Investigação Estrutural de Únicas Biomoléculas e de Técnicas Atômicas de Utilização de Esticão Moleculars do Microscópio da Força dos Instrumentos de JPK

Assuntos Cobertos

Fundo

Experiências de Esticão Moleculars

Características das Macromoléculas na Solução

Elasticidade Entrópica

Xanthan - Esticão Molecular Simples

Bacteriorhodopsin - Extracção e Revelação

Revelação de Titin

Aplicações

Fundo

A espectroscopia e o cristalografia NMR do Raio X são actualmente as técnicas as mais comuns capazes de determinar as estruturas de macromoléculas biológicas como proteínas e ácidos nucleicos a nível atômico de definição. O microscópio atômico da força (AFM) é sabido na maior parte para suas capacidades da imagem lactente, mas é igualmente uma ferramenta muito sensível para quantitativa medir forças em um único nível da molécula.

Esta capacidade permite o uso do AFM como uma técnica alternativa para a investigação da configuração estrutural das macromoléculas sob circunstâncias nativas. Medir forças dentro e entre das únicas moléculas fornece uma outra aproximação à compreensão de paisagens da energia e da cinética de reacção química moleculars. O AFM pode medir as ligações individuais que formam e que quebram, um pouco do que sendo limitado às médias estatísticas sobre uma população.

Este relatório concentra-se no uso do AFM manipular únicas moléculas para extrair a informação sobre a estrutura molecular ou a conformação, e em forças obrigatórias intramolecular. É igualmente possível estudar in situ fenômenos dependentes do tempo, tais como a dinâmica intramolecular nas macromoléculas, no reconhecimento molecular ou na dobradura de proteína.

Experiências de Esticão Moleculars

A espectroscopia da Força é um modo do AFM onde a ponta esteja movida para cima e para baixo acima de um único ponto na superfície, quando a deflexão ou outras propriedades do modilhão forem medidas. Isto dá um perfil das forças em alturas diferentes acima da superfície.

Em experiências de esticão moleculars, a ponta é trazida geralmente no contacto com a superfície, as moléculas na carcaça são permitidas interagir com a ponta, e o modilhão é retraído então. Este movimento é mostrado esquematicamente na série da imagem em Figura 1 - para a amostra (a aproximação) e então afastado outra vez (o retraimanto). Enquanto o modilhão é movido longe da superfície, a deflexão reflecte as forças entre a ponta e a superfície. Se uma única molécula é guardarada entre a ponta e a superfície, a seguir a deflexão do modilhão dá uma medida da força exercida na molécula.

No diagrama esquemático em Figura 1, uma única molécula é mostrada o esticão entre a ponta e a carcaça. A molécula pode ter uma estrutura dobrada tridimensional definida, quanto para às proteínas, por exemplo, ou a ela pode ser uma corrente desorganizado, tal como muitos outros polímeros longos. A interacção adesiva entre a ponta e a molécula ocorre geralmente na peça repulsivo do contacto da curva da força, mas as características do interesse para o esticão molecular são encontradas na curva do retraimanto.

Figura 1.

As moléculas chain Longas, tais como o ADN ou o dextrano, podem ser esticadas entre a ponta e a amostra. O comprimento da rigidez e da persistência pode ser considerado do esticão inicial da molécula. As transições moleculars Internas podem igualmente ser estudadas, como a transição de derretimento no ADN enquanto a espinha dorsal rearranja sob uma tensão mais alta. As Moléculas com estrutura dimensional do complexo 3, tal como muitas proteínas, podem ser desdobradas em uma maneira controlada de modo que as unidades estruturais possam ser investigadas. Titin e o bacteriorhodopsin são exemplos das proteínas que foram estudadas intensiva. As proteínas da Membrana podem ser retiradas da membrana, e o “estalo” fora das alfa-hélices individuais foi considerado.

Características das Macromoléculas na Solução

As moléculas Longas na solução estão raramente haste-como ou duro, e têm frequentemente uma flexibilidade alta ao longo da espinha dorsal da molécula. Dobre Mesmo o ADN encalhado, que é pensado geralmente como de uma molécula “dura” devido à estrutura da dobro-hélice, é arranjado como um emaranhado aleatório para comprimentos além de alguns cem nanômetros. Isto significa que há uma grande diferença entre o comprimento da molécula medida ao longo da corrente ou espinha dorsal (o comprimento do contorno) e as dimensões que típicas ocupa na solução (por exemplo o raio da rotação ou do comprimento fim-a-fim), que são muito menor.

Figura 2.

O regime é representado esquematicamente em Figura 2. Na parte A, uma molécula longa é mostrada em uma conformação prolongada. No parte b, uma conformação diferente é mostrada onde a molécula está em um emaranhado aleatório relaxado que ocupe uma dimensão lateral muito menor do que o comprimento do contorno. Há muito mais conformações similares a essa mostrada em B disponível à molécula do que as conformações similares a essa mostrada em A, e este conduz à diferença na entropia ou na energia livre das conformações diferentes.

Há um custo na energia livre para endireitar para fora uma molécula da conformação B a A, desde que o número de conformações relacionadas disponíveis é reduzido. Esta diferença da energia livre traduz a uma força que resista o endireitamento, e actua como uma “mola entrópica”. Isto é contrariamente à situação em uma escala macroscópica, onde puxar uma corda flexível não exija uma força significativa até que esteja recto e a espinha dorsal real estiver esticada.

Quando as moléculas longas são puxadas, uma força está exigida para estender a molécula para uma conformação recta mesmo se as ligações na espinha dorsal não estão sendo esticadas.

Elasticidade Entrópica

Dois modelos básicos são de uso geral para esta elasticidade entrópica, dependendo se alguma rigidez chain é incluída. No modelo chain livremente (FJC) articulado, a espinha dorsal é modelada como as unidades pequenas conectadas por junções completamente “livres”, de modo que as unidades adjacentes possam ter todo o ângulo entre elas sem custos da energia extra. Sem-fim-como o modelo (WLC) chain, ao contrário, é um filamento contínuo com a rigidez chain construída dentro, e é um modelo melhor para moléculas tais como o ADN dobro-encalhado. Um comprimento da persistência é definido, que represente o comprimento da corrente sobre que a orientação inicial randomised.

Se uma curva da força-extensão é recolhida, a seguir pode ser cabida por um destes modelos para obter o comprimento da molécula que está sendo esticada, e pelo comprimento da persistência para o modelo de WLC.

Algumas moléculas especializadas, tais como proteínas, têm normalmente uma estrutura tridimensional (dobrada) definida na solução. Esta estrutura é a chave a sua função biológica como enzimas ou unidades estruturais, por exemplo. A corrente do polipeptídeo não é uma bobina fraca relaxado, mas é dobrada em uma estrutura muito mais dura e mantida unida por muitas ligações. Se a proteína está desdobrada, pela força, produto químico ou o thermal muda, a seguir a corrente livre do polipeptídeo comporta-se como uma molécula linear simples. O esticão entrópico pode ser considerado, porque as ligações ao longo da espinha dorsal do polipeptídeo são altamente flexíveis. As partes Definidas da estrutura da proteína, tais como alfa-hélices ou domínios globulares, podem ser desdobradas sequencialmente, e o comprimento “livre” medido da molécula baseada nas curvas de esticão aumentará com cada revelação do evento. A revelação das etapas da proteína fornece a informação sobre a estrutura dobrada normal e seus mecanismos de falha.

Xanthan - Esticão Molecular Simples

O Xanthan é um polisacárido bacteriano, com uma espinha dorsal molecular idêntica à celulose. As propriedades químicas dos grupos laterais dão ao polímero muitas aplicações industriais, da estabilização do alimento à recuperação do petróleo.

Quando a molécula do Xanthan é esticada entre a ponta e a superfície, os grupos laterais curtos não têm um efeito significativo nas propriedades elásticas, e o comportamento é similar a uma única corrente (carboxymethylated) da celulose. Alto - os polímeros do xanthan do peso molecular podem ter comprimentos de diversos mícrons, e as curvas de esticão podem ser usadas como um exemplo para a extensão molecular simples. Para baixas forças, a corrente é esticada contra a mola entrópica. Em algum momento, como o comprimento fim-a-fim aproxima o comprimento do contorno, a elasticidade da elasticidade da espinha dorsal torna-se importante.

Figura 3 mostra a curva do retraimanto de uma única molécula do Xanthan que está sendo esticada (em uma solução de amortecedor do fosfato) usando o NanoWizard® AFM. A deflexão do modilhão foi calibrada usando o método térmico do ruído.

Para a comparação com os modelos, a distância da ponta-amostra deve igualmente ser corrigida para a deflexão do modilhão para obter um valor real da separação, que seja mostrado aqui. Uma força negativa maior corresponde à ponta que está sendo deflexionada mais para a superfície, e daqui uma força extensional mais alta na molécula.

Figura 3.

Uma curva do modelo prolongado de FJC é mostrada igualmente em Figura 3 para a comparação, calculada usando um comprimento de Kuhn de 6 nanômetro e um comprimento do contorno de 1,25 mícrons. O ajuste para o modelo simples de FJC ou de WLC era razoável para forças extensional pequenas (abaixo em torno de 50pN neste caso), mas as curvas divergiram em umas forças mais altas. Daqui o modelo prolongado de FJC com a elasticidade adicional do segmento foi usado, para tomar em consideração a espinha dorsal que estica em umas forças extensional mais altas.

No caso do Xanthan, uma única relação longa entre a ponta e a superfície é esticada. Desde Que a molécula é tão longa, a força para estendê-la é muito pequena para muita da curva de esticão, e o comportamento é dominado pela alto-força que estica aonde o comprimento esticado está perto do comprimento do contorno. Para mais moléculas dobradas complexo, tais como proteínas, uma série destes eventos de esticão é considerada geralmente enquanto as partes diferentes da estrutura se desdobram e se são prolongadas.

Bacteriorhodopsin - Extracção e Revelação

Bacteriorhodopsin é uma proteína integral da membrana das pilhas bacterianas, que gere a energia para as pilhas dos fotão claros. Há 7 alfa-hélices da transmembrana, com mais laços desorganizados do peptide entre eles.

Quando uma extremidade da proteína é agarrada e puxado, a seguir as alfa-hélices estão retiradas da membrana, e desdobram-se enquanto são retiradas.

A membrana Roxa é a fonte natural para o bacteriorhodopsin, e consiste em lipidos de 25% e em bacteriorhodopsin de 75%. A proteína é arranjada como trimers em uma estrutura 2 de cristal dimensional, que possa ser imaged usando o AFM, segundo as indicações de Figura 4 (cortesia da amostra de D.J. Müller, TechnicalUniversityDresdenGermany

Figura 4.

Um diagrama esquemático da revelação do processo é mostrado em Figura 5. As sete alfa-hélices são mostradas na parte A, com a ponta do AFM que pegara uma extremidade (a nota que na proteína real, as alfa-hélices são agrupadas junto em um pacote, não uma linha). Há muito revelação possível dos caminhos, mas os eventos mais provável são que os alphahelices estão retirados em pares. Uma progressão de três estados parcialmente desdobrados está mostrada no parte b de Figura 5, com pares de alfa-hélices desdobrando-se enquanto são extraídos da membrana.

Figura 5.

Figura 6 mostra uma superposição da revelação das curvas do bacteriorhodopsin 10, com a força traçada contra a separação corrigida da ponta-amostra. Há alguma adesão como a ponta sae da superfície, seguida pelos eventos de esticão três e desdobrando-se principais, correspondendo aos três estados mostrados na Figura 5 B. Os picos principais são em torno de 20-30nm, de 40-50nm e de 60-80nm, que concordam bem com os valores publicados na literatura. O modilhão foi calibrado usando o método térmico do ruído, e as experiências realizadas sob o amortecedor (10mM TRIS, KCl de 150mM, pH 7,6).

A posição exacta dos eventos de falha bond varia da curva à curva, que é típica para ligações com energia perto da energia térmica na temperatura ambiente. As partes de esticão das curvas overlay em Figura 6, mostrando que as mesmas estruturas estão sendo esticadas em cada caso. Somente o momento real em que a ruptura esticada das ligações varia da curva à curva. Para uma ligação com energia perto da energia térmica, há alguma probabilidade dela que falha dentro de algum tempo, mesmo sem força aplicada. Isto corresponde à “fora-taxa normal” vista para a reacção obrigatória livre na solução. Para ligações com energias um pouco acima da energia térmica, que são normalmente estáveis, a probabilidade delas que falham espontâneamente aumenta enquanto uma força é aplicada.

Figura 6.

Uma maneira de pensar de um evento de esticão, é conseqüentemente que as ligações estão esticadas até que a barreira de energia a se desdobrar esteja dentro da escala térmica. O momento real quando as ligações falham de repente depende de uma flutuação térmica aleatória, que tome a molécula sobre a revelação de barreira de energia. A dependência do tempo significa que a taxa se desdobrando medida dependerá da taxa de carregamento, ou a velocidade com que a ponta está puxando a extremidade livre da molécula.

Figura 7.

Muitos revelação das curvas do bacteriorhodopsin podem ser recolhidos para dar uma ideia estatística da revelação dos eventos. A molécula pode desdobrar-se em diversas maneiras, assim que alguma selecção tem que ser feita nas curvas da força para escolher um subconjunto particular. Neste caso, somente as curvas que mostram os três eventos de esticão principais, tais como os exemplos em Figura 6, foram seleccionadas. Em Figura 7 um histograma é apresentado, mostrando a distribuição da separação da ponta-amostra para os três picos (dados para n = 355 curvas). A análise da curva da força foi realizada parcialmente usando o software de PUNIAS.

Figura 8.

Figura 8 mostra um lote do scatter da revelação da força contra a posição do evento para a mesma série de dados que em Figura 7. A força para a primeira revelação do evento (Pico 1) é significativamente mais alta do que para os eventos subseqüentes (Picos 2 e 3). Uma Vez Que a estrutura da proteína foi interrompida, a seguir a força exigida para puxar as alfa-hélices restantes fora da membrana está reduzida. A revelação das curvas igualmente mostra caminhos diferentes para que a molécula desdobre-se e retire-se da membrana. De um conhecimento dos comprimentos chain da estrutura e do ácido aminado da proteína, as curvas extensional podem ser cabidas para mostrar claramente que revelação do trajecto é recolhido uma curva particular da força.

Revelação de Titin

Titin é uma proteína do tecido do músculo, que consiste em diversos domínios globulares repetidos. Dentro do tecido do músculo é responsável para as propriedades mecânicas em uma escala macroscópica. O AFM permite o estudo das propriedades nanomechanical de moléculas individuais do titin. Porque a molécula é esticada, em algum momento as ligações que guardaram um domínio particular junto falharão. Este domínio globular particular desdobra-se então, conduzindo a um comprimento mais longo do contorno para a molécula. Com mais puxar, esta secção de ácidos aminados lineares é esticada igualmente, e um dos outros domínios alcançará seu ponto da falha. Isto é ilustrado esquematicamente em Figura 9.

Figura 9.

Enquanto a proteína é puxada, os domínios “estalam” abrem sequencialmente, conduzindo a uma seqüência característica dos picos na deflexão curvam-se. A forma de cada parte curvada sucessiva do lote da força reflecte o comprimento eficaz aumentado da molécula enquanto os domínios são desdobrados.

Uma espectroscopia típica da força da extensão do titin retrai a curva é mostrada em Figura 10 (cortesia dos dados de Matthias Amrein, Universidade de Calgary, de Canadá, obtidos usando o NanoWizard® AFM em uma única proteína de músculo do titin Ig8). A seqüência característica do titin da revelação dos eventos pode claramente ser considerada. Os aumentos da força firmemente, como a tensão na molécula aumentam. De Repente a força diminui agudamente enquanto os PNF de um domínio de Ig abrem e a tensão está tirada. A curva de cada região de alargamento pode ser cabida com o modelo de FJC ou de WLC para o comprimento correspondente do ácido aminado livre. O tamanho da revelação da força para um único domínio está na escala de 190-250pN, e o comprimento do contorno de um domínio (distância do pico-à-pico) é 28nm.

Figura 10. de).

Aplicações

Uma grande variedade de proteínas pode ser esticada e desdobrado usando o AFM. Dois exemplos foram mostrados aqui, uma proteína da membrana e uma proteína citoplasmática. Este método pode ser estendido a outras proteínas, à informação do ganho sobre a estrutura normal da proteína e seus modos de falha. No caso do bacteriorhodopsin, a proteína forma estruturas muito altamente embaladas na parede de pilha bacteriana, e assim que é uma de poucas proteínas da membrana que podem ser cristalizadas para a determinação estrutural de alta resolução.

Este método pode ser mais geralmente aplicado, contudo. Para a maioria de proteínas da membrana, a seqüência de ácido aminado é muito mais fácil de determinar do que a estrutura dobrada, desde que a maioria de proteínas da membrana não são apropriadas para a cristalização.

A Revelação dos eventos medidos com o AFM, que mostram a mudança do comprimento do ácido aminado enquanto as unidades estruturais diferentes se desdobram, pode ser usada com a seqüência conhecida para interpretar a estrutura terciária de proteínas da membrana. O revestimento Específico da ponta de prova, e a alteração da proteína para ter pontos específicos do “recolhimento” podem conduzir a puxar a proteína em lugar diferentes, e daqui em informações adicionais sobre como as unidades estruturais são conectadas junto na estrutura 3-D.

Assim o AFM pode dar a introspecção na configuração de uma única molécula e permitir que uma medida independente de propriedades moleculars refine técnicas de modelagem moleculars. O AFM pode igualmente ser combinado com as únicas técnicas da fluorescência da molécula tais como TIRF ou FRICÇÃO.

Source: Instrumentos de JPK

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos de JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:20

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