La visualisation des éléments de l'échantillon en utilisant différentes formes de microscopie repose non seulement sur un grossissement, mais aussi le contraste. En tant que tel, différentes formes de microscopie offrent des informations différentes sur un échantillon. Microscopie confocale à balayage laser (LSCM) fournit des informations sur la localisation 3D d'un particulier, composante étiquetés dans un échantillon et il a l'avantage supplémentaire d'exclusion hors de la lumière au point. Cela peut conduire à des images plus nettes d'un avion de focale donnée dans un échantillon. La microscopie à force atomique (AFM), d'autre part, fournit directement des informations structurales sur la surface d'un échantillon. La combinaison de ces deux formes de microscopie pourrait être un outil très puissant dans la recherche comme il est difficile de "tache" structures pour l'imagerie AFM, d'où la distinction des éléments spécifiques sur une base structurelle seule n'est pas toujours possible. L'utilisation de marqueurs fluorescents et l'imagerie de la tranche optique correspondant à la surface de l'échantillon avec LSCM signifie que, si les deux techniques peuvent être combinées, puis d'étiquetage dans l'image LCSM peuvent être croisées corrélés à des structures imagées avec l'AFM. Cela a l'avantage supplémentaire de contextualisation également la localisation des protéines marquées (identifiée avec LSCM) par rapport à des structures spécifiques. JPK Nanowizard II Pour combiner les deux techniques de microscopie les deux instruments distincts doivent être construites ensemble, de telle sorte que ni le perturbe la fonction de l'autre. La combinaison de la microscopie confocale et Nikon C1 du JPK Nanowizard ® II permet l'imagerie de la zone même échantillon avec les deux techniques, comme le JPK Nano Assistant ® est conçu pour être installé sur le dessus d'un microscope optique inversé. Par conséquent, il est ascendante accès à l'échantillon pour les techniques de microscopie optique et de haut en bas d'accès pour le stylet de l'AFM. Le JPK NanoWizard ® II exige seulement que le stade de la confocale Nikon est échangé pour une construction très stable. Il ya un chemin de lumière grâce à l'AFM qui signifie que la transmission ainsi que la microscopie optique de réflexion peut être menée avec l'AFM en place. Ainsi, le matériel de base des deux appareils d'imagerie est compatible pour le fonctionnement simultané. Pour l'imagerie AFM stabilité est extrêmement important (d'où l'obligation pour le stade le plus stable). Cela signifie que l'utilisation de la lamelle fine comme supports de l'échantillon pour l'imagerie AFM a été pendant longtemps incompatible avec des images de grande qualité AFM. Cependant, pour des images optiques supérieures, il est souvent préférable d'échantillons d'image grâce à lamelle mince, surtout quand un fort grossissement, les lentilles d'immersion sont utilisés. Pour ces expériences, où l'utilisateur souhaite combiner l'imagerie de haute qualité des deux systèmes, JPK a conçu les supports d'échantillons, tels que le BioCell , qui permettent à l'utilisateur de façon stable montage d'échantillons sur lamelle, sans compromettre la qualité d'image. De plus, pour une véritable intégration, il doit y avoir un moyen de calibrer l'espace de l'image de ces deux techniques afin qu'ils puissent être précisément superposées. Cela est nécessaire pour compenser l'inévitable, quoique modeste, des aberrations spatiales qui découlent de l'utilisation de l'optique dans le microscope optique. Cependant, les piezos dans chaque JPK instruments sont linéarisées tel que l'image est précise à l'AFM dans le 3a directions X et Y. Comme il ya une distorsion dans l'image optique qui n'est pas reproduite à l'AFM, dans la plupart des cas, les images à partir des sources séparées ne reflètent pas fidèlement superposition. Ceci est particulièrement un problème lorsque l'utilisateur souhaite mettre en corrélation avec les signaux fluorescents de petites structures, telles que les fosses endocytose, sur la surface d'une cellule. En superposant les images, puis une déformation à l'oeil implique une importante participation subjective qui est sujette à erreur. Étalonnage précis des images optiques confocaux Comme l'image AFM est généré en utilisant très précis piezos linéarisé il peut être traité comme «espace réel». Le cantilever (imagerie stylet) de l'AFM est généralement raster numérisée sur la surface à construire une image. Cependant, cette cantilever peut également être déplacé précisément de points fixes. Cela signifie que le cantilever peut être utilisé pour calibrer l'image optique par empiriquement déterminer la position en porte à faux dans un ensemble d'images optiques, où la position précise de l'AFM est déjà connu. En bref, le cantilever est déplacé vers un ensemble de 25 points dans l'espace réel, en utilisant les piezos. À chaque point d'une image optique est acquis et par la suite la localisation des pointes dans l'image optique est déterminée automatiquement. Une fonction de transformation est alors calculé en utilisant les deux ensembles de 25 points, et cette transformation appliquée à l'image optique car il est importé dans le logiciel SPM (requis pour l'exécution du AFM JPK NanoWizard ). De cette manière, l'image optique est calibré et importés dans l'environnement SPM, dans un processus automatisé.  Figure 1. Calibration des images LSCM utilisant la fonction de superposition directe. L'AFM peut être imagée en mode réflexion à l'aide LSCM. Ici, cinq images sont superposées cantilever individuels (A), puis en surimpression sur une image LSCM correspondante de phalloïdine-FITC fibroblastes de souris étiqueté embryonnaires (B). Dans le cas de la combinaison AFM avec LSCM l'optique de l'image de l'AFM est générée en mode de réflexion, à savoir le filtre d'émission est retirée de devant le détecteur et le reflet de l'excitation laser à partir du cantilever est imagé (figure 1). De cette manière, la position en porte à faux dans la plage de l'image LSCM peuvent être détectées en utilisant essentiellement le trajet de la lumière même que pour l'imagerie de l'échantillon. La figure 1 montre une superposition de cinq des positions en porte à faux (A) avec l'image correspondante de LSCM phalloïdine-FITC fibroblastes de souris étiqueté embryonnaires (B). Comme la position précise du cantilever AFM dans l'espace est connue, le calcul de la position de la pointe correspondante dans les images LSCM peut être calculé et déduit une fonction de transformation pour permettre des superpositions précises des deux images. Superposition des images optiques et calibrées Images AFM Une fois l'espace de l'image des deux microscopes a été corrélées un certain nombre de possibilités intéressantes se présentent. L'image confocale peut être importée dans le logiciel d'imagerie AFM pour permettre à des particuliers, des zones étiquetées, ou la manipulation de régions spécifiques de la cellule, et précise superpositions déconnecté peut cartographier avec précision les composants étiquetés à leurs structures correspondantes. Par exemple, la surface des cellules MDCK est couvert par l'actine à base microvillosités qui peuvent être directement imagées par AFM et l'actine qui constitue le fondement structurel des microvillosités peuvent être imagées avec LSCM après coloration avec la phalloïdine marquée par fluorescence. Auparavant, la comparaison de ces images n'a pas conduit à diriger superposition de tous les signaux d'actine avec les protubérances à la surface de la cellule, en raison de légères différences dans les deux images. Cependant, après l'étalonnage de l'image confocale et la transformation, la superposition des images confocale et l'AFM est précis (figure 2).  Figure 2. Imagerie combinée de cellules MDCK. Correction de cellules MDCK, l'actine marqué au FITC-phalloïdine. (A) Image de microscopie confocale de la surface de la monocouche MDCK, montrant la surface associée l'actine à base microvillosités et les jonctions cellulaires. L'image AFM (B) de la même région a été traitée pour éliminer la courbure de la cellule et juste contenir des informations sur les protubérances de surface (microvillosités). En (C) les deux images sont superposées. Les cellules MDCK ont été fixées avec du paraformaldéhyde (4% en PBS, 20 min), marqué au FITC-phalloïdine et la surface supérieure des cellules ont été imagées avec l'AFM et LSCM. Dans l'image confocale (A) les caractéristiques correspondent à la surface associée l'actine à base microvillosités et les jonctions des cellules, où l'actine filamenteuse est localisée. Dans l'image AFM topographiques (B) le microvillosités et jonctions cellulaires sont également apparentes. Comme l'image AFM contient des informations structurelles sur toute la surface, et pas seulement des composants spécifiques, l'image a été traitée pour éliminer la courbure des cellules et juste montrer les protubérances de surface plus petite (microvillosités). En (C) l'image de couleur rouge AFM a été superposée à la fluorescence verte. Clathrine et cavéoline sur les fibroblastes embryonnaires de souris Les microvillosités à la surface apicale des cellules MDCK sont la structure dominante de la surface dans les images AFM, donc la superposition correcte est claire. Toutefois, lorsque les cellules qui ont une surface très hétérogènes sont imagés, il est extrêmement difficile d'attribuer des fonctions spécifiques à des structures de surface différentes, sans une certaine forme d'étiquette spécifique. Dans un tel cas, si la superposition des deux types d'images n'est pas précis dans les erreurs de corrélation croisée ne peut être faite. Pour démontrer le potentiel de l'utilisation de la superposition directe pour combiner avec l'AFM LSCM un système plus complexe a été choisi. Cellules de fibroblastes de souris embryonnaires ont été étiquetés avec soit d'anticorps anti-cavéoline ou anti-clathrine, suivie par un anticorps secondaire marqué TRITC-.  Figure 3. Imagerie combinée de clathrine puits recouverts à la surface des cellules MEF. Fibroblastes embryonnaires de souris ont été marquées avec des anticorps anti-chaîne lourde clathrine. Pour visualiser puits recouverts de clathrine un anticorps secondaire marqué TRITC-a été ajouté, et l'actine filamenteuse a été coloré en utilisant FITC-phalloïdine. Un aperçu des cellules comme la topographie AFM (A), étiquetés actine (B), et une superposition des deux (C) est fourni. Une résolution plus élevée AFM topographie (D) a été acquise comme une image LSCM (e) d'une zone présentant étiquetés clathrine à la surface cellulaire. Une superposition des deux images (F) montre que marqueur fluorescent correspond à des fosses à la surface cellulaire. Un zoom électronique de la topographie d'une zone pertinente (marqué en F) est présentée dans (G). Les cellules ont été refroidie à 4 ° C et étiquetés avec des anticorps anti-clathrine chaîne lourde et ensuite fixées au paraformaldéhyde (4% en PBS, 20 min). Pour visualiser puits recouverts de clathrine un anticorps secondaire marqué TRITC-a été ajouté, et l'actine filamenteuse a été coloré à l'aide FITCphalloidin. La fonction DirectOverlay a été utilisée pour calibrer l'image LSCM contre l'image AFM comme décrit précédemment. Après la calibration des images confocale, on peut déterminer qui oppose à la surface correspondent aux caractéristiques de la clathrine étiquetés dans les images de fluorescence (figure 3). Pour visualiser la surface cavéoline, souris fibroblastes embryonnaires ont été fixées avec du paraformaldéhyde (4% en PBS, 20 min) puis marqués avec des anti-cavéoline-1 anticorps. Cet anticorps primaire a été ensuite colorés en utilisant un anticorps secondaire marqué TRITC-. Encore une fois, la fonction DirectOverlay a été utilisée pour calibrer l'image LSCM contre l'image de l'AFM. Les images peuvent ensuite être comparés à interpréter les caractéristiques de la surface considérée par l'AFM (figure 4). Comme les cellules ne doivent être fixes, elle n'est pas traitée de toute autre manière, cette imagerie combinée permet à l'utilisateur d'obtenir un aperçu de la façon dont ces structures se rapportent à d'autres structures à la surface de la cellule.  Figure 4. Imagerie combinée de cavéoles à la surface des cellules MEF. Fibroblastes embryonnaires de souris ont été fixées au paraformaldéhyde puis marquées avec des anti-cavéoline-1 anticorps. Cet anticorps primaire a été ensuite colorés en utilisant un anticorps secondaire marqué TRITC-. Une image AFM aperçu topographie de la cellule a été acquise (A) et l'espace image LSCM calibré pour permettre une comparaison de l'AFM et LSCM. Une résolution plus élevée image AFM a été acquise (B) et par rapport à l'image de LSCM correspondante de surface associées cavéoles (C). Une superposition est présentée dans (D), et un zoom dans la zone marquée (E). Conclusions La combinaison de l'AFM avec LSCM peut encore étendre les applications des deux techniques. Du point de vue de l'imagerie AFM, association avec LSCM et l'étalonnage des images permet une détermination précise des structures particulières à la surface des cellules, c'est à dire cavaeoli et des fosses clathrincoated. De plus, l'imagerie LSCM en combinaison avec la manipulation en utilisant l'AFM permet d'imager des processus en aval de la manipulation des cellules. Les possibilités vont bien plus loin, avec toute combinaison de l'AFM et de manipulation de l'imagerie LSCM désormais possible. |