NMR-spektroskopi och röntgenkristallografi är idag den vanligaste tekniken som kan bestämma det strukturer av biologiska makromolekyler som proteiner och nukleinsyror på en atomär nivå på upplösning. Den atomkraftsmikroskop (AFM) är mest känd för sin avbildning kapacitet, men det är också ett mycket känsligt verktyg för att kvantitativt mäta krafter på en enda molekyl nivå. Denna funktion gör det möjligt att använda AFM som ett alternativ teknik för undersökning av den strukturella konfiguration av makromolekyler i inhemska förhållanden. Mätning av krafter inom och mellan enskilda molekyler ger en annan inställning till förståelse av molekylära energi landskap och kemisk kinetik reaktion. AFM kan mäta enskilda obligationer formning och bryta, snarare än att vara begränsad till statistiska medelvärden över en befolkning. Denna rapport koncentrerar sig på användningen av AFM att manipulera enskilda molekyler för att extrahera information om den molekylära strukturen och exteriör, och intramolekylära bindande krafter. Det är också möjligt att studera tidsberoende fenomen, såsom intramolekylära dynamiken i makromolekyler, molekylär igenkänning eller protein folding på plats. Molekylär Stretching Experiment Force spektroskopi är en AFM läge där spetsen flyttas upp och ner över en enda punkt på ytan, medan böjningen eller andra egenskaper cantilever mäts. Detta ger en profil av de krafter på olika höjd över ytan. I molekylär stretching experiment, är toppen oftast kommer i kontakt med ytan, är de molekyler på underlaget får interagera med spets och sedan cantilever är indragen. Denna rörelse visas schematiskt i bilden serien i figur 1 - mot urvalet (tillvägagångssättet) och sedan iväg igen (tillbaka). Eftersom den fribärande flyttas bort från ytan, reflekterar nedböjningen krafterna mellan spetsen och ytan. Om en enda molekyl hålls mellan spetsen och ytan, då riktningen på de fribärande ger ett mått på den kraft som verkar på molekylen. I den schematiska bilden i figur 1, är en enda molekyl visar att sträckas mellan spetsen och ytan. Molekylen kan ha en definierad tredimensionell vikas struktur, som för proteiner, till exempel, eller det kan vara en oordnad kedja, som många andra långa polymerer. Limmet samspelet mellan spetsen och molekylen sker oftast i den motbjudande kontakt delen av kraftkurva men de funktioner av intresse för de molekylära stretching finns i dra kurvan.  Figur 1. Schematisk bild av en kraft spektroskopi experiment där AFM spets används för att sträcka en enda molekyl Lång kedja molekyler, såsom DNA eller dextran, kan sträckas mellan spetsen och provet. Styvhet och uthållighet längd kan ses från den ursprungliga sträckning av molekylen. Intern molekylära övergångar kan också studeras, som den smältande övergången i DNA som ryggraden ordnar under högre spänning. Molekyler med komplexa 3-dimensionella struktur, såsom många proteiner, kan fällas ut på ett kontrollerat sätt så att de strukturella enheter kan undersökas. Titin och bacteriorhodopsin är exempel på proteiner som har intensivt studerat. Membranproteiner kan dras ut från membranet, och "poppar" ut av enskilda alfa-helixar har sett. Kännetecken för makromolekyler i lösning Långa molekyler i lösning är sällan stavformad eller stel, och har ofta en hög flexibilitet längs ryggraden av molekylen. Även dubbelsträngat DNA, som vanligtvis är tänkt som en "hård" molekyl på grund av dubbel-helix struktur, arrangeras som en slumpmässig härva för längder än några hundra nanometer. Detta innebär att det finns en stor skillnad mellan längd av molekylen mätt längs kedjan eller ryggraden (konturen längd) och den typiska dimensioner den upptar i lösning (t.ex. tröghetsradie eller end-to-end längd), vilket är mycket mindre.  Figur 2. Skiss av två möjliga konformationer av en lång molekyl. I A molekylen utsträckta i en osannolik exteriör för en molekyl i lösning. B visar ett mer typiskt konformation, där molekylen är på ett oorganiserat härva. Arrangemanget är representerat schematiskt i figur 2. I del A är en lång molekyl som visas i en utökad konformation. I del B, är en annan konformation visas där molekylen är i en avslappnad slumpmässig härva som upptar en mycket mindre lateral dimension än konturen längd. Det finns många fler konformationer liknar den som visas i B tillgänglig för molekylen än konformationer liknar den som visas i A, och detta leder till skillnaden i entropi eller fria energin av de olika konformationer. Det finns en kostnad i fri energi att räta ut en molekyl från konformation B till A, eftersom antalet tillgängliga relaterade konformationer minskar. Detta fria energin skillnad översättas till en kraft som motstår riktning, och fungerar som en entropiska "våren". Detta står i kontrast till situationen i makroskopisk skala, där drar en flexibel sträng inte kräver en betydande kraft tills det är rakt och själva ryggraden sträcks. När långa molekyler dras, är en kraft som krävs för att förlänga den molekyl mot en rak konformation även om obligationer i ryggraden inte blir sträckt. Entropiska Elasticitet Två grundläggande modeller används ofta för denna entropiska elasticitet, beroende på om någon kedja stelhet ingår. I fritt ledad kedja (FJC) modell, är ryggraden modelleras som små enheter anslutna med helt "gratis" lederna, så att angränsande enheter kan ha någon vinkel mellan dem utan extra energi kostnad. Den maskliknande kedja (WLC) modell, däremot, är en kontinuerlig glödtråd med kedja stelhet inbyggd, och är en bättre modell för molekyler som dubbelsträngat DNA. En uthållighet längd definieras, vilket motsvarar längden på kedjan över som den första riktningen är randomiserad. Om en kraft-extension kurva samlas in, då det kan monteras av en av dessa modeller för att få längden på molekylen att sträckas, och de ihållande längd för WLC modell. Vissa specialiserade molekyler, som proteiner, normalt har en definierad (flertrådigt) tredimensionell struktur i lösning. Denna struktur är nyckeln till deras biologiska funktion som enzymer eller strukturella enheter, till exempel. Den polypeptidkedja är inte en avslappnad lös spole, men är vikt till en betydligt styvare struktur och hålls samman av många obligationer. Om proteinet är ovikta, med våld, kemiska eller termiska förändringar, då den fria polypeptidkedja beter sig som en enkel linjär molekyl. Den entropiska stretching kan ses som de obligationer längs polypeptid ryggraden är mycket flexibla. Definierade delar av proteinet struktur, såsom alfa-helixar eller klotformiga domäner, kan fällas ut sekventiellt, och de uppmätta "fria" längd av molekylen bygger på stretching kurvorna kommer att öka med varje utspelas händelse. Proteinet utvecklas steg ger information om den normala vikt struktur och dess mekanismer misslyckande. Xanthan - Enkel Molekylär Stretching Xanthan är en bakteriell polysackarid med en molekylär ryggrad identiskt med cellulosa. Den kemiska egenskaper sidan grupper som ger polymeren många industriella tillämpningar, från mat stabilisering till oljesanering. När Xanthan molekylen är utsträckt mellan spetsen och ytan, har kortsidan grupperna inte någon signifikant effekt på den elastiska egenskaper och beteende liknar en enda (karboximetylerade) cellulosa kedjan. Hög molekylvikt xantan polymerer kan ha längder på flera mikrometer, och stretching kurvorna kan användas som ett exempel för enkla molekylära förlängning. För låga krafter, är kedjan sträckt mot entropiska våren. Vid något tillfälle, som end-to-end längd närmar konturen längden blir elasticiteten i ryggraden elasticitet viktig. Figur 3 visar tillbaka kurvan en enda Xanthan molekyl som sträckte sig (i en fosfatbuffertlösning) med hjälp av NanoWizard ® AFM. Den cantilever nedböjningen har kalibrerats med hjälp av termiskt brus metoden. För jämförelse med de modeller som ska spets-prov avståndet också korrigeras för riktningen på de fribärande att åstadkomma en verklig separation värde, vilket visas här. En större negativ kraft motsvarar spetsen är avlänkade mer mot ytan, och därmed en högre tensional kraft molekylen.  Figur 3. Force spektroskopi tillbaka kurva av en enda Xanthan molekyl att sträckas. En kurva för den utökade FJC modellen är också visas för jämförelse. En kurva från den utvidgade FJC modellen är också visas i figur 3 för jämförelser, beräknas med en Kuhn längd på 6 nm och en kontur längd av 1,25 mikrometer. Den passar för den enkla FJC eller WLC modell var rimligt för små tensional krafter (under ca 50pN i detta fall), men kurvorna skilde på högre krafter. Därför utökade FJC modell med extra segmentet elasticitet användes, att ta hänsyn till ryggraden stretching vid högre tensional krafter. I fallet Xanthan är en enda lång länk mellan spetsen och ytan sträckte. Eftersom molekylen är så lång, att den kraft utvidga det är mycket liten för mycket av stretching kurvan, och det beteende domineras av den högre kraft som sträcker sig där utsträckta längd är nära konturen längd. För mer vikta komplexa molekyler, som proteiner, är en serie av dessa sträcker händelser i allmänhet ses som olika delar av strukturen utvecklas och utvidgas. Bacteriorhodopsin - Extraktion och Fälla Bacteriorhodopsin är en integrerad membran protein från bakterieceller, som genererar energi för cellerna från ljus fotoner. Det finns 7 transmembrana alfa-helixar, med mer oorganiserad peptid slingor mellan dem. När ena änden av proteinet förstått och drog, då alfa-helixar dras ut av membranet, och de utvecklas som de dras ut. Lila membranet är den naturliga källan för bacteriorhodopsin, och består av 25% lipider och 75% bacteriorhodopsin. Proteinet arrangeras som trimerer i en 2-dimensionell kristallstruktur, vilket kan avbildas med AFM, som visas i Figur 4 (prov med tillstånd av DJ-Müller, Tekniska Universitet , Dresden , Tyskland . Den karakteristiska trimer formen kan ses i bilden. Proteinet kan avbildas med AFM och enskilda proteiner utvalda och drog med spetsen. Spetsen kan beläggas speciellt, och de molekyler ändras för att plocka upp en viss del av strukturen, eller spetsen kan pressas in i ytan för att plocka upp en molekyl icke-specifikt.  Figur 4. AFM höjd bilden av lila membran (cytoplasmisk sidan), tagits med JPK NanoWizard ® i kontakt läge i buffertlösning (170nm x 100 nm, 1nm höjd intervall) En schematisk bild av den pågående processen visas i figur 5. De sju alfa-helixar visas i del A med AFM spets plocka upp den ena änden (observera att i själva protein, alfa-helixar grupperade tillsammans i ett paket, inte en linje). Det finns många möjliga utvecklas vägar, men det mest troliga händelser är att alphahelices dras ut i par. En progression av tre ovikt delvis stater återfinns i del B i figur 5, med par av alfa-helixar utvecklas som de är ur membranet.  Figur 5. Skiss av bacteriorhodopsin utvecklas med hjälp av AFM spets. Ena änden av molekylen är plockas upp av spetsen (A) och alfa-helixar dras ut sekventiellt i par (B). Figur 6 visar en överlagring av 10 bacteriorhodopsin utspelas kurvor, med den kraft plottas mot den korrigerade tip-prov separation. Det finns en viss vidhäftning spetsen lämnar ytan, följt av tre huvudsakliga stretching och händelseutvecklingen, motsvarande de tre staterna som visas i Figur 5 B. De huvudsakliga topparna är runt 20-30nm, 40-50nm och 60-80nm, som håller väl med värden som offentliggjordes i litteraturen. Den cantilever var kalibreras med hjälp av termiskt brus metoden, och de experiment som utförs under buffert (10 mM Tris, 150mm KCl, pH 7,6). Den exakta positionen av händelserna obligationen misslyckandet varierar från kurva till kurva, vilket är typiskt för obligationer med energi nära till värmeenergi vid rumstemperatur. Sträckningen delar av kurvorna overlay i Figur 6, som visar att samma strukturer håller på att sträckas i varje fall. Endast den faktiska tidpunkten då sträcks bindningar bryts varierar från kurva till kurva. För en obligation med energi i närheten av värmeenergi, det finns en viss sannolikhet för att det inte inom en viss tid, även utan tillämpas kraft. Detta motsvarar den normala "off-rate" sett för bindande reaktionen fria i lösning. För obligationer med energier lite ovanför värmeenergi, som normalt är stabila, ökar sannolikheten att de misslyckas spontant som en kraft tillämpas.  Figur 6. Fälla kurvor bacteriorhodopsin dras av lila membran (överlagring av 10 tillbaka kurvor). Ett sätt att tänka på en sträcka händelse, därför att obligationerna är ansträngda tills energin hinder för utspelas ligger inom det termiska området. Den faktiska tidpunkt då obligationerna plötsligt misslyckas beror på en slumpmässig termisk fluktuation, som tar molekylen under den pågående energi barriär. Tiden beroendet innebär att den uppmätta utspelas räntan beror på fisktäthet, eller den hastighet med vilken tips är att dra den fria änden av molekylen.  Figur 7. Histogram av positionen av de tre utspelas topparna (tips prov korrigerat separation) för en uppsättning 355 bacteriorhodopsin utspelas kurvor. Många utspelas kurvor bacteriorhodopsin kan samlas för att ge en statistisk bild av händelseutvecklingen. Molekylen kan utvecklas på flera sätt, så vissa val måste göras i kraft kurvor att välja en viss delmängd. I detta fall var det bara kurvor som visar de tre viktigaste stretching händelser, såsom exemplen i Figur 6, utvalda. I Figur 7 ett histogram presenteras som visar spets-prov separation distribution för de tre toppar (data för n = 355 kurvor). Den kraftkurva analysen delvis utföras med PUNIAS programvara.  Figur 8. Scatter plot av våld mot position (tip-prov korrigerad separation) för den pågående händelser som visas i figur 6. Figur 8 visar ett punktdiagram av den pågående kraft kontra position händelsen för samma dataset som i Figur 7. Den kraft för det första utvecklas händelsen (Peak 1) är betydligt högre än för efterföljande händelser (Peaks 2 och 3). När proteinet strukturen har brutits, då den kraft som krävs för att dra den återstående alfa-helixar av membranet minskar. Den utspelas Kurvorna visar också olika vägar för molekylen att utveckla sig och dra ut på membranet. Från en kunskap om proteiners struktur och aminosyror längder kedjan kan tensional kurvor monteras att tydligt visa vilka utspelas väg tas i en viss kraft kurva. Titin Fälla Titin är ett protein från muskelvävnad, som består av flera upprepade klotformiga domäner. Inom muskelvävnad är ansvarig för de mekaniska egenskaperna på en makroskopisk skala. AFM ger studiet av nanomechanical egenskaper hos enskilda titin molekyler. Eftersom molekylen är utsträckt, någon gång obligationerna hålla en viss domän tillsammans kommer att misslyckas. Denna speciella klotformiga domänen utvecklar sig sedan, vilket leder till en längre kontur längd för molekylen. Med ytterligare drar, är denna del av linjära aminosyror också sträckas, och en av de andra domäner kommer att nå sitt misslyckande punkt. Detta illustreras schematiskt i figur 9.  Figur 9. Skiss av titin stretching, eftersom successiva klotformiga domäner utvecklas. Eftersom proteinet är utdragen, domänerna "pop" öppna jämfört med föregående kvartal, vilket leder till en karakteristisk sekvens toppar i böjningen kurvor. Formen på varje successiv böjda del av den kraft tomten speglar den ökade effektiva längden av molekylen som de domäner är ovikta. En typisk titin förlängning kraft tillbaka spektroskopi kurva visas i Figur 10 (Allt för Matthias Amrein, University of Calgary, Kanada, erhålls med NanoWizard ® AFM på en enda Ig8 titin muskelprotein). Den karakteristiska titin sekvens av händelseutvecklingen syns tydligt. Kraften ökar stadigt, liksom spänningen i molekylen ökar. Plötsligt kraften minskar kraftigt som en Ig domän poppar öppen och spänningen släpper. Kurvan för varje utvidga regionen kan utrustas med FJC eller WLC modell för motsvarande fria aminosyror längd. Storleken på den pågående kraft för en enda domän är i intervallet 190-250pN och konturen längden på en domän (topp-till-topp distans) är 28nm.  Figur 10. Kraftkurva av titin stretching, visar sekventiell utvecklandet av de runda domäner (Allt för Matthias Amrein, Universitet av Calgary ). Applikationer Ett brett utbud av proteiner kan sträckas och ovikta med AFM. Två exempel har visats här, ett membran protein och en cytoplasmiska protein. Denna metod kan utvidgas till andra proteiner, för att få information om både normala proteiners struktur och dess lägen misslyckande. Vid bacteriorhodopsin bildar protein mycket högt packade strukturer i bakteriens cellvägg, och så är en av de få membranproteiner som kan kristalliseras för högupplöst strukturbestämning. Denna metod kan mer generellt tillämpas, dock. För de flesta membranproteiner är aminosyrasekvens mycket lättare att bestämma än vikas struktur, eftersom de flesta membranproteiner är inte lämpliga för kristallisering. Händelseutvecklingen mätt med AFM, som visar förändringen i aminosyran längd som olika strukturella enheter utvecklas, kan användas med den kända sekvensen att tolka tertiärstruktur av membranproteiner. Särskild beläggning av sonden, och modifiering av proteinet att ha speciella "plocka upp" punkter kan leda till att dra i proteinet på olika platser, och därmed ytterligare information om hur de strukturella enheterna är sammankopplade i 3-dimensionella struktur. Således AFM kan ge insikt i konfigurationen av en enda molekyl och låter en oberoende mätning av molekylära egenskaper för att förfina molekylmodellering tekniker. AFM kan också kombineras med enkla tekniker molekyl fluorescens som TIRF eller bandet. |