NMR 분광법 및 X - 선 crystallography 현재 해상도의 원자 수준의 단백질과 핵산 같은 생물 학적 macromolecules의 구조를 결정하는 수있는 가장 일반적인 기법입니다. 원자 힘 현미경 (AFM)은 대부분의 이미징 기능 알려져 있지만, 그것은 또한 양적 단일 분자 수준에서 세력을 측정하는 매우 민감한 도구입니다. 이 기능은 기본 조건 macromolecules의 구조적 구성의 조사 대안 기술로 AFM을 사용할 수 있습니다. 단일 분자 사이와 사이에 세력을 측정하는 것은 분자 에너지 자연 경관과 화학 반응 속도론의 이해에 다른 접근 방식을 제공합니다. AFM은 오히려 인구 통계 평균 이상으로 제한하는 것보다 형성과 파괴 개별 채권을 측정할 수 있습니다. 본 보고서는 분자 구조 또는 형태 및 분자내 구속력 세력에 대한 정보를 추출하는 단일 분자를 조작하기 위해 AFM의 사용에 중점을두고 있습니다. 그것은 이러한 macromolecules의 분자내 역학, 현장에서 분자 인식이나 단백질 폴딩과 같은 시간 종속 현상을 연구하는 것도 가능합니다. 분자 스트레칭 실험 편향이나 다른 캔틸레버 속성을 측정하는 동안 강제로 분광법은 팁이 표면에 단일 지점에서 위 아래로 이동하고있는 AFM 모드입니다. 이것은 표면 위에 다른 높이에있는 세력의 프로파일을 제공합니다. 분자 스트레칭 실험에서는, 팁은 대개 표면과 접촉으로 데려이며, 기판에 분자는 팁과 상호 작용할 수 있으며, 다음 캔틸레버가 철회됩니다. 이 움직임은 그림 1에 이미지 시리즈 간략하게 구조 표시됩니다 - 샘플을 향해 (접근)하고 다시 거리 (철회). 캔틸레버가 떨어진 표면에서 이동으로 편향 팁과 표면 사이의 세력을 반영합니다. 하나의 분자가 팁과 표면 사이에 개최되는 경우에는 캔틸레버의 편향은 분자에 끼쳤다 포스의 측정을 제공합니다. 그림 1의 개략도 그림에서, 하나의 분자가 팁과 기판 사이에 뻗어되고 표시됩니다. 분자 예를 들어, 단백질의 경우, 정의된 입체 접힌 구조를 가지고 있거나 그것은 다른 많은 긴 폴리머와 같은 무질서 체인 수 있습니다. 팁 및 분자 간의 상호 작용 접착제는 일반적으로 강제 곡선의 반발 접촉 부분에서 일어나는지만, 스트레칭 분자에 대한 관심의 기능은 접어야 곡선에서 발견됩니다.  그림 1. AFM 팁는 단일 분자를 스트레칭하는 데 사용되는 강제 분광 실험 도식 다이어그램 이러한 DNA 또는 dextran과 같은 긴 사슬 분자는, 팁 및 샘플 사이에 뻗어 수 있습니다. 강성 및 지속성의 길이는 초기 분자의 스트레칭에서 볼 수 있습니다. 내부 분자 전이는 또한 백본 높은 장력에 따라 다시 배열로 DNA에 용해 전이로 공부하실 수 있습니다. 구조 단위 조사 수 있도록 같은 많은 단백질과 같은 복잡한 3 차원 구조와 분자는 제어 방식으로 펼쳐진 수 있습니다. Titin 및 bacteriorhodopsin가 집중적으로 연구했습니다 단백질의 예입니다. 막 단백질은 세포막 밖으로 뽑아 될 수 있으며, 각각의 알파 나선의 "터지는"밖으로 볼되었습니다. 솔루션에 Macromolecules의 특징 솔루션에서 긴 분자는 거의 막대 같은거나 뻣뻣한 없습니다, 그리고 종종 분자의 등뼈를 따라 높은 유연성을했습니다. 보통 때문에 이중 나선 구조의 "성실히"분자로 생각에도 두 번 좌초 DNA가, 몇 백 나노미터 이상의 길이에 대한 임의의 다시마로 정렬됩니다. 이것은 체인이나 백본 (등고선의 길이)와 그것이 (나선의 반경 또는 엔드 - 투 - 엔드 길이 등) 솔루션 차지하고 전형적인 차원을 따라 측정된 분자의 길이 사이 큰 차이가있다는 것을 의미하는 훨씬 작은 수 있습니다.  그림 2. 긴 분자의 두 가지 conformations의 도식 다이어그램. 에서는 분자가 용액에 분자에 대한 가능성이 형태에서 뻗어있다. B는 분자가 무질서하게 얽히고에 좀 더 일반적인 형태를 보여줍니다. 배열은 그림 2에 간략하게 구조 도로 표현됩니다. 부분은 긴 분자가 확장된 형태로 표시됩니다. 분자의 윤곽 길이보다 훨씬 작은 가로 크기를 차지하고 편안한 임의의 얽히고에 어디 부분 B에서 다른 형태가 표시됩니다. 거기에 표시된 것과 유사한 conformations보다 분자 사용할 수 B에 표시된 것과 유사한 더 많은 conformations 있으며, 이것은 다른 conformations의 엔트로피 또는 자유 에너지의 차이에 이르게한다. 가능한 관련 conformations의 개수가 감소되기 때문에, 형태 B에서하는 분자를 할것 자유 에너지의 비용이있다. 이 자유 에너지 차이가 교정을 저항하고, entropic "봄"과 같은 역할을 강제로 변환합니다. 이것은 직선이고 실제 백본이 늘어 때까지 유연한 문자열을 끄는 것은 상당한 힘을 필요로하지 않는 매크로 규모의 상황과는 대조적이다. 긴 분자가 가져온 경우, 강제가 백본에 채권이 늘어되지 않는 경우에도 직선 형태 향해 분자를 확장해야합니다. Entropic 탄성 두 가지 기본적인 모델은 일반적으로 몇 가지 사슬 강성이 포함되어 있는지에 따라,이 entropic 탄성을 위해 사용됩니다. 자유롭게 jointed 체인 (FJC) 모델에서 중추가 인접 장치가 추가 에너지 비용없이 그들 사이의 각도를 가질 수 있도록 완전 "무료"관절로 연결된 작은 단위로 모델입니다. 벌레 같은 체인 (WLC) 모델 반면, 내장 체인 강성과 함께 지속적인 필라멘트이며, 이러한 이중 좌초된 DNA와 같은 분자에 대한 좋은 모델입니다. 지속성의 길이는 초기 방향이 무작위로하는 이상의 체인의 길이를 나타내고있는, 정의됩니다. 강제로 확장 곡선가 수집되면, 그때 그것은 늘어되고있는 분자의 길이를 얻기 위해 이러한 모델 중 하나 WLC 모델에 대한 지속성의 길이에 의해 장착되어 수 있습니다. 같은 단백질과 같은 일부 전문 분자는 일반적으로 솔루션 (접힌) 입체 구조를 정의했습니다. 이 구조는 예를 들어, 효소 또는 구조적 단위로 자신의 생물 학적 기능의 핵심입니다. polypeptide 사슬은 편안한 느슨한 코일 아니지만, 훨씬 stiffer 구조로 접으면 많은 채권으로 함께 개최됩니다. 단백질이 펼쳐있다면, 힘, 화학 또는 열 변경하여, 다음 무료 polypeptide 사슬은 단순한 선형 분자처럼 동작합니다. polypeptide 등뼈를 따라 채권이 매우 유연으로 스트레칭 entropic는 볼 수 있습니다. 이러한 알파 나선 또는 구형 도메인으로 단백질 구조의 정의된 부분이 순서대로 펼쳐 될 수 있으며, 스트레칭 곡선에 따라 분자의 측정 "무료"길이는 각각의 전개 이벤트 증가할 것이다. 단계를 펼쳐 단백질은 정상적인 접힌 구조 및 고장 메커니즘에 대한 정보를 제공합니다. Xanthan - 간단한 분자는 스트레칭 Xanthan는 셀룰로오스와 동일 분자 등뼈와 세균성 다당류이다. 측면 그룹의 화학 성질은 식품 안정화에서 오일 회복, 고분자 많은 산업 애플 리케이션을 제공합니다. Xanthan 분자는 팁과 표면 사이에 뻗어 때, 짧은 사이드 그룹은 탄성 특성에 큰 영향을 갖고 있지 않다면, 동작은 단일 (carboxymethylated) 셀룰로오스 사슬과 유사합니다. 높은 분자량의 xanthan의 고분자는 여러 마이크론의 길이를 가질 수 있으며 스트레칭 곡선은 간단한 분자 확장을위한 예제로 사용할 수 있습니다. 낮은 세력 들어, 체인은 entropic 봄에 대한 뻗어있다. 엔드 - 투 - 엔드의 길이는 등고선의 길이를 접근으로 어떤 시점에서, 백본 탄성의 탄력이 중요하게됩니다. 그림 3은 사용 뻗어되고 단일 Xanthan 분자 (인산염 버퍼 솔루션)의 수축 곡선 보여줍니다 NanoWizard ® AFM합니다. 캔틸레버 편향은 열 노이즈 보정 방법을 사용했습니다. 모델과 비교 들어, 팁 - 샘플 거리도 여기에 표시됩니다 실제 분리 값을 얻기 위해 캔틸레버의 편향에 대한 수정해야합니다. 더 큰 부정적인 힘은 표면쪽으로 더 편향되는 팁, 그리고 따라서 분자에 대한 높은 extensional 강제에 해당합니다.  그림 3. 강제 분광법은 늘어되는 단일 Xanthan 분자의 커브를 철회. 확장 FJC 모델 커브는 비교 표시됩니다. 확장 FJC 모델에서 곡선도 6 NM의 Kuhn 길이와 1.25 미크론의 윤곽 길이를 사용하여 계산, 비교 그림 3에 표시됩니다. 간단한 FJC 또는 WLC 모델에 적합 (아래이 경우에는 50pN 정도) 작은 extensional 세력에 대한 합리적인되었지만, 곡선은 더 높은 세력에 갈라. 따라서 추가 세그먼트 탄성과 함께 확장 FJC 모델은 높은 extensional 세력에 이르는 중추의 계정을 데리고, 사용되었습니다. Xanthan의 경우, 팁 및 표면 사이에 하나의 긴 링크가 뻗어있다. 분자 이렇게 오래이기 때문에, 포스가 훨씬 스트레칭 곡선의 매우 작은 연장하고, 동작이 뻗어 길이가 등고선의 길이 근처 어디에 더 높은 힘은 스트레칭에 의해 지배됩니다. 같은 단백질과 같은 더 복잡한 분자 접힌에 대해, 이러한 스트레칭 이벤트 시리즈는 일반적으로 구조의 다른 부분으로 펼쳐 볼 수 있으며, 확장하고 있습니다. Bacteriorhodopsin - 추출 및 펼쳐 Bacteriorhodopsin 빛의 광자의 세포에 에너지를 생성 세균 세포에서 필수적인 멤브레인 단백질이다. 7 transmembrane의 알파 나선 그들 사이에 더 무질서 펩타이드 루프와 함께있다. 단백질의 한쪽 끝을을 파악하고 가져온 경우, 다음 알파 나선은 막 밖으로 뽑아, 그들이 밖으로 행진 그들이 펼쳐있다. 보라색 막이 bacteriorhodopsin을위한 천연 소스이며, 25 % lipids 및 75% bacteriorhodopsin로 구성되어 있습니다. 단백질은 그림 4에 표시된 AFM을 사용하여 몇 군데 수있는 2 차원 결정 구조, (DJ 뮐러의 샘플 호의에 trimers로 배열되어 기술 대학 , 드레스덴 , 독일 . 특성 trimer 모양은 그림에서 볼 수 있습니다. 단백질은 AFM 후 개별 단백질을 선택하고 팁을 사용하여 뽑아을 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 팁은 특수 코팅 및 분자 구조의 특정 부분을 데리러 수정, 또는 끝 부분이 아닌 구체적으로 분자를 데리러 표면에 누를 수 있습니다.  그림 4. 자주색 막 (세포질 쪽)의 AFM 높이 이미지 (170nm X 100 nm의, 1nm 높이 범위) 버퍼 용액에 접촉 모드에서 JPK NanoWizard ®를 사용하여 촬영한 전개 과정의 개략도 다이어그램 그림 5에 표시됩니다. 7 알파 - 나선이 부분에 표시됩니다, AFM 팁 하나 끝 (실제 단백질, 알파 나선은 번들이 아닌 라인에서 함께 그룹화됩니다) 감지와 함께. 이 여러 가지 전개 경로가 있지만 가장 가능성 이벤트 alphahelices가 쌍으로 꺼내 있다고하고 있습니다. 세 진행은 부분적으로 미국은 그들이 막에서 추출로 펼쳐 알파 나선의 쌍 같이, 그림 5의 일부를 B에 표시됩니다 펼쳐진 거죠.  그림 5. AFM 팁을 사용하여 전개 bacteriorhodopsin의 도식 다이어그램. 분자의 한쪽 끝을은 끝 (A)에 의해 포착되고 알파 나선은 (B) 순차적으로 쌍에서 가져온 있습니다. 그림 6은 힘 10 bacteriorhodopsin 전개 곡선의 중첩은 수정 팁 - 샘플 분리 역모를 꾸몄다 보여줍니다. 끝 표면을 떠난 일부 유착은 40 - 50nm와 60 - 80nm, 동의 주요 산봉우리 20 - 30nm 주위 그림 5 B.에 표시된 세 가지 상태에 대응하는 세 가지 기본 스트레칭과 전개 이벤트, 뒤에,있다 잘 가치와 문학에 발표했다. 캔틸레버는 열 잡음 방법을 사용하여 보정하고, 실험 버퍼 (10mM 트리스, 150mM KCl, pH를 7.6)에서 실시되었다. 채권 실패 이벤트의 정확한 위치는 곡선에서 실온에서 에너지 가까이 열 에너지와 채권에 대한 전형적인 곡선에 따라 다릅니다. 같은 구조가 각각의 경우에 뻗어되는 것을 보여주는 그림 6의 곡선 중첩 부분을 스트레칭. 늘어 채권 휴식 곡선에서 곡선에 차이가만이 실제 순간. 열에너지 근처 에너지 채권에 대한, 그것이 일정한 시간 내에 실패의 일부 확률도없이 강제 적용과 함께있다. 이 솔루션에서 무료로 바인딩 반응을 본 정상 "OFF 속도"에 해당합니다. 힘이 적용으로 약간 일반적으로 안정되는 열 에너지, 위의 에너지와 채권에 대한, 그들의 실패 확률이 저절로 증가합니다.  그림 6. 자주색 막 (10 중첩 곡선을 철회)에서 철수되고 bacteriorhodopsin의 곡선을 펼쳐. 스트레칭 이벤트 생각하는 한 가지 방법은, 그러므로, 전개에 대한 에너지 장벽이 열 범위까지 채권이 긴장되는 것입니다. 채권이 갑자기 실패 실제 순간 전개 에너지 장벽을 통해 분자 소요 임의의 열 변동에 따라 달라집니다. 시간 의존성은 측정 전개 속도 로딩 속도, 또는 팁이 분자의 자유 끝을 당기고 있습니다되는 속도에 따라 달라집니다 것을 의미합니다.  그림 7. 355 bacteriorhodopsin 펼쳐 곡선의 집합에 대한 세 펼쳐 봉우리 (팁 샘플 수정 분리)의 위치 히스토그램. bacteriorhodopsin 많은 펼쳐 곡선이 펼쳐 이벤트 통계보기를 제공 수집하실 수 있습니다. 분자는 여러 가지 방법으로 전개 수 있습니다, 어떤 선택이 특정 하위 집합을 선택할 수있는 힘 곡선에서 만들 수 있도록한다. 이 경우, 같은 그림 6의 예제로 세 가지 기본 스트레칭 이벤트를 보여주는 유일한 곡선이 선정되었습니다. 그림 7에서는 히스토그램은 세 봉우리 (N = 355 곡선에 대한 데이터)에 대한 팁 - 샘플 분리 분포를 보여주는 제공됩니다. 힘 곡선 분석은 부분적으로 PUNIAS 소프트웨어를 사용하여 실시되었다.  그림 8. 그림 6에 표시된 펼쳐 이벤트에 대한 위치 (팁 - 샘플 정정 분리)에 대한 무력의 분산형 플롯. 그림 8은 그림 7에서와 같이 설정 같은 데이터에 대한 이벤트의 위치 비교 전개 부대의 분산형 플롯을 보여줍니다. 첫 번째 펼쳐 이벤트 (피크 1) 힘이 이후 행사 (봉우리 2 3)보다 훨씬 높다. 일단 단백질 구조는 다음 강제는 멤브레인가 감소 밖으로 남아있는 알파 나선 당겨하는 데 필요한, 중단되었습니다. 펼쳐 곡선도 펼쳐 및 멤브레인 꺼내주 분자에 대해 다른 경로를 보여줍니다. 단백질 구조와 아미노산 체인 길이의 지식에서 extensional 곡선이 펼쳐 경로가 특정 힘 곡선에서 촬영되는 명확하게 보여 장착되어 수 있습니다. Titin가 펼쳐 Titin 몇 가지 반복되는 구형 도메인으로 구성되어 근육 조직에서 단백질이다. 근육 조직 내에서 그것은 매크로 스케일에서 기계적 성질에 대한 책임이 있습니다. AFM 개별 titin 분자의 nanomechanical 속성의 연구를 수 있습니다. 분자가 늘어이므로, 어떤 지점에서 함께 특정 도메인을 가지고있는 채권이 실패하게됩니다. 이 특정 구형 도메인은 다음 분자에 대한 더 이상 등고선 길이로 이어지는, 펼쳐집니다. 추가로 철수와 선형 아미노산이 부분도 뻗어 있으며, 다른 도메인 중 하나는 실패 지점에 도달합니다. 이것은 그림 9에서 간략하게 구조 그림입니다.  연속적 구형 도메인 펼쳐 그림 9. titin의 도식 그림, 스트레칭. 단백질이 가져온이므로 도메인은 "팝업"편향 곡선에서 피크의 특성 순서로 이어지는, 순차적으로 엽니다. 힘 줄거리의 각 연속 곡선 부분의 모양은 도메인이 펼쳐 있으므로 분자의 증가 효과 길이를 반영합니다. 전형적인 titin 확장 인력은 분광 곡선이 (사용 얻을 마티아스 Amrein의 데이터 호의, 캘거리, 캐나다의 대학, 그림 10에 표시됩니다 철회 NanoWizard 단일 Ig8 titin 근육 단백질에 대한 ® AFM)을. 펼쳐 이벤트의 특성 titin 순서가 명확하게 볼 수 있습니다. 힘은 분자 증가의 긴장으로 꾸준히 증가합니다. IG 도메인이 열려 잔에서 긴장이 릴리스로 갑자기 힘이 급격히 줄어 듭니다. 각 확장 영역의 곡선은 FJC 또는 해당 무료 아미노산 길이 WLC 모델 장착되어 수 있습니다. 단일 도메인에 대한 전개 강제의 크기는 190 - 250pN의 범위에, 그리고 하나의 도메인 (피크 - 투 - 피크 거리)의 윤곽 길이는 28nm이다.  그림 10. titin의 힘 곡선은 마티아스 Amrein의 (구형 도메인 펼쳐 순차 데이터 의례를 보여주는, 스트레칭 대학 의 캘거리 ). 애플 리케이션 단백질의 다양한는 늘어 및 AFM을 사용하여 펼쳐하실 수 있습니다. 두 예제가 여기 멤브레인 단백질 하나의 세포질 단백질을 보여왔다. 이 방법은 정상적인 단백질의 구조 및 고장 모드 모두에 대한 정보를 얻으려면 다른 단백질로 확장될 수 있습니다. bacteriorhodopsin의 경우, 단백질은 세균 세포 벽이 매우 높은 포장 구조를 형성하고 있으므로 고해상도 구조 결정을위한 크리스털 수있는 몇 가지 막 단백질 중 하나입니다. 이 방법은 더 일반적으로 그러나, 적용할 수 있습니다. 대부분의 멤브레인 단백질이 결정화에 적합 않으므로 대부분의 막 단백질은 아미노산 서열은 접힌 구조보다 결정하기 훨씬 쉽습니다. 다른 구조 단위가 전개로 아미노산 길이의 변화를 보여 AFM, 함께 측정 이벤트를 전개하는 것은 멤브레인 단백질의 차 구조를 해석하는 알려진 순서와 함께 사용할 수 있습니다. 특정 프로브의 코팅, 그리고 구체적인 "픽업"포인트를 가질 단백질의 수정은 다른 위치에있는 단백질을 떼어하고, 구조 단위가 3 - D 구조에 함께 연결하는 방법에 대한 그러므로 자세한 정보를 가져올 수 있습니다. 따라서 AFM은 단일 분자의 구성에 대한 통찰력을 제공하고 분자 모델링 기법을 수정하기 위해 분자 특성의 독립적인 측정을 할 수 수 있습니다. AFM은 또한 TIRF 또는 걱정 단일 분자 형광 기법과 결합 수 있습니다. |