。 α-ヘリックスや球状ドメインのようなタンパク質の構造の定義の部分は、順次繰り広げすることができ、ストレッチの曲線に基づいて、分子の測定"自由な"長さは、各展開のイベントで増加します。ステップを展開するタンパク質は、正常な折り畳み構造とその故障メカニズムに関する情報を提供します。 キサンタン-ストレッチシンプルな分子 キサンタンはセルロースと同じ分子の骨格で、細菌の多糖類です。側鎖の化学的性質は、食品の安定化からの油回収に、ポリマーの多くの産業用途を与える。 キサンタンガム分子が先端と表面との間に伸縮すると、短辺のグループは、弾性特性に大きな影響を持っていない、および動作は、単一の（カルボキシメチル）セルロース鎖に似ています。高分子量のキサンタンガムのポリマーは、数ミクロンの長さを持つことができ、ストレッチング曲線は、単純な分子拡張の例として使用することができます。低力の場合、チェーンはエントロピーバネに引き伸ばされている。エンドツーエンドの長さは、輪郭長に近づくにつれて、いくつかの点で、、バックボーンの弾力性の弾力性が重要になります。 図3は、使用して引き伸ばされ、単一のキサンタンガム分子の撤回曲線（リン酸緩衝溶液中）を示してNanoWizard ® AFMを。カンチレバーのたわみは、熱雑音法を用いて校正されています。 モデルとの比較のために、探針-試料間距離もここに示されている実際の分離の値を、取得するためにカンチレバーのたわみを補正する必要があります。大きな負の力は、それ故に、より表面に向かって偏向されて先端部、および分子上のより高い引っ張り力に対応しています。  図3： フォーススペクトロスコピーは、引き伸ばされ、単一のキサンタンガム分子の曲線を引っ込める。拡張FJCモデルの曲線も比較のために示されています。 拡張FJCモデルから曲線も6nmのクーンの長さ1.25ミクロンの輪郭の長さを使用して計算、比較のため図3に示されています。シンプルなFJCまたはWLCモデルのフィットが小さい伸長力（以下この場合は50pN程度）のための合理的だったが、曲線はより高い力で拡散。したがって、追加のセグメントの弾力性と拡張FJCモデルは、高い引っ張り力でストレッチバックボーンを考慮するために、使用されていました。 キサンタンガムの場合には、先端と表面の間の単一の長いリンクが引き伸ばされている。分子は非常に長いので、力はそれがはるかにストレッチカーブのために非常に小さい期間を延長する、と動作は、ストレッチの長さは、輪郭の長さに近いところ、より高い力が伸張によって支配されている。タンパク質などのより複雑な折り分子、の場合は、これらのストレッチ、一連のイベントは、一般的に構造の異なる部分として見られている展開と拡張されています。 バクテリオロドプシン-抽出と展開 バクテリオロドプシンは、光の光子からの細胞にエネルギーを生成する細菌細胞からの膜内在性タンパク質である。 7回膜貫通α-ヘリックスは、それらの間のより多くの無秩序ペプチドループと、あります。 タンパク質の一端を把握し、引っ張られている場合、次にα-ヘリックスが膜から引き出され、それらが引き出されているとして、彼らが展開されています。 紫膜は、バクテリオロドプシンのための天然源であり、そして25％の脂質と75％のバクテリオロドプシンで構成されています。タンパク質は、図4に示すように、AFMを用いて画像化することができる2次元結晶構造、、（DJミュラーのサンプルの礼儀、の三量体として配置されている テクニカル 大学 、 ドレスデン 、 ドイツの 。特性量体の形状は画像で見ることができます。タンパク質は、AFM、次に個々のタンパク質を選択し、先端を使用してプルを用いて画像化することができます。先端は、特別にコーティングすることができる、との構造の特定の部分、または先端をピックアップするように変更分子が非特異的に分子をピックアップする面に圧入することができます。  図4 紫膜（細胞質側）のAFMの高さのイメージは、（170nm × 100 nmの、1nmの高さの範囲）の緩衝液に接触モードでJPK NanoWizard ®を使用して得られた 展開プロセスの概略図を図5に示されています。 sevenα-ヘリックスは、AFMの先端が一方の端を（実際のタンパク質で、α-ヘリックスが束ではなく、線で一緒にグループ化されていることに注意してください）拾うと、一部に表示されます。そこに多くの可能な展開経路がありますが、ほとんどのイベントはalphahelicesがペアで引き出されていることです。部分的に状態を展開した三つの進行は、それらが細胞膜から抽出されるα-ヘリックスのペアが展開して、図5のB部に示されています。  図5。AFM チップを用いて展開バクテリオロドプシンの模式図。分子の一方の端は、先端（）に拾われ、そしてα-ヘリックスは、（B）を順次ペアに引き出されている。 力が補正されたチップサンプルの分離に対してプロットした図6は、10バクテリオロドプシン展開曲線の重ね合わせを示しています。先端が表面を離れると、いくつかの接着は40 - 50nmのと60 - 80nmの、合意の主なピークは20 - 30nmのまわりにある図5のBに示す3つの状態に対応する3つの主要なストレッチや出来事を、続いて、あるよく文献に発表された値を持つ。カンチレバーは熱雑音の方法、およびバッファー（10mMのトリス、150㎜のKCl、pH7.6）で下に行った実験を用いて較正した。 債券の失敗イベントの正確な位置は、カーブから、室温でのエネルギーに近い熱エネルギーへと結合するための典型的な曲線、に変わります。同じ構造が各々の場合に引き伸ばされていることを示し、図6の曲線のオーバーレイの部分をストレッチ。引き伸ばされた債券のブレークが曲線から曲線に変化するだけ、実際の瞬間。熱エネルギーに近いエネルギーと結合の場合は、一定時間内に障害が発生したことのある確率もない加えられた力と、そこにあります。これは、溶液中の遊離の結合反応に見られる通常の"オフ率"に相当する。力が印加されると、通常は安定している小さな熱エネルギー以上のエネルギー、、付社債のためにそれらの確率が自発的に増加して失敗。  図6。 紫膜（10リトラクト曲線の重ね合わせ）から引き出されているバクテリオロドプシンの曲線を広げる。 ストレッチイベント考える一つの方法は、したがって、熱範囲内にある結合が展開するエネルギー障壁まで緊張しているということです。債券が突然失敗する実際の瞬間には、アンフォールディングのエネルギー障壁を介して分子を取るランダムな熱ゆらぎ、に依存する。時間依存性は、測定されたアンフォールディング速度は、載荷速度、または先端が分子の自由端を引っ張っていると速度に依存するということです。  図7。355 バクテリオロドプシン展開曲線のセットには3つの展開のピーク（先端のサンプル訂正分離）の位置のヒストグラム。 バクテリオロドプシンの多くの展開曲線を展開イベントの統計的なビューを提供するために収集することができる。分子はいくつかの方法で展開可能、いくつか選択が特定のサブセットを選択する力の曲線で作られているので。このケースでは、このような図6の例として3つの主要なストレッチのイベントを、示すだけの曲線は、選択された。図7ではヒストグラムは、次の3つのピーク（N = 355のカーブのデータ）のための探針-試料分離の分布を示す、表示されます。フォースカーブの解析は、部分的にPUNIASのソフトウェアを用いて行った。  図8 図 6に示すように展開するイベントのための位置（探針-試料訂正分離）に対する力の散布図。 図8は図7のと同じデータセットのイベントの位置に対する展開力の散布図を示しています。第一展開イベント（ピーク1）のための力は、後続のイベント（ピーク2と3）よりも有意に高いです。タンパク質の構造が破壊されると、その後、膜の残りのα-ヘリックスからをプルするために必要な力が低減されます。展開曲線も展開して膜からの撤退を分子に別の経路を示しています。タンパク質の構造とアミノ酸鎖長の知識から、伸長曲線が展開パスが特定のフォースカーブで撮影されて明確に示すために取り付けることができます。 アンフォールディングタイチン タイチンは、いくつかの繰り返しの球状ドメインから構成される筋肉組織からの蛋白質である。筋肉組織内には、巨視的なスケールでの機械的性質の責任です。 AFMは、個々のタイチン分子のナノ機械特性の研究が可能になります。分子が引き伸ばされているとして、いくつかの点で一緒に特定のドメインを保持している債券は失敗します。この特定の球状ドメインは、分子の長い輪郭の長さにつながる、繰り広げられる。さらに引っ張ると、線形アミノ酸のこのセクションはまた引き伸ばされ、そして他のドメインのいずれかは、その障害のポイントに到達します。これは図9に概略的に示されている。  連続する球状ドメインが展開 図 9。 タイチンの模式図は、ストレッチ。 タンパク質が引っ張られるように、ドメインは"ポップ"たわみ曲線のピークの特徴的な配列につながる、順番に開きます。力のプロットの各連続する湾曲した部分の形状は、ドメインが折り畳まれているとして、分子の増加効果的な長さを反映している。 典型的なタイチンの伸展力は、分光曲線が（使用して得られるマティアスAmreinのデータの礼儀、カルガリー、カナダの大学、図10に示されている引き込みNanoWizardシングルIg8タイチンの筋肉の蛋白質の® AFMを）。展開するイベントの特徴タイチンのシーケンスは、はっきりと見ることができます。力は、分子の増加の緊張として、着実に増加。 Igドメインが開いて飛び出すと緊張が解放されると急に力が著しく低下。各拡張領域のカーブはFJCまたは対応する遊離アミノ酸の長さのためのWLCモデルを装着することができます。単一のドメインの展開力の大きさは190 - 250pNの範囲にあり、と1つのドメイン（ピークツーピークの距離）の輪郭の長さは、28nm世代です。  図10。 タイチンのフォースカーブは、マティアスAmreinの（球状ドメインの展開シーケンシャルデータの礼儀を示し、ストレッチ 大学 中 カルガリー ）。 アプリケーション タンパク質の多種多様は引き伸ばされ、AFMを用いて繰り広げすることができます。二つの例は、ここに一つの膜蛋白質一細胞質タンパク質を示されている。このメソッドは、通常のタンパク質の構造とその故障モードの両方に関する情報を得るために、他のタンパク質に拡張することができます。バクテリオロドプシンの場合には、蛋白質は細菌の細胞壁は非常に高度にパックされた構造を形成し、その高分解能構造決定のために結晶化することができますいくつかの膜タンパク質の一つです。 このメソッドは、より一般的にはしかし、適用することができます。ほとんどの膜タンパク質の結晶化に適していないので、ほとんどの膜タンパク質の場合は、アミノ酸配列は、折り畳み構造より判断する方がはるかに簡単です。 異なる構造単位が展開として、アミノ酸の長さの変化を示すAFM、、で測定した出来事を、膜タンパク質の立体構造を解釈するために公知の配列を使用することができます。 Specificプローブのコーティング、および特定の"ピックアップ"のポイントを持っているタンパク質の修飾は、異なった場所でタンパク質を引っ張って、構造単位が3次元構造で接続されている方法については、したがってさらなる情報につながることができます。 このようにAFMは、単一分子のコンフィギュレーションへの洞察を与えると分子モデリング技術に磨きをかけるために分子特性の独立した測定を可能にすることができます。 AFMはまた、全反射、またはFRETを単一分子の蛍光技術と組み合わせることができます。 |