Combinar Microscopia Atómica de la Fuerza y el Laser Que Exploran Microscopia Confocal Usando el Equipo de los Instrumentos de JPK

Temas Revestidos

Antecedentes

JPK Nanowizard II

Calibración Exacta de Imágenes Ópticas Confocales

Papel de Imágenes Ópticas Calibradas y de Imágenes del AFM

Clathrin y Caveolin en Fibroblastos Embrionarios del Ratón

Conclusiones

Antecedentes

La visualización de los elementos de muestra usando diversos formularios de la microscopia confía no sólo en la magnificación pero también pone en contraste. Como tal, formularios que difieren información de la oferta de la microscopia de diversa sobre una muestra. El Laser que explora microscopia confocal (LSCM) proporciona a la información sobre la ubicación 3D de un detalle, etiqueta componente dentro de una muestra y tiene la ventaja adicional de la exclusión fuera de luz del enfoque. Esto puede llevar a las imágenes más nítidas de un avión focal dado en una muestra. La microscopia Atómica de la fuerza (AFM), por otra parte, proporciona a la información estructural directa sobre la superficie de una muestra. La combinación de estos dos formularios de la microscopia podría ser una herramienta muy potente en la investigación pues es difícil “manchar” las estructuras para la proyección de imagen del AFM, por lo tanto la distinción de elementos específicos sobre una base estructural solamente no es siempre posible. El uso de escrituras de la etiqueta y de la proyección de imagen fluorescentes la rebanada óptica correspondiente a la superficie de la muestra con LSCM significa eso, si las dos técnicas pueden ser entonces etiqueta combinada en la imagen de LCSM pueden ser cruz correlacionada a las estructuras reflejadas con el AFM. Esto tiene la ventaja adicional también de contextualizing la ubicación de las proteínas etiqueta (determinadas con LSCM) en cuanto a las estructuras específicas.

JPK Nanowizard II

Para combinar las dos técnicas de la microscopia que los dos instrumentos separados necesitan ser construidos juntos, tales que ninguno perturba la función de la otra. La combinación del microscopio confocal y del JPK Nanowizard®II de Nikon C1 permite la proyección de imagen de la misma área de la muestra con ambas técnicas, pues el JPK Wizard® Nano se diseña para ser instalado encima de un microscopio pálido invertido. Por Lo Tanto hay acceso ascendente a la muestra para las técnicas de la microscopia pálida y acceso de arriba hacia abajo para la aguja del AFM. El JPK NanoWizard®II requiere solamente que el escenario de Nikon confocal esté intercambiado para uno de construcción altamente estable. Hay un camino pálido a través del AFM que significa que esa microscopia pálida de la transmisión así como de la reflexión se puede conducto con el AFM en el lugar. Por Lo Tanto, la herramienta básica de los dos dispositivos de proyección de imagen es compatible para el funcionamiento simultáneo.

Para la estabilidad de la proyección de imagen del AFM es extremadamente importante (por lo tanto el requisito para el escenario más estable). Esto ha significado que el uso de coverglass finos como soportes de la muestra para la proyección de imagen del AFM era durante mucho tiempo incompatible con las imágenes de alta calidad del AFM. Sin Embargo, porque las imágenes ópticas superiores es a menudo mejor a las muestras de la imagen a través de coverglass finos, determinado cuando se utiliza la alta magnificación, lentes de la inmersión. Para tales experimentos, donde el utilizador desea combinar la proyección de imagen de alta calidad de ambos sistemas, JPK ha diseñado los casquillos de la muestra, tales como el BioCell, que permiten que el utilizador monte estable muestras en coverglass, sin calidad de compromiso de la imagen.

Además, para la integración verdadera, debe haber una cierta manera de calibrar el espacio de imagen de las dos técnicas para poderlos sobreponer exacto. Esto es necesario compensar las aberraciones inevitables, no obstante pequeñas, espaciales que se presentan del uso de la óptica en el microscopio pálido. Sin Embargo, los piezos en cada instrumento de JPK se linearizan tales que la imagen del AFM es exacta a 3Å en las direcciones de x y de y. Pues hay distorsión en la imagen óptica que no se repliega en el AFM, en la mayoría de los casos las imágenes de las fuentes separadas no cubren exactamente. Esto es determinado un problema cuando el utilizador desea correlacionar señales fluorescentes con las pequeñas estructuras, tales como huecos endocytic, en la superficie de una célula.

La Sobreposición de las imágenes y después el combeo de uno por el aro implica la entrada de información subjetiva importante que es desvío propenso.

Calibración Exacta de Imágenes Ópticas Confocales

Mientras Que la imagen del AFM se genera usando piezos linearizados muy exactos puede ser tratada como “real-espacio”. El voladizo (aguja de la proyección de imagen) del AFM es generalmente retículo explorado sobre la superficie para construir una imagen. Sin Embargo, este voladizo se puede también mover exacto a las puntas fijas. Esto significa que el voladizo se puede utilizar para calibrar la imagen óptica empírico determinando la posición voladiza en un conjunto de las imágenes ópticas, donde la posición exacta en el AFM se sabe ya. En fin, el voladizo se mueve a un conjunto de 25 puntas en real-espacio, usando los piezos. En cada punta se detecta una imagen óptica y la ubicación de la punta dentro de la imagen óptica se determina posteriormente automáticamente. Una función de la transformación entonces se calcula usando ambos conjuntos de 25 puntas, y ésta transforma aplicado a la imagen óptica mientras que se importa en el software de SPM (requerido para ejecutar el JPK NanoWizard AFMs). De tal manera la imagen óptica se calibra y se importa en el ambiente de SPM, en un proceso automatizado.

Cuadro 1.

En el caso de combinar el AFM con LSCM la imagen óptica del voladizo del AFM se genera en modo de la reflexión, es decir el filtro de la emisión se quita delante del detector y la reflexión del laser de la excitación del voladizo es reflejada (el Cuadro 1). De tal manera la posición voladiza dentro del rango de la imagen de LSCM se puede detectar usando esencialmente el mismo camino pálido que para la proyección de imagen la muestra. El Cuadro 1 muestra que un papel de cinco de las posiciones del voladizo (a) con la imagen correspondiente de LSCM de FITC-phalloidin etiqueta el ratón los fibroblastos embrionarios (b). Mientras Que la posición exacta del voladizo en el espacio del AFM se sabe, el cálculo de la posición correspondiente de la punta en las imágenes de LSCM se puede ser calculado y una función de la transformación deducir para permitir los papeles exactos de las dos imágenes.

Papel de Imágenes Ópticas Calibradas y de Imágenes del AFM

Una Vez Que el espacio de imagen de ambos microscopios cruz-se ha correlacionado varias posibilidades interesantes se presentan.

La imagen confocal se puede importar en el software del AFM para permitir la proyección de imagen de específico, etiqueta las áreas, o manipulación de las regiones específicas de la célula, y los papeles fuera de línea exactos pueden correlacionar exactamente componentes etiqueta a sus estructuras correspondientes. Por ejemplo, la superficie de las células de MDCK es revestida por las microvellosidades actinia-basadas que pueden ser directamente reflejadas usando el AFM y la actinia que forma la base estructural de las microvellosidades puede ser reflejada con LSCM después de manchar con el phalloidin fluorescente etiqueta.

Previamente, la comparación de tales imágenes no llevó para dirigir el papel de toda la señal de la actinia con las protuberancias en la superficie la célula, debido a las diferencias ligeras en ambas imágenes. Sin Embargo, después de la calibración de la imagen y de la transformación confocales, el papel de las imágenes confocales y del AFM es exacto (el Cuadro 2).

Cuadro 2.

Las células de MDCK fueron reparadas con el paraformaldehido (el 4% en PBS, minuto 20), etiqueta con FITC-phalloidin y la superficie superior de las células era reflejada con el AFM y LSCM. En la imagen confocal (a) las características corresponden a las microvellosidades actinia-basadas asociadas superficie y a las uniones de la célula, donde se localiza la actinia filamentosa. En la imagen topográfica del AFM (b) las microvellosidades y las uniones de la célula son también evidentes. Pues la imagen del AFM contiene la información estructural del superficial entero, no apenas los componentes específicos, la imagen se han tramitado para quitar la curvatura de las células y apenas para mostrar las protuberancias superficiales más pequeñas (microvellosidades). En (c) la imagen rojo-coloreada del AFM se ha sobrepuesto con la fluorescencia verde.

Clathrin y Caveolin en Fibroblastos Embrionarios del Ratón

Las microvellosidades en la superficie apical de las células de MDCK son la estructura dominante en la superficie en imágenes del AFM, así que el papel correcto está sin obstrucción. Sin Embargo, cuando las células que tienen una superficie muy heterogénea son reflejadas es extremadamente difícil destinar funciones específicas a las diversas estructuras superficiales sin un cierto formulario de la escritura de la etiqueta específica. En tal caso, si el papel de los dos tipos de imágenes no es exacto equivocaciones en la correlación cruzada pueden ser incurridas en. Para demostrar el potencial del uso del Papel Directo para combinar LSCM con el AFM un sistema más complejo fue elegido. Las células embrionarias del fibroblasto del Ratón etiqueta con el anticuerpo anti-caveolin o anti-clathrin, seguido por un anticuerpo secundario TRITC-etiqueta.

Cuadro 3.

Las células fueron enfriadas a 4°C y etiqueta con el anticuerpo anti-clathrin del encadenamiento pesado y después reparadas con el paraformaldehido (el 4% en PBS, minuto 20). Para visualizar huecos recubiertos clathrin un anticuerpo secundario TRITC-etiqueta fue agregado, y la actinia filamentosa fue manchada usando FITCphalloidin.

La función de DirectOverlay fue utilizada para calibrar la imagen de LSCM contra la imagen del AFM según lo descrito previamente. Después de la calibración de las imágenes confocales, uno puede determinar qué huecos en la superficie corresponden a clathrin-etiqueta ofrecen en las imágenes de la fluorescencia (Cuadro 3).

Para visualizar el caveolin superficial, los fibroblastos embrionarios del ratón fueron reparados con el paraformaldehido (el 4% en PBS, minuto 20) y después etiqueta con el anticuerpo anti-caveolin-1. Este anticuerpo primario entonces fue manchado usando un anticuerpo secundario TRITC-etiqueta. Una Vez Más la función de DirectOverlay fue utilizada para calibrar la imagen de LSCM contra la imagen del AFM.

Las imágenes se pueden entonces comparar para interpretar las características superficiales consideradas por el AFM (Cuadro 4). Mientras Que las células necesitan solamente ser reparadas, no tratado de cualquier otra manera, esta proyección de imagen combinada permite que el utilizador obtenga una reseña de cómo tales estructuras se relacionan con otras estructuras en la superficie de la célula.

Cuadro 4.

Conclusiones

La combinación del AFM con LSCM puede ampliar más lejos las aplicaciones de ambas técnicas. Desde el punto de vista de proyección de imagen del AFM, la combinación con LSCM y la calibración de las imágenes permite la determinación exacta de estructuras determinadas en la superficie de las células, es decir cavaeoli y huecos clathrincoated. Además, la proyección de imagen de LSCM conjuntamente con la manipulación usando el AFM permite la proyección de imagen de procesos río abajo desde la manipulación de la célula. Las posibilidades ahora extienden mucho más allá, con cualquier combinación de la manipulación del AFM y de la proyección de imagen de LSCM posibles.

Fuente: Instrumentos de JPK

Para más información sobre esta fuente visite por favor los Instrumentos de JPK

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:28

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