Strukturell Utredning av SingelBiomolecules och Molekylära Sträckande Användande Atom- StyrkaMikroskopTekniker från JPK Instrumenterar

Täckte Ämnen

Bakgrund

Molekylära Sträckande Experiment

Kännetecken av Macromolecules i Lösning

Entropic Spänst

Xanthan - Enkel Molekylär Sträckning

Bacteriorhodopsin - Extraktion och Uppveckling

Titin Uppveckling

Applikationer

Bakgrund

NMR spektroskopin och Röntgar crystallography är de mest allmänningteknikerna som är kapabla av att bestämma, strukturerar för närvarande av lika proteiner för biologiska macromolecules, och nucleic syror på ett atom- jämnar av upplösning. Det atom- styrkamikroskopet (AFM) är mestadels bekant för dess avbilda kapaciteter, men det är ett mycket känsligt bearbetar också för quantitatively att mäta styrkor på en jämn singelmolekyl.

Denna kapacitet låter bruket av AFM som en alternativ teknik för utredningen av den strukturella konfigurationen av macromolecules under inföding villkorar. När du Mäter styrkor inom och mellan singelmolekylar ger another att närma sig till överenskommelsen av molekylär energi landskap och kemisk reaktionskinetics. AFMEN kan mäta individförbindelser som bildar och bryter, ganska än begränsas till statistiska genomsnitt över en befolkning.

Denna rapport koncentrerar på bruket av AFMEN att behandla singelmolekylar till information om extraktet om det molekylärt strukturerar eller gestaltningen och intramolecular bindande styrkor. Det är också möjligheten till fenomen för studietidanhörigen, liksom intramolecular dynamik i macromolecules, molekylär erkännande eller proteinvikning i situ.

Molekylära Sträckande Experiment

Styrkaspektroskopin är ett AFM-funktionsläge var spetsen är rörd ovanför en singel pekar upp och ner på ytbehandla, fördriver avböjningen eller annan cantileverrekvisita mätas. Detta ger en profilera av styrkorna på olika höjder ovanför ytbehandla.

I molekylära sträckande experiment kommas med spetsen vanligt in i kontakt med ytbehandla, är molekylarna på substraten tillåtna att påverka varandra med spetsen, och därefter är cantileveren tillbakadragen. Denna rörelse visas schematically i avbildaserien Figurerar in 1 - in mot ta prov (att närma sig) och därefter bort igen (tillbakadragningen). Som cantileveren är rörd i väg från ytbehandla, reflekterar avböjningen styrkorna mellan spetsen och ytbehandla. Om en singelmolekyl rymms mellan spetsen och ytbehandla, då ger avböjningen av cantileveren en mäta av styrkan som utövas på molekylen.

I det schematiska diagrammet Figurera in 1, visas en singelmolekyl sträckning mellan spetsen och substraten. Molekylen kan ha ett definierat tredimensionellt vikt för att strukturera, som för proteiner, till exempel, eller det kan vara ett oordnat kedjar, liksom många andra långa polymrer. Adhesive växelverkan mellan spetsen och molekylen äger rum vanligt i den motbjudande kontaktdelen av styrkan buktar, men särdragen av intresserar för den molekylära sträckningen finnas i tillbakadragningen buktar.

Figurera 1.

Kedja Long molekylar, liksom DNA, eller dextran, kan sträckas mellan spetsen och ta prov. Styvheten och ståndaktighetlängden kan ses från den initiala sträckningen av molekylen. Inre molekylära övergångar kan också vara utstuderade, liksom den smältande övergången i DNA, som ryggraden organiserar om under högre spänning. Molekylar med dimensionellt komplex 3 strukturerar, liksom många proteiner, kan vecklas upp i som långt kontrolleras, så att de strukturella enheterna kan utforskas. Titin och bacteriorhodopsinen är exempel av proteiner som har varit intensivt utstuderade. Membranproteiner kan dras ut ur membranet, och ”poppa” ut ur individalfabetisk-spiraler har setts.

Kännetecken av Macromolecules i Lösning

Långa molekylar i lösning är sällan stång-något liknande eller lik och har ofta en kickböjlighet längs ryggraden av molekylen. Dubblera Även strandsatt DNA, som tänks vanligt av, som ”en styv” molekyl på grund av dubblett-spiralen strukturerar, är ordnat som en slumpmässig tova för längddet okända några hundra nanometers. Detta mätte hjälpmedlet, att det finns en stor skillnad mellan längden av molekylen, längs kedja eller ryggraden (dra upp konturernaa avlängden) och de typiska dimensionerar den upptar i lösningen (e.g radien av gyration eller denavsluta längden), som är mycket mindre.

Figurera 2.

Ordningen föreställs schematically i Figurerar 2. I del A, visas en lång molekyl i en fördjupad gestaltning. I del B, visas en olik gestaltning var molekylen är i en avkopplad slumpmässig tova, som upptar en mycket mindre lateral dimensionerar än dra upp konturernaa avlängden. Det finns många mer gestaltningar som är liknande till den som visas i B som är tillgängligt till molekylen än gestaltningar som är liknande till den som visas i A, och detta blytak till skillnaden i entropi eller fri energi av de olika gestaltningarna.

Det finns en kosta i fri energi som ut rätar ut en molekyl från gestaltning B till A, sedan numrera av tillgängliga släkta gestaltningar förminskas. Denna skillnad för fri energi översätter till en styrka, som motstår uträtningen, och agerar något liknande som ett entropic ”fjädrar”. Detta är i kontrast med läget på ett macroscopic fjäll, var dra ett böjligt, stränger kräver inte en viktig styrka, tills den är rak, och den faktiska ryggraden sträcks.

När långa molekylar dras, krävs en styrka för att fördjupa molekylen in mot en rak gestaltning, om även förbindelserna i ryggraden inte sträcks.

Entropic Spänst

Grundläggande Två modellerar används gemensamt för denna entropic spänst, beroende några kedjar huruvida styvhet är inklusive. I som fogas ihop fritt, kedja (FJC) modellerar, ryggraden modelleras som lilla enheter förbindelse av fullständigt ”fritt” fogar ihop, så att närgränsande enheter kan ha några att meta utan extra energi kostar dem emellan. Avmaska-något liknande kedjar (WLC) modellerar, i kontrast, är en fortlöpande glödtråd med kedjar styvhet som in byggs och är ett bättre modellerar för molekylar liksom dubblett-strandad DNA. En ståndaktighetlängd definieras, som föreställer längden av kedja, som den initiala riktningen randomiseds över.

Om enf8orlängning buktar samlas, då den kan vara inpassad vid en av dessa modellerar för att erhålla längden av molekylen som sträcks, och ståndaktighetlängden för WLCEN modellerar.

Några specialiserade molekylar, liksom proteiner, har normalt ett definierat (vikt) tredimensionellt strukturerar i lösning. Detta strukturerar är det nyckel- till deras biologiskt fungerar som enzym eller strukturella enheter, till exempel. Polypeptiden kedjar är inte en avkopplad lös spole, utan viks in i ett mycket mer styv strukturerar och rymde tillsammans vid många förbindelser. Om proteinet vecklas upp, av styrka som är kemisk eller thermaländringar, då kedjar den fria polypeptiden uppför något liknande en enkel linjär molekyl. Den entropic sträckningen kan ses, som förbindelserna längs polypeptideryggraden är högt böjliga. Definierade delar av proteinet strukturerar, liksom alfabetisk-spiraler eller klotformiga områden, kan vecklas upp i sekvens, och den mätte ”fria” längden av molekylen som baseras på sträckningen, buktar ska förhöjning med varje uppvecklingshändelse. Proteinuppvecklingen kliver ger information om den vikta det normala strukturerar och dess felmekanism.

Xanthan - Enkel Molekylär Sträckning

Xanthan är en bakterie- polysaccharide, med en molekylär ryggrad som är identisk till cellulosa. Den kemiska rekvisitan av sidogrupperna ger polymern många industriella applikationer, från matstabilisering till den olje- återställningen.

När Xanthanmolekylen sträcks mellan spetsen och ytbehandla, har de kort sidogrupperna inte ett viktigt att verkställa på resårrekvisitan, och uppförandet är liknande till en cellulosa (för carboxymethylated) singel kedjar. Molekylär Kick - väga xanthanpolymrer kan ha längder av flera mikroner, och sträckningen buktar kan användas som ett exempel för enkel molekylär f8orlängning. För låga styrkor sträcks kedja mot det entropic fjädrar. På något peka, som denavsluta längden att närma sig dra upp konturernaa avlängden, spänsten av ryggradspänsten blir viktigt.

Figurera 3 shows som tillbakadragningen buktar av en singelXanthanmolekyl som sträcks (i en phosphate fungera som buffert lösningen) genom att använda NanoWizard®en AFM. Cantileveravböjningen har kalibrerats genom att använda thermalen stojar metod.

För jämförelse med modellerar, spets-ta prov distanserar måste också korrigeras för avböjningen av cantileveren för att erhålla ett verkligt avskiljande värderar, som visas här. En större negationstyrka motsvarar till spetsen som avböjs mer in mot ytbehandla och hence en högre extensional styrka på molekylen.

Figurera 3.

En bukta från den fördjupade FJCEN modellerar visas också in Figurerar 3 för jämförelse, beräknat genom att använda en Kuhn längd av 6 nm och en dra upp konturernaa avlängd av 1,25 mikroner. Passformen för den enkla FJCEN eller WLC modellerar var rimliga för lilla extensional styrkor (som är nedanföra runt om 50pN i detta fall), men buktar avvikit på högre styrkor. Hence modellerar de fördjupade FJCNA med det extra segmenterar spänst användes, för att ta kontot av ryggraden som sträcker på högre extensional styrkor.

I fallet av Xanthan, anknyter en singel long mellan spetsen och ytbehandla sträcks. Sedan molekylen är så lång, är styrkan som fördjupa den, mycket liten för mycket av sträckningen buktar, och uppförandet domineras av hög-styrkan som sträcker var den sträckta längden är nära dra upp konturernaa avlängden. För mer komplex vikta molekylar liksom proteiner ses en serie av dessa sträckande händelser allmänt, som olika delar av strukturera veckla upp och är fördjupade.

Bacteriorhodopsin - Extraktion och Uppveckling

Bacteriorhodopsin är ett integralmembranprotein från bakterie- celler, som frambringar energi för cellerna från ljusa fotoner. Det finns 7 transmembranealfabetisk-spiraler, med mer disorganized peptide kretsar dem emellan.

När man avslutar av proteinet, fattas och dras, då dras alfabetisk-spiralerna ut ur membranet, och de veckla upp, som de dras ut.

Det Purpurfärgade membranet är den naturliga källan för bacteriorhodopsin och består av 25% lipids och 75% bacteriorhodopsin. Proteinet är ordnat, som trimers i en dimensionell kristall 2 strukturerar, som kan avbildas genom att använda AFMEN, som visat in Figurerar 4 (ta prov artighet av D.J. Müller, TechnicalUniversityDresdenGermany

Figurera 4.

Ett schematiskt diagram av den processaa uppvecklingen visas in Figurerar 5. De sju alfabetisk-spiralerna visas i del A, med AFM-spetsplockningen upp en avslutar (notera det i det faktiska proteinet, alfabetisk-spiralerna grupperas tillsammans i en packe, inte en fodra). Det finns många möjlighetuppvecklingsbanor, men de mest rimliga händelserna är att alphahelicesna dras ut parvis. En fortgång av tre delvist uppvecklad påstår visas i del B av Figure 5, med parar av alfabetisk-spiraler som veckla upp, som de dras ut från membranet.

Figurera 5.

Figurera 6 shows som en superposition av uppveckling för bacteriorhodopsin 10 buktar, med styrkan som konspireras mot korrigerad, spets-tar prov avskiljande. Det finns någon adhesion, som spetsen lämnar ytbehandla som följs av huvudsaklig sträckning tre, och uppvecklingshändelser som motsvarar till trena, påstår visat in Figurerar 5 B. Det huvudsakligt nå en höjdpunkt är runt om 20-30nm, 40-50nm, och 60-80nm, som instämma väl med, värderar publicerat i litteraturen. Cantileveren kalibrerades genom att använda thermalen stojar metod, och experimenten som ut bärs under, fungera som buffert (10mM TRIS, 150mM KCl, pH 7,6).

Avkräva placerar av förbindelsefelhändelserna varierar från buktar för att bukta, som är typisk för förbindelser med termisk energi för energi nästan på rumstemperaturen. De sträckande delarna av buktar överdrar Figurerar in 6, visning att samma strukturerar sträcks i varje fall. Endast buktar det faktiska ögonblicket, när det sträckta förbindelseavbrottet varierar från, för att bukta. För en förbindelse med energi nära den termiska energin finns det någon probability av den som missar inom en bestämd tid, även med ingen applicerad styrka. Detta motsvarar till det normala ”av-klassar” sett för den bindande reaktionen fritt i lösning. För förbindelser med energier a lite ovanför den termiska energin som är normalt stabila, probabilityen av dem som spontaneously missar förhöjningar, som en styrka appliceras.

Figurera 6.

En långt till funderare av en sträckande händelse, är därför att förbindelserna ansträngas, tills energibarriären till uppveckling är inom thermalen spänner. Det faktiska ögonblicket, när förbindelserna missar plötsligt, beror på en slumpmässig termisk växling, som tar molekylen över uppvecklingsenergibarriären. Tidberoendehjälpmedlet, som den mätte uppvecklingen klassar ska, beror på ladda klassar, eller rusa, som spetsen drar med det fritt, avslutar av molekylen.

Figurera 7.

Många uppveckling buktar av bacteriorhodopsin kan samlas för att ge ett statistiskt beskådar av uppvecklingshändelserna. Molekylen kan veckla upp i flera väg, så något val måste att göras i styrkan buktar för att välja en särskild underdel. I detta fall buktar endast visning de tre huvudsakliga sträckande händelserna, liksom exemplen Figurerar in 6, var utvalt. I Figurera 7 som ett histogram framläggas, visning denta prov avskiljandefördelningen för trena nå en höjdpunkt (data för n = 355 buktar). Styrkan buktar analys bars delvist ut genom att använda PUNIAS-programvaran.

Figurera 8.

Figurera 8 shows en scattertäppa av uppvecklingsstyrkan kontra placera av händelsen för den samma datamängden som Figurerar in 7. Styrkan för den första uppvecklingshändelsen (Nå en höjdpunkt 1), är markant högre än för de följande händelserna (Nå en höjdpunkt 2 och 3). När proteinet strukturerar har avbrutits, då styrkan som krävs till handtag de resterande alfabetisk-spiralerna ut ur membranet, förminskas. Uppvecklingen buktar också olika banor för showen för molekylen för att veckla upp och handtag ut ur membranet. Från en kunskap av proteinet strukturera, och amino syra kedjar längder, det extensional buktar kan vara inpassad att visa att klart vilken uppvecklingsbana tas i en särskild styrka bukta.

Titin Uppveckling

Titin är ett protein från muskelsilkespappret, som består av flera upprepade klotformiga områden. Inom muskelsilkespappret är det ansvariga för den mekaniska rekvisitan på ett macroscopic fjäll. AFMEN låter studien av den nanomechanical rekvisitan av individtitinmolekylar. På något peka förbindelseinnehav en särskild ska kuggning för område tillsammans, Som molekylen sträcks. Detta särskilda klotformiga område veckla upp därefter och att leda till ett längre drar upp konturernaa av längden för molekylen. Med vidare att dra delar upp detta av linjära amino syror sträcks också, och en av den annan områden ska räckvidden som dess fel pekar. Detta illustreras schematically i Figurerar 9.

Figurera 9.

Som proteinet dras, ”poppar” områdena öppnar i sekvens och att leda till ett kännetecken ordnar av nå en höjdpunkt i avböjningen buktar. Forma av varje på varandra följande krökt del av styrkatäppan reflekterar den ökande effektiva längden av molekylen, som områdena vecklas upp.

En typisk spektroskopi för titinf8orlängningsstyrka drar tillbaka buktar visas in Figurerar 10 (dataartighet av Matthias Amrein, Universitetar av Calgary, Kanada, erhållande genom att använda NanoWizard®en AFM på för titinmuskel för singel Ig8 ett protein). Den karakteristiska titinen ordnar av uppvecklingshändelser kan klart ses. Styrkaförhöjningarna stadigt, som spänningen i molekylförhöjningarna. Plötsligt är styrkaminskningarna skarpt, som pop för ett Ig område öppnar och spänningen utsläppt. Bukta av varje fördjupande region kan vara inpassad med FJCEN, eller WLC modellerar för den motsvarande fria amino syrliga längden. Storleksanpassa av uppvecklingsstyrkan för ett singelområde är i spänna av 190-250pN, och dra upp konturernaa avlängden av ett maximal-till-maximalt område (distansera), är 28nm.

Figurera 10. av).

Applikationer

En bred variation av proteiner kan sträckas och vecklas upp genom att använda AFMEN. Två exempel har visats här, ett membranprotein och ett cytoplasmic protein. Denna metod kan fördjupas till andra proteiner, till information om affärsvinst om båda strukturerar det normalaproteinet och dess felfunktionslägen. I fallet av bacteriorhodopsinen bildar proteinet mycket högt packat strukturerar i den bakterie- cellväggen och så är ett av de få membranproteinerna som kan kristalliseras för strukturell beslutsamhet med hög upplösning.

Denna metod kan allmänare appliceras, emellertid. För mest membranproteiner ordnar den amino syran är mycket lättare att bestämma, än vikta strukturerar, sedan mest membranproteiner inte är passande för kristallisering.

Uppvecklingshändelser som mätas med AFMEN, som visar ändringen i amino syrlig längd, som olika strukturella enheter veckla upp, kan användas med det bekant ordnar för att tolka det tertiary strukturerar av membranproteiner. Specifikt täcka av sonden och ändring av proteinet som har den specifika ”varubilen” pekar kan leda till att dra proteinet på olika lägen, och hence strukturerar ytterligare information om, hur de strukturella enheterna förbinds tillsammans i det 3-D.

Således är AFM kompetent att ge inblick in i konfigurationen av en singelmolekyl och att låta en oberoende mätning av molekylär rekvisita raffinera molekylära modellera tekniker. AFM kan också kombineras med tekniker för singelmolekylfluorescence liksom TIRF eller GRINIGHET.

Källa: JPK Instrumenterar

För mer information på denna källa behaga besök JPK Instrumenterar

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:32

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit