Kombination der AtomKraft-Mikroskopie und des Lasers, die Confocal Mikroskopie Scannt

Themen Umfaßt

Hintergrund

JPK Nanowizard II

Genaue Kalibrierung von Confocal Optischen Bildern

Überlagerung von Kalibrierten Optischen Bildern und VON FLUGHANDBUCH-Bildern

Clathrin und Caveolin auf MäuseEmbryonalen Fibroblasten

Schlussfolgerungen

Hintergrund

Die Sichtbarmachung von Stichprobenelementen unter Verwendung der verschiedenen Formulare von Mikroskopie beruht, nicht nur auf Vergrößerung aber kontrastiert auch. Als solches Unterscheidungsformulare von unterschiedlichen Informationen des Mikroskopieangebots über eine Probe. Laser, der confocal Mikroskopie scannt, (LSCM) liefert Informationen über den Einbauort 3D einer Einzelheit, beschriftet Bauteil innerhalb einer Probe und hat den zusätzlichen Vorteil des Ausschließens aus Fokusleuchte heraus. Dieses kann zu schärfere Bilder einer gegebenen Brennebene in einer Probe führen. Atomkraftmikroskopie (AFM) liefert andererseits direkte strukturelle Informationen über die Probenoberfläche. Die Kombination dieser zwei Formulare von Mikroskopie könnte ein sehr leistungsfähiges Hilfsmittel in der Forschung sein, da es schwierig ist, Zellen für FLUGHANDBUCH-Darstellung „zu beflecken“, spezifische, Elemente auf einer strukturellen Basis allein folglich zu unterscheiden nicht immer möglich ist. Der Gebrauch von Leuchtstoff Schildern und Darstellung die optische Scheibe entsprechend der Beispieloberfläche mit LSCM bedeutet den, wenn die zwei Techniken kombiniertes im LCSM-Bild dann beschriften sein können können das Kreuz sein, das mit den Zellen aufeinander bezogen wird, die mit FLUGHANDBUCH abgebildet sind. Dieses hat den hinzugefügten Nutzen von den Einbauort von den beschrifteten Proteinen auch in einen Kontext setzen (gekennzeichnet mit LSCM) in Bezug auf spezifische Zellen.

JPK Nanowizard II

Zu die zwei Mikroskopietechniken kombinieren, welche die zwei unterschiedlichen Instrumente zusammen aufgebaut werden müssen, so, dass kein die Funktion von der anderen stört. Die Kombination des confocal Mikroskops und des JPK Nanowizard®II Nikon C1 erlaubt Darstellung der gleichen Versuchsfläche mit beiden Techniken, da das JPK Nano--Wizard® konstruiert wird, oben auf ein umgekehrtes Lichtmikroskop eingebaut zu sein. Folglich gibt es bottom-up-Zugriff zur Probe für die Lichtmikroskopietechniken und top-down Zugriff für den FLUGHANDBUCH-Stift. Das JPK NanoWizard®II benötigt nur, dass die Stufe des confocal Nikon gegen eins von in hohem Grade stabilem Bau ausgetauscht wird. Es gibt einen hellen Pfad durch das FLUGHANDBUCH, das bedeutet, dass diese Lichtmikroskopie der Übertragung sowie der Reflexion mit dem FLUGHANDBUCH an Ort und Stelle geleitet werden kann. Folglich ist die Grundausrüstung der zwei Darstellungseinheiten für das simultane Arbeiten kompatibel.

Für FLUGHANDBUCH-Darstellungsstabilität ist extrem wichtig (folglich die Anforderung für die stabilere Stufe). Dieses hat bedeutet, dass der Gebrauch von dünnen coverglass als Beispielhalterungen für FLUGHANDBUCH-Darstellung für eine lange Zeit mit FLUGHANDBUCH-Bildern der hohen Qualität unvereinbar war-. Jedoch denn überlegene optische Bilder ist es häufig zu den Bildproben durch dünne coverglass besser, besonders wenn hohe Vergrößerung, Immersionsobjektive verwendet werden. Für solche Experimente in denen der Benutzer Darstellung der hohen Qualität von beiden Anlagen kombinieren möchte, hat JPK Beispielhalterungen, wie das BioCell, die dem Benutzer erlauben, Proben an den coverglass stabil zu montieren, ohne kompromittierende Bildqualität konstruiert.

Zusätzlich für wahre Integration, muss es irgendeine Methode geben, den Bildplatz der zwei Techniken zu kalibrieren, damit sie genau bedeckt werden können. Dieses ist notwendig, um die unvermeidbaren, obwohl kleinen, räumlichen Abweichungen auszugleichen, die aus dem Gebrauch von Optik im Lichtmikroskop sich ergeben. Jedoch werden den piezos in jedem JPK-Instrument so linearisiert, dass das FLUGHANDBUCH-Bild zu 3Å in den x- und o-Richtungen genau ist. Da es Verzerrung im optischen Bild gibt, das nicht im FLUGHANDBUCH wiederholt wird, in den meisten Fällen überlagern die Bilder von den unterschiedlichen Quellen nicht genau. Dieses ist besonders ein Problem, wenn der Benutzer Leuchtstoffsignale mit kleinen Zellen, wie endocytic Vertiefungen, auf der Oberfläche einer Zelle aufeinander beziehen möchte.

Die Bedeckung der Bilder und ein durch Auge dann sich wölben bezieht beträchtlichen subjektiven Input mit ein, der fehleranfällig ist.

Genaue Kalibrierung von Confocal Optischen Bildern

Während das FLUGHANDBUCH-Bild unter Verwendung der sehr genauen linearisierten piezos erzeugt wird, kann es als „Realraum“ behandelt werden. Der Kragbalken (Darstellungsstift) des FLUGHANDBUCHS ist normalerweise der Raster, der über der Oberfläche gescannt wird, um ein Bild aufzubauen. Jedoch kann dieser Kragbalken auf Fixpunkte auch genau verschoben werden. Dies heißt, dass der Kragbalken verwendet werden kann, um das optische Bild zu kalibrieren, indem man empirisch die freitragende Stellung in einem Set optischen Bildern bestimmt, in denen die genaue Stellung im FLUGHANDBUCH bereits bekannt. Kurz Gesagt wird der Kragbalken auf ein Set von 25 Punkten im Realraum, unter Verwendung der piezos verschoben. An jedem Punkt wird ein optisches Bild erworben und nachfolgend wird der Spitzeneinbauort innerhalb des optischen Bildes automatisch bestimmt. Eine Umwandlungsfunktion wird dann unter Verwendung beider Sets von 25 Punkten berechnet, und diese wandeln angewandtes zum optischen Bild um, während es in die SPM-Software importiert wird (benötigt für das Ausführen des JPK NanoWizard AFMs). Auf solch eine Art wird das optische Bild in die SPM-Umgebung, in einem automatisierten Prozess kalibriert und importiert.

Abbildung 1. Kalibrierung von LSCM-Bildern unter Verwendung der Direkten Überlagerungsfunktion. Der FLUGHANDBUCH-Kragbalken kann im Reflexionsmodus unter Verwendung LSCM abgebildet sein. Hier sind fünf einzelne freitragende Bilder gelegtes (a), und dann gelegt über einem entsprechenden LSCM-Bild von FITC-phalloidin beschriftete Maus embryonale Fibroblasten (b).

Im Falle der Kombination von FLUGHANDBUCH mit LSCM wird das optische Bild des FLUGHANDBUCH-Kragbalkens im Reflexionsmodus erzeugt, d.h. wird der Emissionsfilter vor vom Detektor gelöscht und die Reflexion des Erregungslasers vom Kragbalken ist abgebildet (Abbildung 1). Auf solch eine Art kann die freitragende Stellung innerhalb des LSCM-Bildbereiches unter Verwendung des gleichen hellen Pfades wie für Darstellung im Wesentlichen entdeckt werden die Probe. Abbildung 1 stellt dar, dass eine Überlagerung von fünf der Kragbalkenstellungen (a) mit dem entsprechenden LSCM-Bild von FITC-phalloidin Maus embryonale Fibroblasten (b) beschriftete. Während die genaue Stellung des Kragbalkens im FLUGHANDBUCH-Platz bekannt, kann Berechnung der entsprechenden Spitzenstellung in den LSCM-Bildern berechnet werden und eine Umwandlungsfunktion abgeleitet werden, um genaue Überlagerungen der zwei Bilder zu erlauben.

Überlagerung von Kalibrierten Optischen Bildern und VON FLUGHANDBUCH-Bildern

Sobald der Bildplatz beider Mikroskope quer-aufeinander bezogen worden ist, entstehen einige interessante Möglichkeiten.

Das confocal Bild kann in die FLUGHANDBUCH-Software importiert werden, um die Darstellung von spezifischem zu erlauben, beschriftet Bereiche oder Manipulation von spezifischen Regionen der Zelle, und genaue Offline-Überlagerungen können beschriftete Bauteile zu ihren entsprechenden Zellen genau abbilden. Zum Beispiel wird die Oberfläche von MDCK-Zellen durch Actin-basierte Microvilli umfaßt, die unter Verwendung FLUGHANDBUCHS abgebildet direkt sein können und das Actin, das sich bildet, die strukturelle Basis der Microvilli mit LSCM abgebildet sein kann, nachdem es mit Leuchtstoff beschriftetem phalloidin befleckt hat.

Vorher führte Vergleich solcher Bilder nicht, um die Überlagerung alles Actinsignals mit den Vorsprüngen an der Oberfläche zu verweisen die Zelle, wegen der geringfügigen Unterschiede bezüglich beider Bilder. Jedoch nach Kalibrierung des confocal Bildes und der Transformation, ist Überlagerung der confocal und FLUGHANDBUCH-Bilder genau (Abbildung 2).

Abbildung 2. Kombinierte Darstellung von MDCK-Zellen. Örtlich Festgelegte MDCK-Zellen, Actin beschriftet mit FITC-phalloidin. (a) Confocal Mikroskopiebild der Oberfläche der MDCK-monomolekularen Schicht, verbundene Actin-basierte Oberflächenmicrovilli und die Zellkreuzungen zeigend. Das FLUGHANDBUCH-Bild (b) der gleichen Region ist aufbereitet worden, um die Biegung der Zelle zu löschen und Informationen über die Oberflächenvorsprünge (Microvilli) gerade zu enthalten. (c) in den zwei Bildern werden bedeckt.

Die MDCK-Zellen wurden mit dem Paraformaldehyd (4% in PBS, Protokoll 20) geregelt, beschriftet mit FITC-phalloidin und die Oberfläche der Zellen waren mit FLUGHANDBUCH und LSCM abgebildet. Im confocal Bild (a) entsprechen die Merkmale den Oberfläche dazugehörigen Actin-basierten Microvilli und den Zellkreuzungen, in denen faseriges Actin lokalisiert wird. Im topographischen Bild FLUGHANDBUCHS (b) sind- die Microvilli und die Zellkreuzungen auch offensichtlich. Da das FLUGHANDBUCH-Bild die strukturellen Informationen vom ganzen Oberflächen enthält, nicht gerade ist spezifische Bauteile, das Bild aufbereitet worden, um die Biegung der Zellen zu löschen und die kleineren Oberflächenvorsprünge (Microvilli) gerade zu zeigen. (c) im rot-farbigen FLUGHANDBUCH-Bild ist mit der grünen Fluoreszenz bedeckt worden.

Clathrin und Caveolin auf MäuseEmbryonalen Fibroblasten

Die Microvilli an der Spitzenoberfläche von MDCK-Zellen sind die dominierende Zelle auf der Oberfläche in FLUGHANDBUCH-Bildern, also ist die korrekte Überlagerung klar. Jedoch wenn Zellen, die eine sehr heterogene Oberfläche haben, abgebildet sind, ist es extrem schwierig, spezielle Funktionen verschiedenen Oberflächenzellen ohne irgendein Formular des spezifischen Schildes zuzuweisen. In solch einem Fall wenn die Überlagerung der zwei Baumuster von Bildern nicht genau ist, können Fehler in der Kreuzkorrelation gemacht werden. Um das Potenzial des Gebrauches der Direkten Überlagerung für die Kombination von LSCM mit FLUGHANDBUCH zu zeigen wurde ein komplexes System beschlossen. Mäusewurden embryonale Fibroblastzellen entweder mit dem anti--caveolin oder anti--clathrin Antikörper beschriftet, gefolgt von einem TRITC-beschrifteten Sekundärantikörper.

Abbildung 3. Kombinierte Darstellung von clathrin beschichteten Vertiefungen an der Oberfläche von MEF-Zellen. Mäuseembryonale Fibroblasten wurden mit anti--clathrin Antikörper der schweren Kette beschriftet. Um clathrin beschichtete Vertiefungen sichtbar zu machen wurde ein TRITC-beschrifteter Sekundärantikörper hinzugefügt, und faseriges Actin wurde unter Verwendung FITC-phalloidin befleckt. Ein Überblick über die Zellen als FLUGHANDBUCH-Topographie (a), beschriftet Actin (b) und eine Überlagerung der zwei (c) wird zur Verfügung gestellt. Eine höhere Auflösung FLUGHANDBUCH-Topographie (d) wurde erworben, wie ein LSCM-Bild (e) eines Bereiches, der beschriftetes clathrin an der Zelloberfläche ausstellt. Eine Überlagerung der zwei Bilder (f) zeigt, dass Leuchtstoffschild Vertiefungen an der Zelloberfläche entspricht. Ein elektronisches lautes Summen der Topographie von einem relevanten Bereich (markiert in F) wird in (g) dargestellt.

Die Zellen wurden zu 4°C abgekühlt und beschriftet mit anti--clathrin Antikörper der schweren Kette und geregelt dann mit Paraformaldehyd (4% in PBS, Protokoll 20). Um clathrin beschichtete Vertiefungen sichtbar zu machen wurde ein TRITC-beschrifteter Sekundärantikörper hinzugefügt, und faseriges Actin wurde unter Verwendung FITCphalloidin befleckt.

Die DirectOverlay-Funktion wurde verwendet, um das LSCM-Bild gegen das FLUGHANDBUCH-Bild zu kalibrieren, wie vorher beschrieben. Nach Kalibrierung der confocal Bilder, kann man bestimmen, welche Vertiefungen auf der Oberfläche clathrin-beschriftet kennzeichnet in den Fluoreszenzbildern entsprechen (Abbildung 3).

Um Oberflächen-caveolin sichtbar zu machen, wurden Mäuseembryonale Fibroblasten mit Paraformaldehyd (4% in PBS, Protokoll 20) geregelt und beschriftet dann mit Antikörper anti-caveolin-1. Dieser Hauptantikörper wurde dann unter Verwendung eines TRITC-beschrifteten Sekundärantikörpers befleckt. Wieder wurde die DirectOverlay-Funktion verwendet, um das LSCM-Bild gegen das FLUGHANDBUCH-Bild zu kalibrieren.

Die Bilder können dann verglichen werden, um die Oberflächenmerkmale zu übersetzen, die durch das FLUGHANDBUCH gesehen werden (Abbildung 4). Während die Zellen nur repariert werden müssen, behandelt worden nicht auf jede mögliche andere Art, erlaubt diese kombinierte Darstellung dem Benutzer, zu erreichen einen Überblick über, wie solche Zellen auf anderen Zellen an der Oberfläche der Zelle in Verbindung stehen.

Abbildung 4. Kombinierte Darstellung von caveolae an der Oberfläche von MEF-Zellen. Mäuseembryonale Fibroblasten wurden mit Paraformaldehyd geregelt und beschriftet dann mit Antikörper anti-caveolin-1. Dieser Hauptantikörper wurde dann unter Verwendung eines TRITC-beschrifteten Sekundärantikörpers befleckt. Ein Überblick FLUGHANDBUCH-Topographiebild der Zelle war erworbenes (a) und der LSCM-Bildplatz, der kalibriert wurde, um Vergleich des FLUGHANDBUCHS und des LSCM zu erlauben. Ein höheres Auflösung FLUGHANDBUCH-Bild war erworbenes (b) und verglichen mit dem entsprechenden LSCM-Bild der Oberfläche gehörte caveolae (c) dazu. Eine Überlagerung wird in (d) und in einem lauten Summen in den markierten Bereich in (e) dargestellt.

Schlussfolgerungen

Die Kombination von FLUGHANDBUCH mit LSCM kann die Anwendungen beider Techniken weiter ausdehnen. Nach Ansicht FLUGHANDBUCH-Darstellung erlaubt Kombination mit LSCM und Kalibrierung der Bilder genaue Bestimmung von bestimmten Zellen an der Oberfläche von Zellen, d.h. cavaeoli und clathrincoated Vertiefungen. Zusätzlich erlaubt LSCM-Darstellung im Verbindung mit Manipulation, indem sie das FLUGHANDBUCH verwendet, Darstellung von Prozessen hinter der Zellmanipulation. Die Möglichkeiten dehnen viel weiteres aus, mit jeder möglicher Kombination von möglicher FLUGHANDBUCH-Manipulation und LSCM-Darstellung jetzt.

Quelle: JPK-Instrumente

Zu mehr Information über diese Quelle besuchen Sie bitte JPK-Instrumente

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