JPK の器械からの原子力の顕微鏡の技術を使用して単一の生体物質そして分子伸張の構造調査

カバーされるトピック

背景

分子伸張の実験

解決の高分子の特性

Entropic 伸縮性

Xanthan - 簡単な分子伸張

Bacteriorhodopsin - 抽出および展開

Titin の展開

アプリケーション

背景

NMR 分光学および X 線の結晶学は現在解像度の原子レベルで蛋白質および核酸のような生物的高分子の構造を定めることができる共通の技術です。 原子力の顕微鏡は (AFM)イメージ投射機能のために大抵知られていますが、それはまた量的に単一の分子のレベルの力を測定するための非常に敏感なツールです。

この機能はネイティブ条件の下で高分子の構造構成の調査のための代わりとなる技術として AFM の使用を可能にします。 単一の分子内および相互間で力を測定することは分子エネルギー景色および化学反応の動力学の理解に別のアプローチを提供します。 AFM はできま人口上の統計的な平均に限定されますよりもむしろ、形作り、壊れる個々の結束を測定。

このレポートは AFM の使用分子構造または構造についての情報を得るために単一の分子を処理するおよび分子内拘束力に集中します。 高分子、分子認識またはフォールディングの分子内原動力のような時間依存現象を、そのままで調査することもまた可能です。

分子伸張の実験

力の分光学は偏向か他の片持梁特性は測定されるが、先端が表面の一点の上で上下に動く AFM のモードです。 これは表面の上の異なった高さで力のプロフィールを与えます。

分子伸張の実験では、先端は通常表面が付いている接触に持って来られます、基板の分子が先端と相互に作用するそれから片持梁は引き込みます。 次にこの動きは - サンプル (アプローチ) の方の…図 1 の画像シリーズでおよび再度図式的に示されています (引き込め)。 片持梁が表面から移られると同時に、偏向は先端と表面間の力を反映します。 単一の分子が先端と表面の間で保持されれば、片持梁の偏向は分子で出る力の測定を与えます。

図 1 の図式的な図表では、単一の分子は先端と基板の間の伸張を示されています。 分子は蛋白質、例えば、またはそれのため他の多くの長いポリマーのような不調な鎖が、であるように定義された三次元折られた構造があるかもしれません。 先端と分子間の付着力の相互作用は通常力のカーブの冷淡な接触の部品で起こりますが、分子伸張のための興味の機能は引き込めのカーブにあります。

図 1。

長い鎖の分子は、 DNA またはデキストランのような先端とサンプルの間で、伸ばすことができます。 剛さおよび持続の長さは分子の最初の伸張から見ることができます。 内部分子転移はまた DNA の溶ける転移のようなバックボーンが高圧の下で再配列すると同時に、調査することができます。 複雑な 3D 構造が付いている分子は、多くの蛋白質のような制御された方法で、構造単位が調査することができるように開くことができます。 Titin および bacteriorhodopsin は集中的に調査された蛋白質の例です。 膜蛋白質は膜から引き出すことができ個々のアルファ螺旋形から 「ぽんと鳴ることは」見られました。

解決の高分子の特性

解決の長い分子はまれに棒そっくりまたは堅くないし、頻繁に分子のバックボーンに沿う高い柔軟性があります。 通常二重螺旋形の構造のために 「堅い」分子としてについて考えられる残された DNA を配列されます数百ナノメーターを越える長さのための任意もつれとして倍増して下さい。 これは鎖に沿って測定される分子の長さ間に大きい相違がかバックボーン (輪郭の長さ) および大いにより小さい、解決 (例えばかエンドツーエンドの長さ回転半径) で占める典型的な次元あることを意味します。

図 2。

整理は図 2. で図式的に表されます。 パート A では、長い分子は拡張構造で示されています。 パート B では、別の構造は分子が輪郭の長さより大いに小さい側面次元を占めるリラックスした任意もつれにあるところで示されています。 分子に使用できる B で示されているものに類似した A で示されている 1 に類似した構造よりもっとたくさんの構造がありこれは異なった構造のエントロピーまたは自由エネルギーの相違の原因となります。

使用できる関連の構造の番号が減るので構造 B からの A に分子をまっすぐにする自由エネルギーに費用があります。 この自由エネルギーの相違はまっすぐになることに抵抗する変換し、 entropic 「ばねのように」機能します力に。 これは適用範囲が広いストリングを引っ張ることが重要な力を必要としないマクロスコピックスケールの状態に対してまっすぐになり、実際のバックボーンが伸びるまであります。

長い分子が引っ張られるときバックボーンの結束が伸ばされなくてもまっすぐな構造の方の分子を伸ばすために、力は必要となります。

Entropic 伸縮性

2 つの基本的なモデルはこの entropic 伸縮性のために広く使われて、チェーン剛さが含まれているかどうか依存します。 自由に接合されたチェーンモデル (FJC)では、バックボーンは完全に 「自由な」接合箇所によって接続される小さい単位として隣接した単位は余分エネルギー・コストなしでその間の角度があることができるように模倣されます。 ワームのようなチェーン (WLC)モデルは、対照的に、構築されるチェーン剛さの連続的なフィラメントで二重残された DNA のような分子のためのよりよいモデルです。 最初のオリエンテーションがランダム化される鎖の長さを表す持続の長さは定義されます。

力拡張カーブが集められれば、伸びる分子の長さを得るためにこれらのモデルの 1 つおよび WLC モデルのための持続の長さによって合うことができます。

ある専門にされた分子に、蛋白質のような解決で、普通定義された (折られた) 三次元構造があります。 この構造は酵素か構造単位として生物的機能へキー、例えばです。 ポリペプチドの鎖はリラックスした緩いコイルでし、大いにより堅い構造に折られ、そして多くの結束によってまとめられます。 蛋白質が、力によって、化学薬品開かれるかまたは上昇温暖気流が変更すれば、自由なポリペプチドの鎖は簡単な線形分子のように動作します。 entropic 伸張はポリペプチドのバックボーンに沿う結束が非常に適用範囲が広いので見ることができます。 蛋白質の構造の定義された部分は、アルファ螺旋形または球状領域のような、次々に開くことができ伸張のカーブに基づいて各展開のイベントと分子の測定された 「自由な」長さは増加します。 蛋白質の展開のステップは常態によって折られる構造および故障メカニズムについての情報を提供します。

Xanthan - 簡単な分子伸張

Xanthan はセルロースと同一の分子バックボーンを搭載する細菌の多糖類、です。 側面のグループの化学特性はポリマーに食糧安定からのオイルの回復に多くの産業アプリケーションを、与えます。

Xanthan の分子が先端と表面の間で伸びるとき、短い側面のグループは伸縮性がある特性に対する重要な効果をもたらさないし、動作は単一の (carboxymethylated) セルロースの鎖に類似しています。 高分子量の xanthan ポリマーは複数のミクロンの長さがあり伸張のカーブは簡単な分子拡張の一例として使用することができます。 低い力のために、鎖は entropic ばねに対して伸びます。 ある時点でエンドツーエンドの長さが輪郭の長さに近づくと同時に、バックボーンの伸縮性の伸縮性は重要になります。

図 3 は NanoWizard® AFM を使用して (リン酸緩衝液解決で) 伸びる単一の Xanthan の分子の引き込めのカーブを示します。 片持梁偏向は熱騒音方法を使用して目盛りが付いていました。

モデルとの比較のためにここに示されている実質の分離値を得るために、先端サンプル間隔はまた片持梁の偏向を修正されなければなりません。 より大きく否定的な力は分子の表面およびそれ故により高い extensional 力の方の多く逸れる先端に対応します。

図 3。

拡張 FJC モデルからのカーブはまた 6 nm の Kuhn の長さおよび 1.25 ミクロンの輪郭の長さを使用して計算される比較のための図 3 で示されています。 簡単な FJC または WLC モデルのための適合は小さい extensional 力のために適度 (50pN のまわりでの下でこの場合) でしたが、カーブはより高い力でそれました。 より高い extensional 力で伸びるバックボーンを確かめるのにそれ故に追加セグメント伸縮性の拡張 FJC モデルが、使用されました。

Xanthan の場合には、先端と表面間の単一の長いリンクは伸びます。 分子がとても長いので、それを伸ばす力は伸張のカーブの多くのために非常に小さく、動作は伸ばされた長さが輪郭の長さの近くにどこにあるか伸ばす高力によって支配されます。 もっと複合体によって折られる分子のために、一連の蛋白質のようなこれらの伸張のイベントは一般に構造の異なった部分が拡張開き、であると同時に見られます。

Bacteriorhodopsin - 抽出および展開

Bacteriorhodopsin は軽い光子からのセルのためのエネルギーを生成する細菌のセルからの必要な膜蛋白質です。 その間のより多くの組織を破壊されたペプチッドループが付いている 7 つの transmembrane のアルファ螺旋形が、あります。

蛋白質の 1 つの端がおよび引っ張られてつかまれるとき、アルファ螺旋形は膜から引き出され、引き出されると同時に開きます。

紫色の膜は bacteriorhodopsin のための自然なソースで、 25% の脂質および 75% の bacteriorhodopsin から成っています。 蛋白質は AFM を使用して視覚化されます 2 次元結晶構造の三量体として図 4 に示すように配列されます (D.J. Mullerr、 TechnicalUniversityDresdenGermany のサンプル礼儀

図 4。

展開プロセスの図式的な図表は図 5. で示されています。 7 つのアルファ螺旋形は 1 つの端 (ノート、ない実際の蛋白質で、アルファ螺旋形が束で一緒にグループ化されるライン) を取っていて AFM の先端がパート A で、示されています。 多くの可能な展開のパスがありますが、可能性が高いイベントは alphahelices がペアで引き出されることです。 3 つの部分的に開かれた州の進行は開くアルファ螺旋形のペアの図 5 のパート B でそれらが膜から得られると同時に、示されています。

図 5。

図 6 は訂正された先端サンプル分離に対して計画されて力が 10 の bacteriorhodopsin の展開のカーブの重ね合わせを、示します。 先端が表面を去るので図 5 B. で示されている 3 つの州に相当して 3 主要な伸張に開くイベント、先行している付着があり。 主要なピークは文献で出版される値とよく一致する 20-30nm、 40-50nm および 60-80nm のまわりにあります。 片持梁は熱騒音方法およびバッファ (10mM TRIS の 150mM の KCl、 pH 7.6) の下で遂行された実験を使用して目盛りが付いていました。

とらわれの故障事象の厳密な位置はカーブから室温で熱エネルギーの近くのエネルギーの結束のために典型的であるカーブに変わります。 カーブの伸張の部分は同じ構造が各ケースで伸ばされていることを示す図 6 で上にありました。 伸ばされた結束の遮断がカーブからカーブに変わる実際の時だけ。 熱エネルギーの近くのエネルギーの結束のために、応用力無しである特定の時間以内に、失敗するそれの確率があります。 これは解決で結合の反作用については自由に見られる正常な 「以外レートに」対応します。 普通安定しているエネルギーの結束のために熱エネルギーの上の少しは、自発的に失敗するそれらの確率力が応用であると同時に増加します。

図 6。

従って伸張のイベントについて考える 1 つの方法は開くことへのエネルギー障壁が熱範囲の内にあるまで結束が緊張していることです。 結束が突然失敗するとき実際の時は展開のエネルギー障壁上の分子を取る任意熱変動によって決まります。 時間の依存は測定された開くレートがローディングレートによって決まる、または先端が分子の自由な端を引っ張っている速度ことを意味します。

図 7。

多数は bacteriorhodopsin の展開のカーブ展開のイベントの統計的な概観を与えるために集めることができます。 複数の方法で開く特定のサブセットを選択するために選択は力のカーブでなされなければなりません。 この場合、図 6 で例のような 3 つの主要な伸張のイベントを、示すカーブだけ選ばれました。 図 7 では 3 つのピーク (データのための n = 355 のカーブ) のための先端サンプル分離の分布を示すヒストグラムは示されます。 力のカーブの分析は PUNIAS のソフトウェアを使用して部分的に遂行されました。

図 8。

図 8 は図 7. でと展開力の分散プロットを対同じデータセットのためのイベントの位置示します。 最初の展開のイベントのための力 (ピーク 1) はそれに続くイベント (ピーク 2 および 3) よりかなり高いです。 蛋白質の構造が破壊されたら、そして膜から残りのアルファ螺旋形を引き抜くために必要な力は減ります。 展開のカーブはまた膜の開き、引き出すために分子のための異なったパスを示します。 蛋白質の構造およびアミノ酸のチェーン長さの知識からどの展開の経路が特定力のカーブで取られるかはっきり示すために、 extensional カーブは合うことができます。

Titin の展開

Titin は複数の繰り返された球状領域から成っている筋肉ティッシュからの蛋白質です。 筋肉ティッシュの中ではそれはマクロスコピックスケールの機械特性に責任があります。 AFM は個々の titin の分子の nanomechanical 特性の調査を可能にします。 分子が伸びるので、いつか特定の領域を保持する結束は一緒に失敗します。 この特定の球状領域はそれから開きま、分子のためのより長い輪郭の長さに導きます。 更に引きによって、線形アミノ酸のこのセクションはまた伸び、他の領域の 1 つは障害ポイントに達します。 これは図 9. で図式的に説明されます。

図 9。

蛋白質が引っ張られると同時に、領域は次々に開きま 「ぽんと鳴りま」、曲がります偏向のピークの独特シーケンスに導きます。 力のプロットの各々の連続的な曲げられた部分の形は領域が開かれると同時に分子の増加された有効な長さを反映します。

典型的な titin の拡張力の分光学は図 10 でカーブを示されています引き込めます (マティアス Amrein の単一 Ig8 titin 筋肉蛋白質の NanoWizard® AFM を使用して得られるカルガリー、カナダの大学のデータ礼儀)。 展開のイベントの独特の titin シーケンスははっきり見ることができます。 分子の着実に力の増加は、張力として増加します。 突然力は Ig の領域がぽんといって開き、張力が解放されると同時にはっきりと減ります。 各々の延長領域のカーブは対応する自由なアミノ酸の長さのための FJC または WLC モデルと合うことができます。 単一の領域のための展開力のサイズは 190-250pN の範囲にあり、 1 つの領域 (ピーク・ツー・ピーク間隔) の輪郭の長さは 28nm です。

図 10. )。

アプリケーション

いろいろ蛋白質は AFM を使用して伸び、開くことができます。 2 つの例は、 1 つの膜蛋白質および 1 の細胞質蛋白質ここに示されていました。 この方法は正常な蛋白質の構造および故障モード両方についての利得情報への他の蛋白質に、拡張することができます。 bacteriorhodopsin の場合には、蛋白質は非常に細菌の細胞壁の非常に詰められた構造を、形作り従って高解像の構造決定のために結晶させることができる少数の膜蛋白質の 1 つです。

しかしこの方法はもっと一般に応用である場合もあります。 ほとんどの膜蛋白質のために、アミノ酸シーケンスはほとんどの膜蛋白質が結晶化のために適していないので、はるかに定まり折られた構造より易いです。

膜蛋白質の三次構造を解読するのに AFM と測定される異なった構造単位が開くと同時にアミノ酸の長さの変更を示す展開のイベントが知られていたシーケンスと、使用することができます。 原因となる構造単位が 3D 構造でどのようにについての一緒に接続されるかプローブの特定のコーティング、および特定の 「積み込み」ポイントを異なった位置およびそれ故により詳しい情報で蛋白質の引きの持つ蛋白質の修正は場合があります。

従って AFM は洞察力を単一の分子の構成に与え、分子特性の独立した測定が分子模倣の技術を精製する。 AFM はまた TIRF または焦燥のような単一の分子の蛍光性の技術と結合することができます。

ソース: JPK の器械

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Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:00

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