Structureel Onderzoek van Enige Biomoleculen en de Moleculaire Uitrekkende Gebruikende AtoomTechnieken van de Microscoop van de Kracht van Instrumenten JPK

Besproken Onderwerpen

Achtergrond

Moleculaire Uitrekkende Experimenten

Kenmerken van Macromoleculen in Oplossing

Entropic Elasticiteit

Xanthan - het Eenvoudige Moleculaire Uitrekken zich

Bacteriorhodopsin - Extractie en het Openen

Het Openen van Titin

Toepassingen

Achtergrond

NMR spectroscopie en kristallografie van de Röntgenstraal zijn momenteel de gemeenschappelijkste technieken geschikt om de structuren van biologische macromoleculen zoals proteïnen en nucleic zuren op een atoomniveau van resolutie te bepalen. De atoomkrachtmicroscoop (AFM) is meestal gekend voor zijn weergavemogelijkheden, maar het is ook een zeer gevoelig hulpmiddel om krachten op één enkel moleculeniveau kwantitatief te meten.

Dit vermogen staat het gebruik van AFM als alternatieve techniek toe voor het onderzoek van de structurele configuratie van macromoleculen in de inheemse omstandigheden. Het Meten van krachten binnen en tussen enige molecules verstrekt een andere benadering van het begrip van moleculaire energielandschappen en chemische reactiekinetica. AFM kan individuele banden meten die en, zich eerder dan wordt beperkt tot statistische gemiddelden over een bevolking vormen breken.

Dit rapport legt op het gebruik van AFM om enige molecules te manipuleren om informatie over de moleculaire structuur of bouw te halen, en intramoleculaire bandkrachten de nadruk. Het is ook mogelijk om tijd afhankelijke fenomenen, zoals intramoleculaire dynamica in macromoleculen, moleculaire erkenning of proteïne te bestuderen die in situ vouwen.

Moleculaire Uitrekkende Experimenten

De spectroscopie van de Kracht is een wijze AFM waar het uiteinde op en neer boven één enkel punt op de oppervlakte wordt bewogen, terwijl de afbuiging of andere cantilevereigenschappen worden gemeten. Dit geeft een profiel van de krachten bij verschillende hoogten boven de oppervlakte.

In moleculaire uitrekkende experimenten, wordt het uiteinde gewoonlijk gebracht in contact met de oppervlakte, worden de molecules op het substraat toegestaan om met het uiteinde in wisselwerking te staan, en dan wordt de cantilever ingetrokken. Deze beweging wordt getoond schematisch in de beeldreeks in Figuur 1 - naar de steekproef (de benadering) en toen weg opnieuw (trek in). Aangezien de cantilever van de oppervlakte wordt verwijderd, wijst de afbuiging op de krachten tussen het uiteinde en de oppervlakte. Als één enkele molecule tussen het uiteinde en de oppervlakte wordt gehouden, dan die geeft de afbuiging van de cantilever een maatregel van de kracht op de molecule wordt uitgeoefend.

In het schematische diagram in Figuur 1, wordt één enkele molecule getoond wordt uitgerekt tussen het uiteinde en het substraat. De molecule kan een bepaalde driedimensionele gevouwen structuur, zoals voor proteïnen hebben, bijvoorbeeld, of het kan een wanordelijke ketting, zoals veel andere lange polymeren zijn. De zelfklevende interactie tussen het uiteinde en de molecule vindt gewoonlijk in het walgelijke contactdeel plaats van de krachtkromme, maar de eigenschappen van belang voor zich het moleculaire uitrekken worden gevonden in intrekken kromme.

Figuur 1.

De Lange kettingsmolecules, zoals DNA of dextran, kunnen tussen het uiteinde en de steekproef worden uitgerekt. De stijfheid en de persistentielengte kunnen van zich het aanvankelijke uitrekken van de molecule worden gezien. De Interne moleculaire overgangen kunnen ook, zoals de het smelten overgang in DNA worden bestudeerd aangezien de backbone onder hogere spanning herschikt. De Molecules met complexe dimensionale structuur 3, zoals vele proteïnen, kunnen op een gecontroleerde manier worden geopend zodat de structurele eenheden kunnen worden onderzocht. Titin en bacteriorhodopsin zijn voorbeelden van proteïnen die intensief zijn bestudeerd. De proteïnen van het Membraan kunnen van het membraan worden teruggetrokken, en „het knallen“ uit individuele alpha--schroeven is gezien.

Kenmerken van Macromoleculen in Oplossing

De Lange molecules in oplossing zijn zelden staaf-als of stijf, en hebben vaak een hoge flexibiliteit langs de backbone van de molecule. Zelfs liep het dubbel DNA vast, die gewoonlijk wordt gedacht aan aangezien een „stijve“ molecule wegens de dubbel-schroefstructuur, als willekeurige verwarring voor lengten voorbij een paar honderd nanometers wordt geschikt. Dit betekent dat er een groot die verschil tussen de lengte van de molecule langs de ketting wordt gemeten of backbone (de contourlengte) en de typische afmetingen is het in oplossing bezet (b.v. de straal van winding of de lengte van begin tot eind), die veel kleiner is.

Figuur 2.

De regeling wordt vertegenwoordigd schematisch in Figuur 2. In deel A, wordt een lange molecule getoond in een uitgebreide bouw. In deel B, wordt een verschillende bouw getoond waar de molecule in een ontspannen willekeurige verwarring is die een veel kleinere zijafmeting dan de contourlengte bezet. Er zijn veel meer conformations gelijkend op getoond in B beschikbaar aan de molecule dan conformations gelijkend op getoond in A, en dit leidt tot het verschil in entropie of vrije energie van verschillende conformations.

Er zijn kosten in vrije energie om een molecule van bouw B aan A uit recht te maken, aangezien het aantal beschikbare verwante conformations wordt verminderd. Dit vrije energieverschil vertaalt aan een kracht die zich tegen het rechtmaken verzet, en handelt als de entropic „lente“. Dit is in tegenstelling tot de situatie op macroscopische schaal, waar het trekken van een flexibel koord geen significante kracht vereist tot het recht is en de daadwerkelijke backbone wordt uitgerekt.

Wanneer de lange molecules worden getrokken, wordt een kracht vereist om de molecule naar een rechte bouw uit te breiden zelfs als de banden in de backbone niet worden uitgerekt.

Entropic Elasticiteit

Twee basismodellen worden algemeen gebruikt voor deze entropic elasticiteit, die of wat kettingsstijfheid inbegrepen is afhangen. In het vrij verbonden kettings (FJC)model, wordt de backbone als kleine die eenheden gemodelleerd door volledig „vrije“ verbindingen worden verbonden, zodat de aangrenzende eenheden om het even welke hoek kunnen hebben tussen hen zonder extra energiekosten. Het worm-als kettings (WLC)model, in tegenstelling, is een ononderbroken gloeidraad met ingebouwde kettingsstijfheid, en is een beter model voor molecules zoals double-stranded DNA. Een persistentielengte wordt bepaald, die de lengte van de ketting vertegenwoordigt waarover de aanvankelijke richtlijn willekeurig wordt verdeeld.

Als een kracht-uitbreiding kromme wordt verzameld, dan kan het door één van deze modellen om de lengte van de molecule te verkrijgen die, en de persistentielengte voor het model worden gepast WLC worden uitgerekt.

Sommige gespecialiseerde molecules, zoals proteïnen, hebben normaal een bepaalde (gevouwen) driedimensionele structuur in oplossing. Deze structuur is de sleutel aan hun biologische functie als enzymen of structurele eenheden, bijvoorbeeld. De polypeptideketting is geen ontspannen losse rol, maar is gevouwen in een veel stijvere structuur en samengehouden door vele banden. Als de proteïne, door kracht, chemische of thermische veranderingen wordt geopend, dan gedraagt de vrije polypeptideketting zich als een eenvoudige lineaire molecule. Het entropic uitrekken zich kan worden gezien, aangezien de banden langs de polypeptidebackbone hoogst flexibel zijn. De Bepaalde delen van de eiwitstructuur, zoals alpha--schroeven of bolvormige domeinen, kunnen opeenvolgend worden geopend, en de gemeten „vrije die“ lengte van de molecule op de het uitrekken zich krommen wordt gebaseerd zal met elke openende gebeurtenis stijgen. De eiwit openende stappen verstrekken informatie over de normale gevouwen structuur en zijn mislukkingsmechanismen.

Xanthan - het Eenvoudige Moleculaire Uitrekken zich

Xanthan is een bacterieel polysaccharide, met een moleculaire backbone identiek aan cellulose. De chemische eigenschappen van de zijgroepen geven het polymeer vele industriële toepassingen, van voedselstabilisatie aan olieterugwinning.

Wanneer de Xanthan molecule tussen het uiteinde en de oppervlakte wordt uitgerekt, hebben de korte zijgroepen geen significant effect op de elastische eigenschappen, en het gedrag is gelijkaardig aan enig (carboxymethylated) celluloseketting. Hoog - moleculegewichtxanthan de polymeren kunnen lengten van verscheidene microns hebben, en de het uitrekken zich krommen kunnen als voorbeeld voor eenvoudige moleculaire uitbreiding worden gebruikt. Voor lage krachten, wordt de ketting uitgerekt tegen de entropic lente. Op wat punt, aangezien de lengte van begin tot eind de contourlengte nadert, wordt de elasticiteit van de backbone elasticiteit belangrijk.

Figuur 3 toont kromme van één enkele Xanthan molecule intrek die (in een fosfaatbufferoplossing) worden uitgerekt gebruikend NanoWizard® AFM. De cantileverafbuiging is gekalibreerd gebruikend de thermische lawaaimethode.

Voor vergelijking met de modellen, moet de uiteinde-steekproef afstand ook voor de afbuiging van de cantilever worden verbeterd om een echte scheidingswaarde te verkrijgen, die hier wordt getoond. Een grotere negatieve kracht beantwoordt aan het uiteinde die meer naar de oppervlakte worden doen afwijken, en vandaar een hogere extensionalkracht op de molecule.

Figuur 3.

Een kromme van uitgebreide FJC wordt model ook getoond in Figuur 3 voor berekende vergelijking, gebruikend een lengte Kuhn van 6 NM en een contourlengte van 1.25 microns. De pasvorm voor het eenvoudige model FJC of WLC was redelijk voor kleine extensionalkrachten (hieronder rond 50pN in dit geval), maar de krommen divergeerden bij hogere krachten. Vandaar werd het uitgebreide model FJC met de extra segmentelasticiteit gebruikt, om met backbone het uitrekken bij hogere extensionalkrachten rekening te houden zich.

In het geval van Xanthan, worden één enkel lang verband tussen het uiteinde en de oppervlakte uitgerekt. Aangezien de molecule zo lang is, is de kracht om zich uit te breiden het zeer klein voor veel van de het uitrekken zich kromme, en het gedrag wordt overheerst door de hoog-kracht uitrekken die waar de uitgerekte lengte dichtbij de contourlengte is. Voor complexere gevouwen molecules, zoals proteïnen, wordt een reeks deze uitrekkende gebeurtenissen over het algemeen gezien aangezien de verschillende delen van de structuur openen en uitgebreid.

Bacteriorhodopsin - Extractie en het Openen

Bacteriorhodopsin is een integrale membraanproteïne van bacteriële cellen, die energie voor de cellen van lichte fotonen produceert. Er zijn 7 transmembraan alpha--schroeven, met meer gedesorganiseerde peptide lijnen tussen hen.

Wanneer één eind van de proteïne wordt begrepen en getrokken, dan worden de alpha--schroeven teruggetrokken van het membraan, en zij openen aangezien zij worden teruggetrokken.

Het Purpere membraan is de natuurlijke bron voor bacteriorhodopsin, en bestaat uit 25% lipiden en 75% bacteriorhodopsin. De proteïne wordt geschikt als trimeer in een 2 dimensionale kristalstructuur, die imaged kan zijn gebruikend AFM, zoals aangetoond in Figuur 4 (steekproefhoffelijkheid van D.J. Müller, TechnicalUniversityDresdenGermany

Figuur 4.

Een schematisch diagram van het openende proces wordt getoond in Figuur 5. De zeven alpha--schroeven worden getoond in deel A, met het uiteinde AFM die één eind opnemen (merk op dat in de daadwerkelijke proteïne, de alpha--schroeven in een bundel worden gegroepeerd, niet een lijn). Er zijn vele mogelijke openende wegen, maar de most likely gebeurtenissen zijn dat alphahelices in paren worden teruggetrokken. Een vooruitgang van drie gedeeltelijk geopende staten wordt getoond in een deel B van Figuur 5, met paren die alpha--schroeven aangezien zij worden gehaald uit het membraan openen.

Figuur 5.

Figuur 6 toont een superposition van 10 die bacteriorhodopsin het openen krommen, met de kracht tegen verbeterde de uiteinde-steekproef scheiding in kaart wordt gebracht. Er is wat die adhesie aangezien het uiteinde de oppervlakte verlaat, door belangrijke uitrekkende drie en openende gebeurtenissen wordt gevolgd, die aan de drie die staten beantwoorden in Figuur 5 B. worden getoond. De belangrijkste die pieken zijn rond 2030nm, 4050nm en 6080nm, die akkoord goed met waarden gaan in de literatuur worden gepubliceerd. De cantilever was gekalibreerd gebruikend de thermische lawaaimethode, en de experimenten voerden onder buffer (10mM TRIS, 150mM KCl, pH 7.6) uit.

De nauwkeurige positie van de gebeurtenissen van de bandmislukking varieert van kromme aan kromme, die voor banden met energie dicht bij thermische energie bij kamertemperatuur typisch is. De uitrekkende delen van de krommen bedekken in Figuur 6 aantonen, die dat de zelfde structuren in elk geval worden uitgerekt. Het Slechts daadwerkelijke ogenblik wanneer de uitgerekte bandenonderbreking van kromme aan kromme varieert. Voor een band met energie dichtbij de thermische energie, is er wat waarschijnlijkheid van het die binnen een bepaalde tijd, zelfs zonder toegepaste kracht ontbreken. Dit beantwoordt aan het normale die „van-tarief“ voor de bindende reactie vrij in oplossing wordt gezien. Voor banden met energieën een weinig boven de thermische energie, die normaal stabiel zijn, de waarschijnlijkheid van hen die spontaan verhogingen ontbreken aangezien een kracht wordt toegepast.

Figuur 6.

Één manier om aan een uitrekkende gebeurtenis te denken, daarom, is dat de banden worden gespannen tot de energiebarrière voor het openen binnen de thermische waaier is. Het daadwerkelijke ogenblik wanneer de banden plotseling ontbreken hangt van een willekeurige thermische schommeling af, die de molecule over de het openen energiebarrière neemt. De afhankelijkheid van de tijd betekent dat het gemeten openende tarief zal afhangen van het ladingstarief, of de snelheid waarmee het uiteinde het vrije eind van de molecule trekt.

Figuur 7.

Vele het openen krommen van bacteriorhodopsin kunnen worden verzameld om een statistische mening van de openende gebeurtenissen te geven. De molecule kan op verscheidene manieren openen, zodat moet één of andere selectie in de krachtkrommen worden gemaakt om een bepaalde ondergroep te kiezen. In dit geval, slechts werden de krommen die de drie belangrijke uitrekkende gebeurtenissen, zoals de voorbeelden in Figuur 6 tonen, geselecteerd. In Figuur 7 wordt een histogram voorgesteld, tonend de uiteinde-steekproef scheidingsdistributie voor de drie pieken (gegevens voor n = 355 krommen). De analyse van de krachtkromme werd gedeeltelijk uitgevoerd gebruikend de software PUNIAS.

Figuur 8.

Figuur 8 toont een verspreidingsperceel van de openende kracht tegenover de positie van de gebeurtenis voor de zelfde gegevensreeks zoals in Figuur 7. De kracht voor de eerste openende gebeurtenis (Piek 1) is beduidend hoger dan voor de verdere gebeurtenissen (Pieken 2 en 3). Zodra de eiwitdiestructuur is onderbroken, dan wordt de kracht wordt vereist om de resterende alpha--schroeven uit het membraan te trekken verminderd. De het openen krommen tonen ook verschillende wegen voor de molecule om zich van het membraan te openen en terug te trekken. Van een kennis van de de eiwitstructuur en lengten van de aminozuurketting, kunnen de extensionalkrommen worden gepast om duidelijk te tonen welke het openen weg in een bepaalde krachtkromme wordt genomen.

Het Openen van Titin

Titin is een proteïne van spierweefsel, dat uit verscheidene herhaalde bolvormige domeinen bestaat. Binnen het spierweefsel is het de oorzaak van de mechanische eigenschappen op macroscopische schaal. AFM staat de studie van de nanomechanical eigenschappen van individuele titinmolecules toe. Aangezien de molecule wordt uitgerekt, op wat punt zullen de banden die een bepaald domein houden samen ontbreken. Dit bepaalde bolvormige domein opent dan, leidend tot een langere contourlengte voor de molecule. Met verder het trekken, wordt deze sectie lineaire aminozuren ook uitgerekt, en één van de andere domeinen zal zijn mislukkingspunt bereiken. Dit is schematisch geïllustreerd in Figuur 9.

Figuur 9.

Aangezien de proteïne wordt getrokken, „knallen“ de domeinen open opeenvolgend, leidend tot een kenmerkende opeenvolging van pieken in de afbuigingskrommen. De vorm van elk opeenvolgend gebogen deel van het krachtperceel wijst op de verhoogde efficiënte lengte van de molecule aangezien de domeinen worden geopend.

De typische de krachtspectroscopie van de titinuitbreiding trekt kromme in wordt getoond in Figuur 10 (de gegevenshoffelijkheid van Matthias Amrein, Universiteit van Calgary, Canada, verkreeg het gebruiken van NanoWizard® AFM op één enkele Ig8 proteïne van de titinspier). De kenmerkende titinopeenvolging van het openen van gebeurtenissen kan duidelijk worden gezien. De kracht stijgt gestadig, aangezien de spanning in de molecule stijgt. Plotseling scherp vermindert de kracht aangezien een domein Ig open knalt en de spanning wordt vrijgegeven. De kromme van elk uitbreidend gebied kan met het model FJC of WLC voor de overeenkomstige vrij aminozuurlengte worden gepast. De grootte van de openende kracht voor één enkel domein is in de waaier van 190-250pN, en de contourlengte van één domein (peak-to-peak afstand) is 28nm.

Figuur 10. van).

Toepassingen

Een grote verscheidenheid van proteïnen kan worden uitgerekt en worden geopend gebruikend AFM. Twee voorbeelden zijn hier getoond, één membraanproteïne en één cytoplasmic proteïne. Deze methode kan tot andere proteïnen worden uitgebreid, om informatie over zowel de normale eiwitstructuur als zijn mislukkingswijzen te bereiken. In het geval van bacteriorhodopsin, pakten de eiwitvormen zeer hoogst structuren in de bacteriële celwand in, en zo is één van de weinig membraanproteïnen die voor high-resolution structurele bepaling kunnen worden gekristalliseerd.

Deze methode kan meer over het algemeen worden toegepast, nochtans. Voor de meeste membraanproteïnen, is de aminozuuropeenvolging veel gemakkelijker te bepalen dan de gevouwen structuur, aangezien de meeste membraanproteïnen niet geschikt voor kristallisatie zijn.

De Openende die gebeurtenissen met AFM worden gemeten, die de verandering in aminozuurlengte tonen aangezien de verschillende structurele eenheden openen, kunnen met de bekende opeenvolging worden gebruikt om de tertiaire structuur van membraanproteïnen te interpreteren. De Specifieke deklaag van de sonde, en de wijziging van de proteïne om specifieke „oogst“ punten te hebben kunnen tot het trekken van de proteïne bij verschillende plaatsen leiden, en vandaar verdere informatie over hoe de structurele eenheden samen in de 3-D structuur worden verbonden.

Aldus kan AFM inzicht geven in de configuratie van één enkele molecule en een onafhankelijke meting van moleculaire eigenschappen toestaan om moleculaire modelleringstechnieken te raffineren. AFM kan ook met de enige technieken van de moleculefluorescentie zoals TIRF of LIJSTWERK worden gecombineerd.

Bron: Instrumenten JPK

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Instrumenten JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:43

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit