唯一原生质和分子舒展的结构上的调查使用从 JPK 仪器的基本强制显微镜技术

包括的事宜

背景

分子舒展的实验

大分子的特性在解决方法的

值图线的弹性

黄原胶 - 简单分子舒展

Bacteriorhodopsin - 提取和展开

Titin 展开

应用

背景

核磁共振的分光学和 X-射线结晶学当前是最公用的技术能够确定生物大分子结构象蛋白质和核酸的在解决方法的一个基本级别。 基本强制显微镜 (AFM)为其想象功能主要知道,但是它也是为定量评定强制的一个非常敏感工具在一个唯一分子级别上。

此功能允许使用 AFM 作为大分子的结构上的配置的调查的一个替代技术在当地情况下。 评定在唯一分子之间的强制提供另一个途径给对分子能源横向和化学反应动能学的了解。 AFM 可能评定形成和中断,而不是被限制的各自的债券到在人口的统计平均数。

此报表集中使用 AFM 操作唯一分子提取关于分子结构或相应一致的信息和分子内约束力。 在原处学习非定常现象,例如在大分子、分子识别或者蛋白质折叠的分子内动力也是可能的。

分子舒展的实验

强制分光学是这个技巧在一单点上调高降低在表面的 AFM 模式,而偏折或其他悬臂式属性被评定。 这产生强制的配置文件在表面上的不同的高度。

在分子舒展的实验,这个技巧通常被带领进入与表面的联络,在这个基体的分子允许与这个技巧配合,悬臂然后被缩回。 此移动在图象串联在表 1 概要地显示 - 往这个范例 (途径) 然后再 (缩回)。 当悬臂被移动远离表面,偏折反射在这个技巧和表面之间的强制。 如果一个唯一分子被暂挂在这个技巧和表面之间,则悬臂的偏折产生在这个分子施加的强制的评定。

在简图在表 1,一个唯一分子显示被舒展在这个技巧和这个基体之间。 这个分子可能有一个被定义的三维被折叠的结构,至于为蛋白质,例如或者它愿一个混乱的链子,例如许多其他长的聚合物。 这个技巧和这个分子之间的黏着性交往在强制曲线的排斥的联络零件通常进行,但是功能分子舒展的利益在缩回曲线被找到。

图 1。

长链分子,例如脱氧核糖核酸或葡聚糖,可以被舒展在这个技巧和这个范例之间。 僵硬和持续时间长度能从最初舒展这个分子被看到。 当中坚重新整理在高压下,内部分子转移可能也被学习,例如在脱氧核糖核酸的熔化的转移。 与复杂三维的结构的分子,例如许多蛋白质,可以展开用一个受控方式,以便结构上的部件可以调查。 Titin 和 bacteriorhodopsin 是密集被学习了蛋白质的示例。 膜蛋白质可以被拉出膜,并且 “弹出”在各自的阿尔法螺旋外面被看到了。

大分子的特性在解决方法的

在解决方法的长的分子很少是象标尺或僵硬的和经常有沿这个分子的中坚的一种高灵活性。 双股的脱氧核糖核酸,由于二重螺旋结构,通常被重视作为 “僵硬的”分子,被安排作为长度的任意缠结在几百毫微米之外。 这意味着有沿这个链子被评定的这个分子之间的它在解决方法的长度的一个大区别或中坚 (等高长度) 和典型的维数 (即回旋半径占用或端到端长度),是更小的。

图 2。

排列在表 2. 概要地表示。 在部分 A,一个长的分子在延长的相应一致显示。 在 B 部分,不同的相应一致显示这个分子在比等高长度占用更小的侧向维数的轻松的任意缠结的地方。 比相应一致有许多相应一致类似于在 B 显示的那个可用对这个分子类似于在 A 显示的那个,并且这导致在熵或不同的相应一致的热力势上的区别。

因为减少,有在解决从相应一致 B 的一个分子的热力势的费用对 A 可用的相关相应一致的数量。 此热力势区别转换为抵抗调直的强制,并且操作象一根值图线的 “弹簧”。 与在一宏观等级的情形对比这是,拉一个灵活的字符串不要求重大的强制,直到它是平直的,并且实际中坚被舒展。

当长的分子被拉时,要求强制延伸往平直的相应一致的分子,即使在中坚的债券没有被舒展。

值图线的弹性

二个基本的设计为此值图线的弹性是常用的,取决于若干链僵硬是否是包括的。 在这个自由地被联接的链 (FJC)设计,中坚被塑造作为完全地 “自由”联接连接的小的部件,因此相邻部件可能有在他们之间的所有角度,不用额外的能源费用。 这个卑下的链 (WLC)设计,相反,是与链僵硬的一条持续细丝安装的,并且是分子的一个更好的设计例如双股的脱氧核糖核酸。 持续时间长度被定义,表示链子的长度最初的取向被随机化。

如果强制扩展名曲线收集,则它可以由这些设计之一得到被舒展的这个分子的长度和 WLC 设计的持续时间长度适合。

一些专门化的分子,例如蛋白质,通常有一个被定义的 (被折叠的) 三维结构在解决方法。 例如此结构是这个关键字对他们的生物功能作为酵素或结构上的部件。 多缩氨基酸链子不是轻松的松散卷,然而被折叠到一个更加僵硬的结构并且由许多债券相连。 如果蛋白质由强制展开,化学制品或上升暖流更改,则自由多缩氨基酸链子正常运行象一个简单的线性分子。 因为沿多缩氨基酸中坚的债券是高度灵活的,值图线舒展能被看到。 蛋白质结构的被定义的部分,例如阿尔法螺旋或球状域,可以顺序地展开,并且在舒展的曲线基础上的这个分子的被评定的 “自由”长度将增加与每个展开活动。 蛋白质展开步骤关于这个正常被折叠的结构和其失效机理的情报。

黄原胶 - 简单分子舒展

黄原胶是细菌多聚糖,与分子中坚相同与纤维素。 副组的化工属性产生这个聚合物许多行业应用,从食物安定到油恢复。

当黄原胶分子被舒展在这个技巧和表面之间时,短的副组没有对有弹性属性的重大的作用,并且这个工作情况类似于一个唯一 (carboxymethylated) 纤维素链子。 高分子重黄原胶聚合物可能有几微米的长度,并且舒展的曲线可以使用例如简单的分子扩展名。 对于低强制,这个链子被舒展值图线的弹簧。 有时,当这个端到端长度处理等高长度,中坚弹性的弹性变得重要。

图 3 显示使用 NanoWizard® 被舒展的 (在磷酸盐缓冲液解决方法) 一个唯一黄原胶分子的缩回曲线 AFM。 使用热量噪声方法,悬臂式偏折被校准了。

对与设计的比较,必须为悬臂的偏折也更正技巧范例距离得到一个实际分隔值,显示得这里。 更大的负强制对应于偏转更多的这个技巧往表面并且更强的延伸变形的强制在这个分子。

图 3。

从延长的 FJC 设计的曲线在比较的表 3 也显示,被计算使用 Kuhn 长度的 6 毫微米和 1.25 微米的等高长度。 简单的 FJC 或 WLC 设计的适应为小的延伸变形的强制是合理的 (在 50pN 附近下在这种情况下),但是曲线分流了在更强的强制。 因此与另外的细分市场弹性的延长的 FJC 设计用于,考虑到舒展在更强的延伸变形的强制的中坚。

一旦黄原胶,这个技巧和表面之间的一个唯一长的连结被舒展。 因为这个分子是很长的,延伸它的强制为许多是非常小的舒展的曲线,并且这个工作情况由舒展的高强制控制这个被舒展的长度在等高长度附近的地方。 对于更复杂被折叠的分子,当这个结构的不同的部分展开并且是延长的,例如蛋白质,一系列这些舒展的活动一般被看到。

Bacteriorhodopsin - 提取和展开

Bacteriorhodopsin 是从细菌细胞的集成膜蛋白质,生成细胞的能源从轻的光子。 有 7 个横跨膜阿尔法螺旋,与在他们之间的更多被混乱的肽循环。

当蛋白质的一个末端被掌握和拉时,然后阿尔法螺旋被拉出膜,并且他们展开,当他们被拔出。

紫色膜是 bacteriorhodopsin 的自然来源,并且包括 25% 油脂和 75% bacteriorhodopsin。 蛋白质被安排作为在二维晶体结构的三聚合物,可以是印象的使用 AFM,如图 4 所显示 (D.J. Mullerr, TechnicalUniversityDresdenGermany 范例礼貌

图 4。

展开进程的一张简图在表 5. 显示。 七个阿尔法螺旋在当 AFM 技巧的部分 A 显示,拾起一个末端 (在实际蛋白质,阿尔法螺旋在捆绑一起被编组的附注,不是线路)。 有许多可能的展开路,但是很可能活动是 alphahelices 在对被拔出。 当他们从膜,被提取三个部分地展开的状态级数在图 5 的 B 部分显示与展开对的 的阿尔法螺旋。

图 5。

图 6 显示 10 bacteriorhodopsin 展开曲线的叠置,当强制被密谋被更正的技巧范例分隔。 有若干黏附力,因为这个技巧离开表面,跟随由三主要舒展和展开活动,与在图显示的三个状态相应 5 B. 上。 主要峰顶是在 20-30nm、 40-50nm 和 60-80nm 附近,很好与在这个文件发布的值一致。 悬臂被校准了使用热量噪声方法和实验被执行在缓冲 (10mM TRIS, 150mM 氯化钾,酸碱度 7.6) 下。

政券故障活动的确切的位置从曲线变化到曲线,为与能源的债券是典型的接近热能在室温。 曲线的舒展的部分在表 6 躺在了,向显示同样结构在每个案件被舒展。 仅实际时候,当被舒展的债券中断从曲线变化到曲线时。 对于与能源的一个债券在热能附近,有失效在有些时候内的某个概率它,甚而没有应用的强制。 这对应于为约束回应”任意看到的正常 “比率在解决方法。 对于与能源的债券一点在热能上,通常是稳定的,概率他们本能地发生故障增加,当强制是应用的。

图 6。

一种方式认为一个舒展的活动,因此,是债券紧张,直到对展开的能垒在这个热量范围内。 实际时候,当债券突然发生故障时取决于一个任意热量波动,采取在展开能垒的分子。 时间相依意味着被评定的展开费率将取决于贷款利率,或者这个技巧拉这个分子的自由末端的速度。

图 7。

许多 bacteriorhodopsin 展开曲线可以收集产生展开活动的一个统计观点。 这个分子也许展开用几个方式,因此某个选择在强制曲线必须做选择一个特殊子集。 在这种情况下,显示三个主要舒展的活动,例如示例的仅曲线在表 6,被选择了。 在表 7 存在直方图,显示三个峰顶 (数据的技巧范例分隔配电器为 n = 355 曲线)。 使用 PUNIAS 软件,强制曲线分析部分地被执行了。

图 8。

图 8 在表 7. 显示展开强制的消散剧情与活动的位置数据集的和一样。 第一个展开活动的强制 (峰顶 1) 为随后的活动 (峰顶 2 和 3) 显着高于。 一旦打乱了蛋白质结构,然后从膜里面拉剩余的阿尔法螺旋减少要求的强制。 展开曲线也显示这个分子的不同的路能展开和拉出膜。 从蛋白质结构和氨基酸链长的知识,延伸变形的曲线可以适合明显地显示哪个展开路径在特殊强制曲线上。

Titin 展开

Titin 是从肌肉组织的蛋白质,包括几个被重复的球状域。 在肌肉组织内它对在一宏观等级的机械性能负责。 AFM 允许各自的 titin 分子 nanomechanical 属性的研究。 因为这个分子被舒展,暂挂一个特殊域的债券将一起发生故障。 此特殊球状域然后展开,导致这个分子的一个更长的等高长度。 进一步拉,线性氨基酸的此部分也被舒展,并且其他域之一将到达其故障点。 这在表 9. 概要地说明。

图 9。

当蛋白质被拉,域 “弹出”顺序地开张,导致峰顶一个典型顺序在偏折的弯曲。 当域展开,强制剧情的每个连续的弯曲的部分形状反射这个分子的增加的有效长度。

一个典型的 titin 扩展名强制分光学在表 10 缩回曲线显示 (马赛厄斯 Amrein,卡尔加里,加拿大的大学数据礼貌,获得使用在一个唯一 Ig8 titin 肌肉蛋白的 NanoWizard® AFM)。 展开活动典型 titin 顺序能明显地被看到。 稳步强制增量,当紧张在这个分子增加。 强制急剧突然减少,当 Ig 域打开,并且发行紧张。 每个延伸的区域曲线可以符合对应的游离氨基酸长度的 FJC 或 WLC 设计。 展开强制的范围一个唯一域的是在 190-250pN 范围内,并且一个域 (尖峰对尖峰的距离) 的等高长度是 28nm。

图 10.)。

应用

使用 AFM,各种各样的蛋白质可以被舒展和展开。 二个示例显示了得这里,一膜蛋白质和一细胞质蛋白质。 此方法可以延伸到其他蛋白质,对关于正常蛋白质结构和其失败形式的收益信息。 一旦 bacteriorhodopsin,蛋白质形成在细菌细胞壁的非常高度被包装的结构,和,因此是可以为高分辨率结构上的确定被结晶少数膜蛋白质的之一。

然而此方法可以是一般应用的。 对于多数膜蛋白质,因为多数膜蛋白质不适用于结晶,氨基酸顺序比这个被折叠的结构是容易确定。

展开活动评定与 AFM,显示在氨基酸长度上的变化,当不同的结构上的部件展开,可以用于以这个已知的顺序解释膜蛋白质三级结构。 探测的特定有的蛋白质的涂层和修改特定 “装货”点可能导致拉蛋白质在不同的地点并且详细信息关于结构上的部件如何在这个三维结构一起被连接。

因而 AFM 能给予洞察力到一个唯一分子的配置和允许分子属性的一个独立评定精炼分子塑造的技术。 AFM 可能与唯一分子荧光技术也结合例如 TIRF 或苦恼。

来源: JPK 仪器

关于此来源的更多信息请参观 JPK 仪器

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:34

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