Espectroscopia de RMN e cristalografia de raios X são atualmente as técnicas mais comuns capazes de determinar as estruturas de macromoléculas biológicas, como proteínas e ácidos nucléicos em um nível atômico de resolução. O microscópio de força atômica (AFM) é conhecido principalmente por suas capacidades de imagem, mas também é uma ferramenta muito sensível para medir quantitativamente as forças em nível única molécula. Esta capacidade permite o uso de AFM como uma técnica alternativa para a investigação da configuração estrutural de macromoléculas em condições nativas. Medir forças dentro e entre moléculas individuais fornece uma outra abordagem para a compreensão das paisagens de energia cinética molecular e reação química. O AFM pode medir títulos individuais formando e quebrando, ao invés de estar limitado a médias estatísticas sobre uma população. Este relatório se concentra no uso do AFM para manipular moléculas individuais para extrair informações sobre a estrutura molecular ou conformação, e forças de ligação intramolecular. Também é possível estudar fenômenos dependentes do tempo, tais como dinâmica intramolecular em macromoléculas, reconhecimento molecular ou dobramento de proteínas in situ. Experimentos Molecular Alongamento Força espectroscopia é um modo AFM onde a ponta é movido para cima e para baixo sobre um único ponto na superfície, enquanto a deflexão ou propriedades cantilever outros são medidos. Isto dá um perfil das forças em diferentes alturas acima da superfície. Em experimentos molecular alongamento, a dica é normalmente colocada em contato com a superfície, as moléculas do substrato podem interagir com a ponta, e então o cantilever é retraída. Esse movimento é mostrado esquematicamente na série de imagens na Figura 1 - para a amostra (a abordagem) e, em seguida, embora de novo (a retrair). À medida que o cantilever é movida para longe da superfície, a deflexão reflete as forças entre a ponta ea superfície. Se uma única molécula é realizada entre a ponta ea superfície, então a deflexão do cantilever dá uma medida da força exercida sobre a molécula. No diagrama esquemático na Figura 1, uma única molécula é mostrada a ser esticado entre a ponta eo substrato. A molécula pode ter uma estrutura tridimensional definida dobradas, como por proteínas, por exemplo, ou pode ser uma cadeia desordenada, como muitos outros longos polímeros. A interação adesiva entre a ponta ea molécula ocorre geralmente na parte de contato repulsiva da curva de força, mas as características de interesse para o alongamento molecular encontram-se na curva de retração.  Figura 1. Diagrama esquemático de um experimento de espectroscopia de força, onde a ponta do AFM é usado para esticar uma única molécula Moléculas de cadeia longa, como o DNA ou dextran, pode ser esticado entre a ponta ea amostra. A rigidez e comprimento persistência pode ser visto a partir do alongamento inicial da molécula. Interna transições moleculares também podem ser estudados, como a transição de fusão no DNA como a espinha dorsal reorganiza sob maior tensão. Moléculas com a estrutura 3-dimensional complexo, como muitas proteínas, pode ser desdobrado de forma controlada para que as unidades estruturais podem ser investigadas. Titina e bacteriorodopsina são exemplos de proteínas que têm sido intensamente estudados. Proteínas da membrana pode ser puxado para fora da membrana, ea out "popping" do indivíduo alfa-hélices foi visto. Características de Macromoléculas em Solução Moléculas longas em solução raramente são rod-like ou dura, e muitas vezes têm uma elevada flexibilidade ao longo da espinha dorsal da molécula. Mesmo DNA dupla fita, que é geralmente considerado como uma molécula "dura" por causa da estrutura de dupla hélice, é organizado como um emaranhado aleatório para comprimentos além de algumas centenas de nanômetros. Isto significa que há uma grande diferença entre o comprimento da molécula medido ao longo da cadeia ou backbone (o comprimento de contorno) e as dimensões típicas que ocupa na solução (por exemplo, o raio de giro ou o comprimento de ponta a ponta), que são muito menores.  Figura 2. Diagrama esquemático de duas conformações possíveis de uma molécula longa. Em A, a molécula é esticada em uma conformação improvável para uma molécula em solução. B mostra uma conformação mais típico, onde a molécula é em um emaranhado desorganizado. O arranjo é representado esquematicamente na Figura 2. Na parte A, uma molécula longa é mostrado em uma conformação estendida. Na parte B, uma conformação diferente é mostrado, onde a molécula é relaxado em um emaranhado aleatório que ocupa uma dimensão muito menor lateral do que o comprimento de contorno. Há conformações muito mais semelhante ao mostrado na B disponíveis para a molécula de conformações semelhantes ao mostrado em A, e isso leva à diferença de entropia ou energia livre de conformações diferentes. Há um custo de energia livre para endireitar uma molécula de conformação B para A, pois o número de conformações disponíveis relacionados é reduzida. Esta diferença de energia livre se traduz em uma força que resiste ao estiramento, e age como uma "mola" entrópico. Isto está em contraste com a situação em uma escala macroscópica, onde puxando uma corda flexível não requer uma força significativa até que ele é reto e do backbone real é esticado. Quando as moléculas longas são puxados, uma força é necessária para estender a molécula para uma conformação reta, mesmo que as ligações no backbone não estão sendo esticada. Elasticidade entrópica Dois modelos básicos são comumente usados para essa elasticidade entrópica, dependendo se alguma rigidez da cadeia está incluído. Na cadeia livremente articulada modelo (FJC), a espinha dorsal é modelado como pequenas unidades ligadas por completamente "livre" articulações, para que as unidades adjacentes podem ter qualquer ângulo entre eles, sem custo de energia extra. O worm-like modelo de cadeia (WLC), em contraste, é um filamento contínuo com a rigidez da cadeia integrada, e é um modelo melhor para moléculas como double-stranded DNA. Um comprimento de persistência é definida, o que representa o comprimento da cadeia sobre a qual a orientação inicial é aleatória. Se uma curva de força-extensão é recolhida, então ele pode ser equipado por um desses modelos para obter o comprimento da molécula sendo esticado, o comprimento e persistência para o modelo WLC. Algumas moléculas especializadas, tais como proteínas, normalmente têm um definido (dobrado) estrutura tridimensional em solução. Esta estrutura é a chave para a sua função biológica como enzimas ou unidades estruturais, por exemplo. A cadeia polipeptídica não é uma bobina relaxado solta, mas é dobrada em uma estrutura muito mais duro e mantidos juntos por muitos laços. Se a proteína é desdobrada, por força de alterações químicas ou térmicas, então a cadeia de polipeptídeo livre se comporta como uma molécula linear simples. O entrópica alongamento pode ser visto, como os títulos ao longo da espinha dorsal polipeptídica são altamente flexíveis. Partes definidas da estrutura da proteína, tais como alfa-hélices ou domínios globulares, pode ser desdobrada em seqüência, e as medidas de comprimento "livre" da molécula com base nas curvas de alongamento irá aumentar com cada evento desdobramento. A proteína desdobramento etapas fornecem informações sobre a estrutura normal dobrado e os seus mecanismos de falha. Xantana - Molecular simples de alongamento Xantana é um polissacarídeo bacteriano, com um backbone molecular idêntica à celulose. As propriedades químicas dos grupos laterais dão o polímero muitas aplicações industriais, de estabilização de alimentos para a recuperação de petróleo. Quando a molécula de xantana é esticado entre a ponta ea superfície, os grupos laterais curtos não têm um efeito significativo sobre as propriedades elásticas, eo comportamento é similar a uma única cadeia de celulose (carboximetilada). Polímeros de alto peso molecular xantana pode ter vários comprimentos de microns, e as curvas de alongamento pode ser usado como um exemplo para a extensão molecular simples. Para as forças de baixo, a cadeia é esticada contra a mola entrópica. Em algum ponto, como o comprimento de ponta a ponta se aproxima do comprimento do contorno, a elasticidade da elasticidade backbone torna-se importante. A Figura 3 mostra a curva de retirar de uma molécula de xantana único ser esticado (em uma solução tampão de fosfato), utilizando o NanoWizard ® AFM. A deflexão do cantilever foi calibrado usando o método do ruído térmico. Para comparação com os modelos, a distância da ponta-amostra também deve ser corrigido para a deflexão do cantilever para obter um valor de separação real, que é mostrado aqui. A maior força negativa corresponde à ponta sendo desviado mais para a superfície e, portanto, uma força superior extensional na molécula.  Figura 3. Espectroscopia Força retrair curva de uma molécula de xantana único ser esticado. A curva para o modelo estendido FJC também é mostrado para comparação. A curva do modelo estendido FJC também é mostrado na Figura 3 para comparação, calculada usando um comprimento de Kuhn de 6 nm e um comprimento de contorno de 1,25 microns. O ajuste para a FJC simples ou modelo WLC era razoável para pequenas forças extensional (abaixo de cerca de 50pN neste caso), mas as curvas divergiram em forças superiores. Portanto, o modelo estendido FJC com a elasticidade segmento adicional foi utilizado, para ter em conta a espinha dorsal que se estende em maior forças extensionais. No caso da xantana, um único link longo entre a ponta ea superfície é esticada. Como a molécula é tão longa, a força para estendê-lo é muito pequena para grande parte da curva de alongamento, eo comportamento é dominado pela maior força de alongamento cujo comprimento estirado está perto do comprimento do contorno. Para mais complexas moléculas dobrados, tais como proteínas, uma série desses eventos alongamento são geralmente vistos como diferentes partes da estrutura evolui e é prolongado. Bacteriorodopsina - Extração e Desdobramento Bacteriorodopsina é uma proteína integral de membrana das células bacterianas, que gera energia para as células de fótons de luz. Há 7 transmembrana alfa-hélices, com loops de peptídeo mais desorganizado entre eles. Quando uma das extremidades da proteína é agarrado e puxado, então a alfa-hélices são puxados para fora da membrana, e eles se desdobram como eles são puxados para fora. Como a proteína é puxado, os domínios "pop" open seqüencialmente, levando a uma seqüência característica de picos nas curvas de deflexão. A forma de cada peça sucessivas curvas da trama força reflete o aumento do comprimento efetivo da molécula como os domínios são reveladas. A força de extensão típico titina espectroscopia retrair curva é mostrado na Figura 10 (dados cortesia de Matthias Amrein, University of Calgary, Canadá, obtidos com o NanoWizard ® AFM em uma única proteína muscular IG8 titina). A seqüência de titina característica da evolução dos acontecimentos pode ser visto claramente. A força aumenta de forma constante, como a tensão aumenta na molécula. De repente, a força diminui acentuadamente como um domínio Ig se abre ea tensão é liberada. A curva de cada região que se estende pode ser equipado com o FJC ou modelo WLC para o comprimento de ácido amino livre correspondente. O tamanho da força de desdobramento para um único domínio é na faixa de 190-250pN, eo comprimento do contorno de um domínio (pico a pico distância) é 28nm.  Figura 10. Curva de Força de titina alongamento, mostrando seqüencial desdobramento dos domínios globulares (cortesia de dados de Matthias Amrein, Universidade de Calgary ). Aplicações Uma grande variedade de proteínas pode ser esticado e desdobrou utilizando o AFM. Dois exemplos foram mostrados aqui, uma proteína de membrana e uma proteína citoplasmática. Este método pode ser estendido a outras proteínas, para obter informações sobre a estrutura da proteína normal e seus modos de falha. No caso de bacteriorodopsina, a proteína formas estruturas altamente embalado na parede celular das bactérias, e assim é uma das proteínas da membrana poucos que pode ser cristalizado de alta resolução determinação estrutural. Este método pode ser aplicado de modo mais geral, no entanto. Para mais proteínas de membrana, a seqüência de aminoácidos é muito mais fácil de determinar do que a estrutura dobrada, já que a maioria das proteínas da membrana não são adequadas para a cristalização. Desdobramento eventos medidos com a AFM, que mostram a mudança no comprimento de aminoácidos diferentes unidades estruturais desdobram, pode ser usado com a seqüência conhecida por interpretar a estrutura terciária de proteínas da membrana. Revestimento específico da sonda, e modificação da proteína específica para ter "pick-up" pontos pode levar a puxar a proteína em diferentes locais, e, portanto, mais informações sobre como as unidades estruturais estão ligados entre si na estrutura 3-D. Assim AFM é capaz de dar dicas sobre a configuração de uma única molécula e permitir uma medição independente de propriedades moleculares para refinar as técnicas de modelagem molecular. AFM também pode ser combinado com técnicas de fluorescência única molécula, como TIRF ou FRET. |