唯一原生質和分子舒展的結構上的調查使用從 JPK 儀器的基本強制顯微鏡技術

包括的事宜

背景

分子舒展的實驗

大分子的特性在解決方法的

值圖線的彈性

黃原膠 - 簡單分子舒展

Bacteriorhodopsin - 提取和展開

Titin 展開

應用

背景

核磁共振的分光學和 X-射線結晶學當前是最公用的技術能够確定生物大分子結構像蛋白質和核酸的在解決方法的一個基本級別。 基本強制顯微鏡 (AFM)為其想像功能主要知道,但是它也是為定量評定強制的一個非常敏感工具在一個唯一分子級別上。

此功能允許使用 AFM 作為大分子的結構上的配置的調查的一個替代技術在當地情況下。 評定在唯一分子之間的強制提供另一個途徑給對分子能源橫向和化學反應動能學的瞭解。 AFM 可能評定形成和中斷,而不是被限制的各自的債券到在人口的統計平均數。

此報表集中使用 AFM 操作唯一分子提取關於分子結構或相應一致的信息和分子內約束力。 在原處學習非定常現象,例如在大分子、分子識別或者蛋白質摺疊的分子內動力也是可能的。

分子舒展的實驗

強制分光學是這個技巧在一單點上調高降低在表面的 AFM 模式,而偏折或其他懸臂式屬性被評定。 這產生強制的配置文件在表面上的不同的高度。

在分子舒展的實驗,這個技巧通常被帶領進入與表面的聯絡,在這個基體的分子允許與這個技巧配合,懸臂然後被縮回。 此移動在圖像串聯在表 1 概要地顯示 - 往這個範例 (途徑) 然後再 (縮回)。 當懸臂被移動遠離表面,偏折反射在這個技巧和表面之間的強制。 如果一個唯一分子被暫掛在這個技巧和表面之間,則懸臂的偏折產生在這個分子施加的強制的評定。

在簡圖在表 1,一個唯一分子顯示被舒展在這個技巧和這個基體之間。 這個分子可能有一個被定義的三維被摺疊的結構,至於為蛋白質,例如或者它願一個混亂的鏈子,例如許多其他長的聚合物。 這個技巧和這個分子之間的黏著性交往在強制曲線的排斥的聯絡零件通常進行,但是功能分子舒展的利益在縮回曲線被找到。

圖 1。

長鏈分子,例如脫氧核糖核酸或葡聚糖,可以被舒展在這個技巧和這個範例之間。 僵硬和持續時間長度能從最初舒展這個分子被看到。 當中堅重新整理在高壓下,內部分子轉移可能也被學習,例如在脫氧核糖核酸的熔化的轉移。 與複雜三維的結構的分子,例如許多蛋白質,可以展開用一個受控方式,以便結構上的部件可以調查。 Titin 和 bacteriorhodopsin 是密集被學習了蛋白質的示例。 膜蛋白質可以被拉出膜,并且 「彈出」在各自的阿爾法螺旋外面被看到了。

大分子的特性在解決方法的

在解決方法的長的分子很少是像標尺或僵硬的和經常有沿這個分子的中堅的一種高靈活性。 雙股的脫氧核糖核酸,由於二重螺旋結構,通常被重視作為 「僵硬的」分子,被安排作為長度的任意纏結在幾百毫微米之外。 這意味著有沿這個鏈子被評定的這個分子之間的它在解決方法的長度的一個大區別或中堅 (等高長度) 和典型的維數 (即回旋半徑佔用或端到端長度),是更小的。

圖 2。

排列在表 2. 概要地表示。 在部分 A,一個長的分子在延長的相應一致顯示。 在 B 部分,不同的相應一致顯示這個分子在比等高長度佔用更小的側向維數的輕鬆的任意纏結的地方。 比相應一致有許多相應一致類似於在 B 顯示的那個可用對這個分子類似於在 A 顯示的那個,并且這導致在熵或不同的相應一致的熱力勢上的區別。

因為減少,有在解決從相應一致 B 的一個分子的熱力勢的費用對 A 可用的相關相應一致的數量。 此熱力勢區別轉換為抵抗調直的強制,并且操作像一根值圖線的 「彈簧」。 與在一宏觀等級的情形對比這是,拉一個靈活的字符串不要求重大的強制,直到它是平直的,并且實際中堅被舒展。

當長的分子被拉時,要求強制延伸往平直的相應一致的分子,即使在中堅的債券沒有被舒展。

值圖線的彈性

二個基本的設計為此值圖線的彈性是常用的,取決於若乾鏈僵硬是否是包括的。 在這個自由地被聯接的鏈 (FJC)設計,中堅被塑造作為完全地 「自由」聯接連接的小的部件,因此相鄰部件可能有在他們之間的所有角度,不用額外的能源費用。 這個卑下的鏈 (WLC)設計,相反,是與鏈僵硬的一條持續細絲安裝的,并且是分子的一個更好的設計例如雙股的脫氧核糖核酸。 持續時間長度被定義,表示鏈子的長度最初的取向被隨機化。

如果強制擴展名曲線收集,則它可以由這些設計之一得到被舒展的這個分子的長度和 WLC 設計的持續時間長度適合。

一些專門化的分子,例如蛋白質,通常有一個被定義的 (被摺疊的) 三維結構在解決方法。 例如此結構是這個關鍵字對他們的生物功能作為酵素或結構上的部件。 多縮氨基酸鏈子不是輕鬆的鬆散捲,然而被摺疊到一個更加僵硬的結構并且由許多債券相連。 如果蛋白質由強制展開,化學製品或上升暖流更改,則自由多縮氨基酸鏈子正常運行像一個簡單的線性分子。 因為沿多縮氨基酸中堅的債券是高度靈活的,值圖線舒展能被看到。 蛋白質結構的被定義的部分,例如阿爾法螺旋或球狀域,可以順序地展開,并且在舒展的曲線基礎上的這個分子的被評定的 「自由」長度將增加與每個展開活動。 蛋白質展開步驟關於這個正常被摺疊的結構和其失效機理的情報。

黃原膠 - 簡單分子舒展

黃原膠是細菌多聚糖,與分子中堅相同與纖維素。 副組的化工屬性產生這個聚合物許多行業應用,從食物安定到油恢復。

當黃原膠分子被舒展在這個技巧和表面之間時,短的副組沒有對有彈性屬性的重大的作用,并且這個工作情況類似於一個唯一 (carboxymethylated) 纖維素鏈子。 高分子重黃原膠聚合物可能有幾微米的長度,并且舒展的曲線可以使用例如簡單的分子擴展名。 對於低強制,這個鏈子被舒展值圖線的彈簧。 有時,當這個端到端長度處理等高長度,中堅彈性的彈性變得重要。

圖 3 顯示使用 NanoWizard® 被舒展的 (在磷酸鹽緩衝液解決方法) 一個唯一黃原膠分子的縮回曲線 AFM。 使用熱量噪聲方法,懸臂式偏折被校準了。

对與設計的比較,必須為懸臂的偏折也更正技巧範例距離得到一個實際分隔值,顯示得這裡。 更大的負強制對應於偏轉更多的這個技巧往表面並且更強的延伸變形的強制在這個分子。

圖 3。

從延長的 FJC 設計的曲線在比較的表 3 也顯示,被計算使用 Kuhn 長度的 6 毫微米和 1.25 微米的等高長度。 簡單的 FJC 或 WLC 設計的適應為小的延伸變形的強制是合理的 (在 50pN 附近下在這種情況下),但是曲線分流了在更強的強制。 因此與另外的細分市場彈性的延長的 FJC 設計用於,考慮到舒展在更強的延伸變形的強制的中堅。

一旦黃原膠,這個技巧和表面之間的一個唯一長的連結被舒展。 因為這個分子是很長的,延伸它的強制為許多是非常小的舒展的曲線,并且這個工作情況由舒展的高強制控制這個被舒展的長度在等高長度附近的地方。 對於更複雜被摺疊的分子,當這個結構的不同的部分展開并且是延長的,例如蛋白質,一系列這些舒展的活動一般被看到。

Bacteriorhodopsin - 提取和展開

Bacteriorhodopsin 是從細菌細胞的集成膜蛋白質,生成細胞的能源從輕的光子。 有 7 個橫跨膜阿爾法螺旋,與在他們之間的更多被混亂的肽循環。

當蛋白質的一個末端被掌握和拉時,然後阿爾法螺旋被拉出膜,并且他們展開,當他們被拔出。

紫色膜是 bacteriorhodopsin 的自然來源,并且包括 25% 油脂和 75% bacteriorhodopsin。 蛋白質被安排作為在二維晶體結構的三聚合物,可以是印象的使用 AFM,如圖 4 所顯示 (D.J. Mullerr, TechnicalUniversityDresdenGermany 範例禮貌

圖 4。

展開進程的一張簡圖在表 5. 顯示。 七個阿爾法螺旋在当 AFM 技巧的部分 A 顯示,拾起一個末端 (在實際蛋白質,阿爾法螺旋在捆綁一起被編組的附註,不是線路)。 有許多可能的展開路,但是很可能活動是 alphahelices 在對被拔出。 當他們從膜,被提取三個部分地展開的狀態級數在圖 5 的 B 部分顯示與展開對的 的阿爾法螺旋。

圖 5。

圖 6 顯示 10 bacteriorhodopsin 展開曲線的疊置,当強制被密謀被更正的技巧範例分隔。 有若乾黏附力,因為這個技巧離開表面,跟隨由三主要舒展和展開活動,與在圖顯示的三個狀態相應 5 B. 上。 主要峰頂是在 20-30nm、 40-50nm 和 60-80nm 附近,很好與在這個文件發布的值一致。 懸臂被校準了使用熱量噪聲方法和實驗被執行在緩衝 (10mM TRIS, 150mM 氯化鉀,酸碱度 7.6) 下。

政券故障活動的確切的位置從曲線變化到曲線,為與能源的債券是典型的接近熱能在室溫。 曲線的舒展的部分在表 6 躺在了,向顯示同樣結構在每個案件被舒展。 仅實際時候,當被舒展的債券中斷從曲線變化到曲線時。 對於與能源的一個債券在熱能附近,有失效在有些時候內的某個概率它,甚而沒有應用的強制。 這對應於為約束回應」任意看到的正常 「比率在解決方法。 對於與能源的債券一點在熱能上,通常是穩定的,概率他們本能地發生故障增加,當強制是應用的。

圖 6。

一種方式認為一個舒展的活動,因此,是債券緊張,直到對展開的能壘在這個熱量範圍內。 實際時候,當債券突然發生故障時取決於一個任意熱量波動,採取在展開能壘的分子。 時間相依意味著被評定的展開費率將取決於貸款利率,或者這個技巧拉這個分子的自由末端的速度。

圖 7。

許多 bacteriorhodopsin 展開曲線可以收集產生展開活動的一個統計觀點。 這個分子也許展開用幾個方式,因此某個選擇在強制曲線必須做選擇一個特殊子集。 在這種情況下,顯示三個主要舒展的活動,例如示例的仅曲線在表 6,被選擇了。 在表 7 存在直方圖,顯示三個峰頂 (數據的技巧範例分隔配電器為 n = 355 曲線)。 使用 PUNIAS 軟件,強制曲線分析部分地被執行了。

圖 8。

圖 8 在表 7. 顯示展開強制的消散劇情與活動的位置數據集的和一樣。 第一個展開活動的強制 (峰頂 1) 為隨後的活動 (峰頂 2 和 3) 顯著高於。 一旦打亂了蛋白質結構,然後從膜裡面拉剩餘的阿爾法螺旋減少要求的強制。 展開曲線也顯示這個分子的不同的路能展開和拉出膜。 從蛋白質結構和氨基酸鏈長的知識,延伸變形的曲線可以適合明顯地顯示哪個展開路徑在特殊強制曲線上。

Titin 展開

Titin 是從肌肉組織的蛋白質,包括幾個被重複的球狀域。 在肌肉組織內它對在一宏觀等級的機械性能負責。 AFM 允許各自的 titin 分子 nanomechanical 屬性的研究。 因為這個分子被舒展,暫掛一個特殊域的債券將一起發生故障。 此特殊球狀域然後展開,導致這個分子的一個更長的等高長度。 進一步拉,線性氨基酸的此部分也被舒展,并且其他域之一將到達其故障點。 這在表 9. 概要地說明。

圖 9。

當蛋白質被拉,域 「彈出」順序地開張,導致峰頂一個典型順序在偏折的彎曲。 當域展開,強制劇情的每個連續的彎曲的部分形狀反射這個分子的增加的有效長度。

一個典型的 titin 擴展名強制分光學在表 10 縮回曲線顯示 (馬賽厄斯 Amrein,卡爾加里,加拿大的大學數據禮貌,獲得使用在一個唯一 Ig8 titin 肌肉蛋白的 NanoWizard® AFM)。 展開活動典型 titin 順序能明顯地被看到。 穩步強制增量,當緊張在這個分子增加。 強制急劇突然減少,當 Ig 域打開,并且發行緊張。 每個延伸的區域曲線可以符合對應的游離氨基酸長度的 FJC 或 WLC 設計。 展開強制的範圍一個唯一域的是在 190-250pN 範圍內,并且一個域 (尖峰對尖峰的距離) 的等高長度是 28nm。

圖 10.)。

應用

使用 AFM,各種各樣的蛋白質可以被舒展和展開。 二個示例顯示了得這裡,一膜蛋白質和一細胞質蛋白質。 此方法可以延伸到其他蛋白質,對關於正常蛋白質結構和其失敗形式的收益信息。 一旦 bacteriorhodopsin,蛋白質形成在細菌細胞壁的非常高度被包裝的結構,和,因此是可以為高分辨率結構上的確定被結晶少數膜蛋白質的之一。

然而此方法可以是一般應用的。 對於多數膜蛋白質,因為多數膜蛋白質不適用於結晶,氨基酸順序比這個被摺疊的結構是容易確定。

展開活動評定與 AFM,顯示在氨基酸長度上的變化,當不同的結構上的部件展開,可以用於以這個已知的順序解釋膜蛋白質三級結構。 探測的特定有的蛋白質的塗層和修改特定 「裝貨」點可能導致拉蛋白質在不同的地點並且詳細信息關於結構上的部件如何在這個三維結構一起被連接。

因而 AFM 能給予洞察力到一個唯一分子的配置和允許分子屬性的一個獨立評定精煉分子塑造的技術。 AFM 可能與唯一分子熒光技術也結合例如 TIRF 或苦惱。

來源: JPK 儀器

關於此來源的更多信息请請參觀 JPK 儀器

Date Added: Feb 21, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:38

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