JPK 계기에서 원자 군대 현미경 기술을 사용하는 단 하나 유생분자 그리고 분자 기지개의 구조상 수사

커버되는 토픽

배경

분자 기지개 실험

해결책에 있는 고분자의 특성

Entropic 신축성

Xanthan - 간단한 분자 기지개

Bacteriorhodopsin - 적출과 전개

Titin 전개

응용

배경

NMR 분광학 및 엑스레이 결정학은 지금 해결책의 원자 수준에 단백질과 핵산 같이 생물학 고분자의 구조물 결정 가능한 일반적인 기술입니다. 원자 군대 현미경은 (AFM) 그것의 화상 진찰 기능으로 주로 알려져 있습니다, 그러나 또한 양이 많게 단 하나 분자 수준에 군대 측정을 위한 아주 과민한 공구입니다.

이 기능은 고유한 조건 하에서 고분자의 구조상 윤곽의 수사를 위한 양자택일 기술로 AFM의 사용을 허용합니다. 단 하나 분자 사이사이 군대를 측정하는 것은 분자 에너지 조경 및 화학 반응 활동의 이해에 다른 접근을 제공합니다. AFM는 수 있습니다 인구에 통계적인 평균으로 제한 보다는 오히려, 형성하고 끊는 개별적인 유대를 측정할.

이 보고는 분자 구조 구조에 관하여 정보를 추출하기 위하여 단 하나 분자를 조작하는 AFM의 사용, 및 분자내 구속력에 집중합니다. 고분자 분자 승인 또는 단백질 폴딩에 있는 분자내 역동성과 같은 시간에 의존하는 현상을 제자리의 공부하는 것도 가능합니다.

분자 기지개 실험

군대 분광학은 편향도 또는 그밖 공가 속성은 측정되는 그러나, 끝이 표면에 단일 지점의 위 여기저기 AFM 최빈값입니다. 이것은 표면의 위 다른 고도에 군대의 단면도를 줍니다.

분자 기지개 실험에서는, 끝은 일반적으로 표면과의 접촉으로 주어집니다, 기질에 분자는 끝과 상호 작용하는 것이 허용되고, 그 때 외팔보는 끌어 넣어집니다. 이 운동은 - 견본으로 (접근) - 숫자 1에 있는 심상 시리즈에서 그 후에 다시 멀리 개요로 보이고 (끌어 넣). 외팔보가 표면에서 멀리 때, 편향도는 끝과 표면 사이 군대를 반영합니다. 단 하나 분자가 끝과 표면 사이에서 붙들리는 경우에, 외팔보의 편향도는 분자에 발휘된 군대의 측정을 줍니다.

숫자 1에 있는 개요 도표에서는, 단 하나 분자는 끝과 기질 사이에서 기지개를 보입니다. 단백질, 예를 들면, 또는 그것에 관해서는 다른 많은 긴 중합체와 같은 난잡한 사슬이 이, 분자에는 정의한 3차원 접힌 구조물이 있을 수 있습니다. 끝과 분자 사이 접착성 상호 작용은 일반적으로 군대 곡선의 불쾌한 접촉 부속에서 일어납니다, 그러나 분자 기지개를 위한 관심사의 특징은 끌어 넣 곡선에서 있습니다.

숫자 1.

긴사슬 분자는 DNA 덱스트런과 같은 끝과 견본 사이에서 기지개할 수 있습니다. 뻣뻣함과 지속성 길이는 분자의 처음 기지개에서 보일 수 있습니다. 내부 분자 전환은 또한 DNA에 있는 녹는 전환과 같이 백본이 고전압의 밑에 재정비하는 때 공부될 수 있습니다. 복잡한 3 차원 구조물을 가진 분자는 많은 단백질과 같은 통제되는 방법으로 구조상 부대가 조사될 수 있다 그래야 펼쳐질 수 있습니다. Titin와 bacteriorhodopsin는 집중적으로 공부된 단백질의 보기입니다. 막 단백질은 막으로 부터 떠나게될 수 있고, 개별적인 알파 나선에서 "터지는 것은" 보였습니다.

해결책에 있는 고분자의 특성

해결책에 있는 긴 분자에는 드물게 줄처럼 생기거나 뻣뻣하 없고, 수시로 분자의 백본에 따라서 높은 융통성이 있습니다. 일반적으로 두 배 나선 구조물 때문에 "뻣뻣한" 분자와로 생각되는, 좌초된 DNA를 배열됩니다 몇백개 나노미터 저쪽에 길이를 위한 무작위 엉킴으로 두배로 하십시오 조차. 이것은 사슬에 따라서 측정된 분자의 길이 사이 큰 다름이 또는 백본 (윤곽선 길이) 및 매우 더 작은, 해결책 (예를들면 회전 반지름 또는 철저한 길이)에서 점유하는 전형적인 차원 있다는 것을 의미합니다.

숫자 2.

배열은 숫자 2.에서 개요로 나타납니다. 부분적 A로, 긴 분자는 확장되는 구조에서 보입니다. 부분적 B로, 다른 구조는 분자가 윤곽선 길이 보다는 매우 더 작은 옆 차원을 점유하는 편한 무작위 엉킴에 있는 곳에 보입니다. 분자에 유효한 B에서 보인 것과 유사한 A에서 보인 것과 유사한 구조 보다는 더욱 많은 구조가 있고, 이것은 다른 구조의 엔트로피 자유 에너지에 있는 다름으로 이끌어 냅니다.

유효한 관련 구조의 수가 감소되기 때문에, 구조 B에서 A에 분자를 밖으로 곧게 펴는 자유 에너지에 있는 비용이 있습니다. 이 자유 에너지 다름은 곧게 펴기 저항하는 군대로 변환하고, entropic "봄 같이" 작동합니다. 이것은 유연한 끈을 당기는 것이 중요한 군대를 요구하지 않는 거시적인 가늠자에 상황과 대비하여 똑바를 실제적인 백본이 기지개할 때까지 입니다.

긴 분자가 당겨질 때, 군대는 비록 백본에 있는 유대가 기지개되지 않더라도 똑바른 구조로 분자를 연장할 것을 요구됩니다.

Entropic 신축성

2개의 기본적인 모형은 이 entropic 신축성을 위해 통용되어, 약간 사슬 강성도가 포함된다는 것을 의존하. 자유롭게 합동된 사슬 모형 (FJC)에서는, 백본은 완전하게 "자유로운" 합동에 의해 연결된 작은 부대로 인접한 부대에는 여분 동력비 없이 그(것)들 사이 어떤 각든지 있을 수 있다 그래야, 만들어집니다. 지렁이 같은 사슬 (WLC) 모형은, 대조적으로, 설치된 사슬 강성도를 가진 지속적인 필라멘트이고, 두 배 좌초된 DNA와 같은 분자를 위한 더 나은 모형입니다. 처음 오리엔테이션이 무작위화되는 사슬의 길이를 나타내는 지속성 길이는 정의됩니다.

군대 연장 곡선이 집합되는 경우에, 이 모형의 한, 그리고 WLC 모형을 위한 지속성 길이에 의해 기지개하는 분자의 길이를 장악하기 위하여 적합하 할 수 있습니다.

몇몇 전문화한 분자에는 단백질과 같은 해결책에 있는 일반적으로 정의한 (접힌) 3차원 구조물이 있습니다. 이 구조물은 효소 또는 구조상 부대로 그들의 생물학 기능에 키, 예를 들면입니다. 폴리펩티드 사슬은 편한 느슨한 코일이 아니고, 그러나 매우 더 뻣뻣한 구조물로 접히고 많은 유대에 의해 결합됩니다. 단백질이, 군대에 의해, 화학제품 펼쳐지거나 열이 변경하는 경우에, 자유로운 폴리펩티드 사슬은 간단한 선형 분자 같이 작동합니다. entropic 기지개는 폴리펩티드 백본에 따라서 유대가 높게 유연하기 때문에, 보일 수 있습니다. 단백질 구조물의 정의한 부분은 알파 나선 공 모양 도메인과 같은 연속적으로 펼쳐질 수 있고, 기지개 곡선에 근거를 둔 각 전개 사건으로 분자의 측정한 "자유로운" 길이는 증가할 것입니다. 단백질 전개 단계는 정상에 의하여 접힌 구조물 및 그것의 장애 메커니즘에 관하여 정보를 제공합니다.

Xanthan - 간단한 분자 기지개

Xanthan는 셀루로스와 동일한 분자 백본과 더불어 세균성 다당류, 입니다. 옆 단의 화학 속성은 중합체에게 음식 안정화에서 기름 복구에 많은 산업 응용을, 줍니다.

Xanthan 분자가 끝과 표면 사이에서 기지개할 때, 짧은 옆 단은 탄력 있는 속성에 대한 중요한 효력이 없, 행동은 단 하나 (carboxymethylated) 셀루로스 사슬과 유사합니다. 고분자 중량 xanthan 중합체에는 몇몇 미크론의 길이가 있고을, 기지개 곡선은 간단한 분자 연장의 하나의 예 이용될 수 있습니다. 낮은 군대를 위해, 사슬은 entropic 봄에 대하여 기지개합니다. 철저한 길이가 윤곽선 길이에 접근하는 때 어느 시점에서, 백본 신축성의 신축성은 중요하게 됩니다.

숫자 3은 NanoWizard® AFM를 사용하여 (인산염 버퍼 해결책에서) 기지개하는 단 하나 Xanthan 분자의 끌어 넣 곡선을 보여줍니다. 공가 편향도는 열 소음 방법을 사용하여 측정되었습니다.

모형을 가진 비교를 위해, 끝 견본 거리는 또한 외팔보의 편향도를 여기에서 보이는 실제적인 별거 가치를 장악하기 위하여 교정되어야 합니다. 더 큰 부정적인 군대는 분자에 표면으로 및 그러므로 더 높은 신장 군대로 더 많은 것이라고 빗나가게 되는 끝에 대응합니다.

숫자 3.

확장되는 FJC 모형에서 곡선은 또한 6 nm의 Kuhn 길이 및 1.25 미크론의 윤곽선 길이를 사용하여 산출된 비교를 위한 숫자 3에서 보입니다. 간단한 FJC 또는 WLC 모형을 위한 적합은 작은 신장 군대를 위해 적당했습니다 (50pN의 주위에의 밑에 이 경우에는), 그러나 곡선은 더 높은 군대에 분기했습니다. 그러므로 추가 세그먼트 신축성을 가진 확장되는 FJC 모형은, 더 높은 신장 군대에 기지개하는 백본을 주의하기 위하여 이용되었습니다.

Xanthan의 경우에, 끝과 표면 사이 단 하나 긴 링크는 기지개합니다. 분자가 아주 길기 때문에, 그것을 연장하는 군대는 기지개 곡선의 다량을 위해 아주 작, 행동은 기지개한 길이가 윤곽선 길이의 가까이에 어디 있는지 기지개하는 높 군대에 의해 지배됩니다. 좀더 복합물에 의하여 접힌 분자를 위해 일련의 단백질과 같은 이 기지개 사건은 일반적으로 구조물의 다른 부분이 확장되는 펼치고는 때 보입니다.

Bacteriorhodopsin - 적출과 전개

Bacteriorhodopsin는 가벼운 광양자에서 세포를 위한 에너지를 생성하는 세균성 세포에서 완전한 막 단백질입니다. 그(것)들 사이 추가 조직을 파괴한 펩티드 루프와 더불어 7개의 막 횡단 알파 나선이, 있습니다.

단백질의 1개의 끝이 당겨 장악될 때, 알파 나선은 막으로 부터 떠나게되고, 떠나게되는 때 펼칩니다.

자주색 막은 bacteriorhodopsin를 위한 자연적인 근원이고, 25% 지질과 75% bacteriorhodopsin를 이루어져 있습니다. 단백질은 AFM를 사용하여 imaged 일 수 있는 2 차원 결정 구조에 있는 삼량체로 숫자 4에서 보이는 것처럼 배열됩니다 (D.J. Mullerr, TechnicalUniversityDresdenGermany의 견본 의례

숫자 4.

전개 프로세스의 개요 도표는 숫자 5.에서 보입니다. 7개의 알파 나선은 AFM 끝이 부 A에서, 1개의 끝 (주, 실제적인 단백질에서, 알파 나선이 뭉치에서 함께 분류되는 선 아닙니다)를 픽업하는 상태에서 보입니다. 많은 가능한 전개 통로가 있습니다, 그러나 확률이 매우 높은 사건은 alphahelices가 쌍에서 떠나게되다 입니다. 3개 부분적으로 펼쳐진 국가의 진행성은 펼치는 알파 나선의 쌍과 더불어 숫자 5의 부 B에서 그(것)들이 막에서 추출되는 때, 보입니다.

숫자 5.

숫자 6은 군대가 10의 bacteriorhodopsin 전개 곡선의 중첩을, 정정한 끝 견본 별거에 대하여 음모를 꾸민 상태에서 보여줍니다. 끝이 표면을 떠나기 때문에 숫자 5 B.에서 보인 3개의 국가에 일치하는 3 주요 기지개에 펼치 사건, 선행된 약간 접착이 있고. 주요 첨단은 문서에서 간행된 가치와 잘 일치하는 20-30nm, 40-50nm 및 60-80nm의 주위에 입니다. 외팔보는 열 소음 방법 및 버퍼 (10mM TRIS 의 150mM KCl, PH 7.6)의 밑에 실행된 실험을 사용하여 측정되었습니다.

노예 실패 사건의 정확한 위치는 곡선에서 실내 온도에 열 에너지에 에너지 가깝을 가진 유대를 위해 전형적인 곡선에 변화합니다. 곡선의 기지개 부분은 동일 구조물이 각 케이스에서 기지개되고 있다는 것을 보여주는 숫자 6에서 투영했습니다. 기지개한 유대 틈이 곡선에서만 곡선에 변화하는 실제적인 순간. 열 에너지의 가까이에 에너지를 가진 유대를 위해, 적용되는 군대 없이 조차 어느 정도 시간 이내에, 실패하는 그것의 어떤 확율이 있습니다. 이것은 해결책에서 의무적인 반응을 위해 자유롭게 보인 일반적인 "떨어져 비율에" 대응합니다. 일반적으로 안정되어 있는 에너지를 가진 유대를 위해 열 에너지의 위 약간은, 자발적으로 실패하는 그(것)들의 확율 군대가 적용되는 때 증가합니다.

숫자 6.

기지개 사건을, 그러므로 생각하는, 1개의 쪽은 펼칠에 에너지 장벽이 열 범위 안에 있을 때까지 유대가 지치다 입니다. 유대가 갑자기 실패할 때 실제적인 순간은 전개 에너지 장벽에 분자를 취하는 무작위 열 동요에 달려 있습니다. 시간 미결은 측정한 펼치 비율이 선적 비율에 달려 있을 것이라는 점을, 또는 끝이 분자의 자유로운 끝을 당기고 있는 속도 의미합니다.

숫자 7.

많은 것은 bacteriorhodopsin의 전개 곡선 전개 사건의 통계적인 전망을 주기 위하여 집합될 수 있습니다. 분자는 몇몇 방법으로 펼칠지도 모르지만, 어떤 선택은 군대 곡선에서 특정한 부분 집합을 선택하기 위하여 해야 합니다. 이런 경우에, 숫자 6에 있는 보기와 같은 3개 주요 기지개 사건을 보여주는 곡선만 선정되었습니다. 숫자 7에서는 3개의 첨단 (데이터 를 위한 n = 355의 곡선)를 위한 끝 견본 별거 배급을 보여주는 막대 그래프는 제출됩니다. 군대 곡선 분석은 PUNIAS 소프트웨어를 사용하여 부분적으로 실행되었습니다.

숫자 8.

숫자 8은 숫자 7.에서와 전개 군대의 살포 작의를 대 동일 자료 집합을 위한 사건의 위치 보여줍니다. 첫번째 전개 사건을 위한 군대 (첨단 1)는 연속적인 사건 (첨단 2와 3) 현저하게 더 높습니다. 일단 단백질 구조물이 중단되면, 그 후에 막에서 잔여 알파 나선을 끌어낼 것을 요구된 군대는 감소됩니다. 전개 곡선은 또한 막의 펼치고 떠나기 위하여 분자를 위한 다른 통로를 보여줍니다. 단백질 구조물과 아미노산 사슬 길이의 지식에서, 신장 곡선은 어느 전개 경로가 특정한 군대 곡선에서 따라가지는지 명확하게 보여주기 위하여 적합하 할 수 있습니다.

Titin 전개

Titin는 몇몇 반복한 공 모양 도메인으로 이루어져 있는 근육 조직에서 단백질입니다. 근육 조직 안에 그것은 거시적인 가늠자에 기계적 성질에 책임 있습니다. AFM는 개별적인 titin 분자의 nanomechanical 속성의 연구 결과를 허용합니다. 분자가 기지개하기 때문에, 어떤 점에서 특정한 도메인을 보전되는 유대는 함께 실패할 것입니다. 이 특정한 공 모양 도메인은 그 때 펼쳐, 분자를 위한 더 긴 윤곽선 길이에 지도하. 더 당기기, 선형 아미노산의 이 단면도는 또한 기지개하고, 그밖 도메인의 한개는 그것의 실패 점을 도달할 것입니다. 이것은 숫자 9.에서 개요로 설명됩니다.

숫자 9.

단백질이 당겨지는 때, 도메인이 연속적으로 열려 "터져", 구부립니다 편향도에 있는 첨단의 독특한 순서에 지도하. 군대 작의의 각 계속되는 구부려진 부분의 모양은 도메인이 펼쳐지는 때 분자의 증가시킨 유효 길이를 반영합니다.

전형적인 titin 연장 군대 분광학은 숫자 10에서 곡선을 보입니다 끌어 넣습니다 (Matthias Amrein 의 단 하나 Ig8 titin 근육 단백질에 NanoWizard® AFM를 사용하는 장악되는 Calgary, 캐나다의 대학의 데이터 의례). 전개 사건의 독특한 titin 순서는 명확하게 보일 수 있습니다. 분자에 있는 꾸준히 군대 증가는, 긴장 만큼 증가합니다. 갑자기 군대는 Ig 도메인이 탁하고 열리고는 긴장이 풀어 놓이는 때 예리하게 줄입니다. 각 연장 지구의 곡선은 대응 자유로운 아미노산 길이를 위한 FJC 또는 WLC 모형과 맞을 수 있습니다. 단 하나 도메인을 위한 전개 군대의 규모는 190-250pN의 범위 안에 이고, 1개의 도메인 (첨단 에 첨단 거리)의 윤곽선 길이는 28nm입니다.

숫자 10.).

응용

다양한 단백질은 AFM를 사용하여 기지개하고 펼쳐질 수 있습니다. 2개의 보기는, 1개의 막 단백질 및 1 세포질 단백질 여기에서 보였습니다. 이 방법은 일반적인 단백질 구조물 및 그것의 고장 형태 둘 다에 관하여 이익 정보에 그밖 단백질까지, 미칠 수 있습니다. bacteriorhodopsin의 경우에, 단백질은 아주 세균성 세포벽에 있는 높게 포장한 구조물을, 형성하고 그래서 고해상도 구조상 결심을 위해 결정될 수 있는 몇몇 막 단백질의 한개입니다.

이 방법은, 그러나 일반적으로 적용될 수 있습니다. 대부분의 막 단백질을 위해, 아미노산 서열은 대부분의 막 단백질이 결정화를 위해 적당하지 않기 때문에, 결정하기 접힌 구조물 보다는 매우 쉽습니다.

AFM로 측정된 다른 구조상 부대가 펼치는 때 아미노산 길이 변경을 보여주는 전개 사건은 알려진 순서에, 막 단백질의 삼차 구조를 해석하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이끌어 낼 구조상 부대가 3번째 구조물에서 어떻게에 관하여 함께 연결되는지 탐사기의 특정 코팅, 및 특정 "픽업" 점이 다른 위치 및 그러므로 추가 정보에 단백질을 당기기로 있는 단백질의 수정은 수 있습니다.

따라서 AFM는 단 하나 분자의 윤곽으로 통찰하고 분자 속성의 독립적인 측정이 분자 만드는 기술을 세련하는 것을 허용할 수 있습니다. AFM는 또한 TIRF 번민과 같은 단 하나 분자 형광 기술과 결합될 수 있습니다.

근원: JPK 계기

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Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:04

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