Структурное Исследование Одиночных Биомолекул и Молекулярного Протягивать Используя Атомные Методы Микроскопа Усилия от Аппаратур JPK

Покрытые Темы

Предпосылка

Молекулярные Протягивая Эксперименты

Характеристики Макромолекул в Разрешении

Entropic Упругость

Xanthan - Простой Молекулярный Протягивать

Bacteriorhodopsin - Извлечение и Развёртка

Развёртка Titin

Применения

Предпосылка

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ВОЕННЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ спектроскопия и кристаллография Рентгеновского Снимка в настоящее время самые общие методы способные определять структуры биологических макромолекул как протеины и нуклеиновые кислоты на атомном уровне разрешения. Атомный микроскоп усилия (AFM) главным образом знан для своих возможностей воображения, но это также очень чувствительный инструмент для количественно измерять усилия на одиночном уровне молекулы.

Эта возможность позволяет пользе AFM как альтернативный метод для исследования структурной конфигурации макромолекул под родними условиями. Измерять усилия в пределах и между одиночными молекулами снабубежит другой подход вникание молекулярных ландшафтов энергии и кинетики химической реакции. AFM может измерить индивидуальные скрепления формируя и ломая, вернее чем ограничиваемо к статистически средним над населенностью.

Этот рапорт концентрирует на пользе AFM манипулировать одиночные молекулы для того чтобы извлечь информацию о молекулярной структуре или конформации, и внутримолекулярных силах связи. Также возможно изучить явления времени зависимые, как внутримолекулярная динамика в макромолекулах, молекулярном опознавании или складчатости протеина в situ.

Молекулярные Протягивая Эксперименты

Спектроскопия Усилия режим AFM куда подсказка двинута вверх и вниз над одноточечным на поверхности, пока измерены отклонение или другие консольные свойства. Это дает профиль усилий на различных высотах над поверхностью.

В молекулярных протягивая экспериментах, подсказка обычно коснута друг друга с поверхностью, молекулы на субстрате позволены взаимодействовать с подсказкой, и после этого cantilever втягиван. Показывают Это движение схематически в серии изображения в Диаграмме 1 - к образцу (подходу) и после этого прочь снова (втягивать). По Мере Того Как cantilever двинут далеко от поверхности, отклонение отражает усилия между подсказкой и поверхностью. Если одиночная молекула держится между подсказкой и поверхностью, то отклонение cantilever дает измерение усилия приложенного на молекуле.

В схематической диаграмме в Диаграмме 1, показывают одиночной молекуле быть протягиванным между подсказкой и субстратом. Молекула может иметь определенную трехмерную сложенную структуру, как для протеинов, например, или ее может быть беспорядочная цепь, как много других длинних полимеров. Слипчивое взаимодействие между подсказкой и молекулой обычно осуществляет в отталкивающей части контакта кривого усилия, но характеристики интереса для молекулярный протягивать найдены в кривом втягивать.

Диаграмма 1.

Длинние цепные молекулы, как ДНА или декстран, можно протянуть между подсказкой и образцом. Длину жесткости и персистирования можно увидеть от начальный протягивать молекулы. Внутренние молекулярные переходы можно также изучить, как плавя переход в ДНА по мере того как костяк переставляет под высокаяа напряженность. Молекулы с структурой комплекса 3 габаритной, как много протеинов, можно раскрыть в контролируемом путе так, что структурные блоки можно расследовать. Titin и bacteriorhodopsin примеры протеинов которые интенсивно были изучены. Протеины Мембраны можно вытянуть из мембраны, и было увиден «хлопать» из индивидуальных альфа-винтовых линий.

Характеристики Макромолекул в Разрешении

Длинние молекулы в разрешении редко штанг-как или жестко, и часто имеют высокую гибкость вдоль костяка молекулы. Даже удвоьте, котор сели на мель ДНА, которое обычно подумано как «жесткой» молекулы из-за структуры двойн-винтовой линии, аранжирует как случайный путать для длин за немного 100 нанометров. Это значит что большая разница между длиной молекулы измеренной вдоль цепи или костяком (длиной контура) и типичными размерами она занимает в разрешении (например радиусе гирации или сквозной длины), которое гораздо малее.

Диаграмма 2.

Расположение представлено схематически в Диаграмме 2. В части A, длинняя молекула показана в выдвинутой конформации. В части B, различная конформация показана где молекула в relaxed случайном путать который занимает гораздо малее боковой размер чем длина контура. Еще многие конформаций подобных до одно показанное в B доступном к молекуле чем конформации подобные до одно показанное в A, и это водит к разнице в энтропии или свободной энергии различных конформаций.

Цена в свободной энергии для того чтобы выправить вне молекулу от конформации B к A, в виду того что уменьшено число доступных родственных конформаций. Эта разница в свободной энергии переводит к усилию которое сопротивляет выправлять, и действует как entropic «весна». Это в отличие от ситуации на макроскопическом маштабе, где вытягивать гибкую строку не требует значительно усилия до тех пор пока оно не будет прям и фактический костяк протягиван.

Когда длинние молекулы вытягиваны, необходимо, что удлиняет усилие молекулу к прямой конформации даже если не протягиваются скрепления в костяке.

Entropic Упругость

2 основных модели обыкновенно использованы для этой entropic упругости, зависящ ли некоторая цепная жесткость включенна. В свободно соединенной цепочечной модели (FJC), костяк моделирован как малые блоки соединенные вполне «свободными» соединениями, так, что смежные блоки смогут иметь любой угол между ими без экстренной стоимости энергии. Глист-как цепочечная модель (WLC), в контрасте, бесконечная нить при цепная жесткость построенная внутри, и более лучшая модель для молекул как, котор двойн-сели на мель ДНА. Длина персистирования определена, которая представляет длину цепи над которой начальная ориентация хаотизирована.

Если кривый усили-выдвижения собрана, то она может быть приспособлена одной из этих моделей для того чтобы получить длину будучи протягиванной молекулы, и длиной персистирования для модели WLC.

Некоторые специализированные молекулы, как протеины, нормально имеют определенную (сложенную) трехмерную структуру в разрешении. Эта структура ключ к их биологической функции как энзимы или структурные блоки, например. Цепь полипептида нет relaxed свободной катушки, а сложена в гораздо жестке структуру и придержана совместно много скреплений. Если протеин раскрын, усилием, химикат или восходящий поток теплого воздуха изменяет, то свободная цепь полипептида поступает как простая молекула с прямой цепью. Entropic протягивать можно увидеть, по мере того как скрепления вдоль костяка полипептида сильно гибки. Определенные части структуры протеина, как альфа-винтовые линии или шаровидные домены, можно раскрыть последовательно, и измеренная «свободная» длина молекулы основанной на протягивая кривых увеличит с каждой развёрткой случая. Развёртка шагов протеина обеспечивает информацию о структуре сложенной нормальным и своих механизмах отказа.

Xanthan - Простой Молекулярный Протягивать

Xanthan бактериальный полисахарид, с молекулярным костяком идентичным к целлюлозе. Химические свойства бортовых групп дают полимеру много промышленных применений, от стабилизации еды к спасению масла.

Когда молекула Xanthan протягивана между подсказкой и поверхностью, короткие бортовые группы не имеют значительно влияние на эластичных свойствах, и поведение подобно к одиночной (carboxymethylated) цепи целлюлозы. Высокомолекулярные полимеры xanthan веса могут иметь длины нескольких микронов, и протягивая кривые можно использовать как пример для простого молекулярного выдвижения. Для низких усилий, цепь протягивана против entropic весны. На некоторый этап, как сквозная длина причаливает длине контура, упругость упругости костяка будет важной.

На Диаграмму 3 показано кривый втягивать одиночной молекулы Xanthan будучи протягиванной (в буфферном разрешении проблемы фосфата) используя NanoWizard® AFM. Консольное отклонение было откалибрировано используя термальный метод шума.

Для сравнения с моделями, расстояние подсказк-образца необходимо также исправиться для отклонения cantilever для того чтобы получить реальное значение разъединения, которое показано здесь. Более большое отрицательное усилие соответствует к будучи отклонятьнным подсказке больше к поверхности, и следовательно более высокому extensional усилию на молекуле.

Диаграмма 3.

Кривый от выдвинутой модели FJC также показана в Диаграмме 3 для сравнения, высчитанной используя длину Kuhn 6 nm и длину контура 1,25 микронов. Пригонка для простой модели FJC или WLC была разумна для малых extensional усилий (под вокруг 50pN в этот случай), но кривые разшли на более высокие усилия. Следовательно выдвинутая модель FJC с дополнительной упругостью этапа была использована, для того чтобы принять учет костяка протягивая на более высоких extensional усилиях.

В случае Xanthan, протягивано одиночное длиннее соединение между подсказкой и поверхностью. В Виду Того Что молекула настолько длиння, усилие, котор нужно удлинить его очень мало для много из протягивая кривого, и поведение преобладано высок-усилием протягивая где протягиванная длина около длины контура. Для больше молекул сложенных комплексом, как протеины, серия этих протягивая случаев вообще увидена по мере того как различные части структуры раскрывают и продленны.

Bacteriorhodopsin - Извлечение и Развёртка

Bacteriorhodopsin объединенный протеин мембраны от бактериальных клеток, который производит энергию для клеток от светлых фотонов. 7 альфа-винтовых линий transmembrane, с больше дезорганизованных петель пептида между ими.

Когда схвачен один конец протеина и вытягивано, тогда альфа-винтовые линии вытягиваны из мембраны, и они раскрывают по мере того как они вытягиваны вне.

Пурпуровая мембрана естественный источник для bacteriorhodopsin, и состоит из липидов 25% и bacteriorhodopsin 75%. Протеин аранжирован как тримеры в габаритной кристаллической структуре 2, которая может быть imaged используя AFM, как показано в Диаграмме 4 (учтивость образца D.J. Müller, TechnicalUniversityDresdenGermany

Диаграмма 4.

Схематическая диаграмма развёртки процесса показана в Диаграмме 5. 7 альфа-винтовых линий показаны в части A, при подсказка AFM выбирая вверх один конец (примечание которое в фактический протеин, альфа-винтовым линиям собирают совместно в пачку, не линию). Много возможная развёртка тропа, но самые правоподобные случаи что alphahelices вытягиваны вне в парах. Прогрессирование 3 частично раскрынных положений показано в части B Диаграммы 5, с парами альфа-винтовых линий раскрывая по мере того как они извлечены от мембраны.

Диаграмма 5.

На Диаграмму 6 показано суперпозицию развёртки кривых bacteriorhodopsin 10, при усилие прокладывать курс против исправленного разъединения подсказк-образца. Некоторое прилипание по мере того как подсказка выходит поверхность, следовать главный протягивать 3 и случаи раскрывать, соответствие к 3 положениям показанным в Диаграмме 5 B. Главным образом пики вокруг 20-30nm, 40-50nm и 60-80nm, которые соглашаются хорошо при значения опубликованные в литературе. Cantilever был откалибрирован используя термальный метод шума, и эксперименты унесенные под буфером (10mM TRIS, KCl 150mM, пэ-аш 7,6).

Точное положение скрепленных случаев отказа меняет от кривого к кривому, которая типична для скреплений с энергией близко к тепловой энергии на комнатной температуре. Протягивая части кривых overlay в Диаграмме 6, показывая что такие же структуры протягиваются в каждом случае. Только фактический момент когда протягиванный пролом скреплений поменяет от кривого к кривому. Для скрепления с энергией около тепловой энергии, некоторая вероятность ее терпя неудачу в пределах некоторого времени, даже без прикладного усилия. Это соответствует к нормальному «-тарифу» увиденному для binding реакции свободно в разрешении. Для скреплений с энергиями немногая над тепловой энергией, которые нормально стабилизированы, вероятность их терпя неудачу самопроизвольно увеличивает по мере того как усилие прикладной.

Диаграмма 6.

Один путь думать протягивая случая, поэтому, что скрепления напряжены до тех пор пока энергетический барьер к раскрывать не будет внутри термальный ряд. Фактический момент когда скрепления внезапно терпят неудачу быть в зависимости от случайная термальная зыбкость, которая принимает молекулу над развёрткой энергетического барьера. Зависимость времени значит что измеренный тариф раскрывать будет быть в зависимости от тариф нагрузки, или скорость с которой подсказка вытягивает наружный конец молекулы.

Диаграмма 7.

Много развёртка кривых bacteriorhodopsin можно собрать для того чтобы дать статистически взгляд развёртки случаев. Молекула может раскрыть в нескольких путей, поэтому некоторый выбор должен быть сделан в кривых усилия для того чтобы выбрать определенную подсовокупность. В этот случай, только были выбраны кривые показывая 3 главным образом протягивая случая, как примеры в Диаграмме 6. В Диаграмме 7 гистограмма, показывая распределение разъединения подсказк-образца для 3 пиков (данных для n = 355 кривых). Анализ кривого усилия частично был унесен используя ПО PUNIAS.

Диаграмма 8.

На Диаграмму 8 показано график scatter развёртки усилия против положения случая для такого же набора данных как в Диаграмме 7. Усилие для первой развёртки случая (Пик 1) значительно более высоок чем для последующих случаев (Пиков 2 и 3). Как Только структура протеина была нарушена, тогда уменьшено усилие необходимо, что вытянуло остальные альфа-винтовые линии из мембраны. Развёртка кривых также показывает различные тропа для молекулы для того чтобы раскрыть и вытянуть из мембраны. От знания длин цепи структуры и аминокислоты протеина, extensional кривые можно приспосабливать для того чтобы показать ясно которую развёртку путя принимает в определенную кривый усилия.

Развёртка Titin

Titin протеин от ткани мышцы, которая состоит из нескольких повторенных шаровидных доменов. Внутри ткань мышцы оно ответствен для механически свойств на макроскопическом маштабе. AFM позволяет изучению nanomechanical свойств индивидуальных молекул titin. По Мере Того Как молекула протягивана, на некоторый этап скрепления держа определенный домен совместно потерпят неудачу. Этот определенный шаровидный домен после этого раскрывает, водящ к более длинней длине контура для молекулы. С более далее вытягивать, этот раздел линейных аминокислот также протягиван, и один из других доменов достигнет свой пункт отказа. Это проиллюстрировано схематически в Диаграмме 9.

Диаграмма 9.

По Мере Того Как протеин вытягиван, домены «хлопают» раскрывают последовательно, водящ к характерной последовательности пиков в кривых прогиба. Форма каждой последовательной изогнутой части графика усилия отражает увеличенную действительную длину молекулы по мере того как домены раскрыны.

Типичная спектроскопия усилия выдвижения titin втягивает кривый показана в Диаграмме 10 (учтивость данных Matthias Amrein, Университета Калгари, Канады, полученных используя NanoWizard® AFM на одиночном протеине мышцы titin Ig8). Характерную последовательность titin развёртки случаев можно ясно увидеть. Увеличения усилия устойчиво, как напряжение в молекуле увеличивают. Внезапно усилие уменьшает остро по мере того как шипучки домена Ig раскрывают и напряжение выпущено. Кривый каждой удлиняя зоны можно приспосабливать с моделью FJC или WLC для соответствуя длины свободной аминокислоты. Размер развёртки усилия для одиночного домена в границах 190-250pN, и длина контура одного домена (размах расстояния) 28nm.

Диаграмма 10.).

Применения

Большое разнообразие протеинов можно протянуть и раскрыть используя AFM. 2 примера были показаны здесь, один протеин мембраны и один цитоплазменный протеин. Этот метод можно расширить к другим протеинам, к данным по увеличения как о нормальной структуре протеина, так и о своих классификациях аварий и повреждений. В случае bacteriorhodopsin, протеин формирует очень сильно упакованные структуры в бактериальной клеточной оболочке, и поэтому один из немногих протеинов мембраны которые можно выкристаллизовывать для определения высок-разрешения структурного.

Этот метод может быть более вообще прикладной, однако. Для большинств протеинов мембраны, последовательность аминокислоты гораздо легке для того чтобы определить чем сложенная структура, в виду того что большинств протеины мембраны не соответствующи для кристаллизации.

Развёртку случаев измеренных с AFM, которые показывают изменение в длине аминокислоты по мере того как различные структурные блоки раскрывают, можно использовать с известной последовательностью для того чтобы интерпретировать третичная структура протеинов мембраны. Специфическое покрытие зонда, и изменение протеина для того чтобы иметь специфические пункты «приемистости» могут вести к вытягивать протеин на различных положениях, и следовательно более подробная информация о как структурные блоки соединены совместно в 3-D структуре.

Таким Образом AFM могл дать проницательность в конфигурацию одиночной молекулы и позволить независимое измерение молекулярных свойств уточнить молекулярные моделируя методы. AFM можно также совместить с одиночными методами флуоресцирования молекулы как TIRF или ЛАД.

Источник: Аппаратуры JPK

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Аппаратуры JPK

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:23

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit