Combinaison de la Microscopie de Force et de la Microscopie Confocale de Lecture Atomiques de Laser Utilisant le Matériel des Instruments de JPK

Sujets Couverts

Mouvement Propre

JPK Nanowizard II

Étalonnage Précis des Images Optiques Confocales

Transparent des Images Optiques Étalonnées et des Images d'AFM

Clathrin et Caveolin sur les Fibroblastes Embryonnaires de Souris

Conclusions

Mouvement Propre

La visualisation des éléments témoin utilisant les formes variées de la microscopie se fonde non seulement sur l'agrandissement mais contraste également. En soi, formes différentes des informations différentes d'offre de microscopie sur un échantillon. La microscopie confocale de lecture de Laser (LSCM) fournit des informations au sujet de l'emplacement 3D d'un détail, étiqueté composant dans un échantillon et a l'avantage supplémentaire de l'exclusion hors de la lumière de foyer. Ceci peut mener aux images net d'un plan focal donné dans un échantillon. La microscopie Atomique de force (AFM), d'autre part, fournit des informations structurelles directes au sujet de la surface d'un échantillon. La combinaison de ces deux formes de microscopie pourrait être très un puissant outil dans la recherche car il est difficile « de souiller » des structures pour la représentation d'AFM, par conséquent discerner les éléments particuliers sur seule une base structurelle n'est pas toujours possible. L'utilisation des étiquettes fluorescentes et de la représentation la part optique correspondant à la surface témoin à LSCM signifie cela, si les deux techniques peuvent être alors écriture de labels combinée dans l'image de LCSM peuvent être croix marquée avec des structures imagées avec l'AFM. Ceci a l'avantage ajouté de mettre dans un contexte également l'emplacement des protéines étiquetées (recensées avec LSCM) en ce qui concerne les structures particulières.

JPK Nanowizard II

Pour combiner les deux techniques de microscopie que les deux instruments indépendants doivent être établis ensemble, tels que ni l'un ni l'autre ne touche au fonctionnement de l'autre. La combinaison du microscope confocal et du JPK Nanowizard®II de Nikon C1 permet la représentation de la même zone d'échantillon avec les deux techniques, car le JPK Wizard® Nano est conçu pour être installé sur un photomicroscope inversé. Par Conséquent il y a accès ascendant à l'échantillon pour les techniques de photomicroscopie et d'accès hiérarchisé pour le stylet d'AFM. Le JPK NanoWizard®II exige seulement que le stade du Nikon confocal est permuté pour un de construction hautement stable. Il y a un chemin léger par l'AFM qui signifie que cette photomicroscopie de boîte de vitesses ainsi que de réflexion peut être conduite avec l'AFM en place. Par Conséquent, le matériel de base des deux dispositifs imageurs est compatible pour le fonctionnement simultané.

Pour la stabilité de représentation d'AFM est extrêmement important (par conséquent la condition pour le stade plus stable). Ceci a signifié que l'utilisation des coverglass minces comme soutiens témoin de la représentation d'AFM était pendant longtemps incompatible avec des images de haute qualité d'AFM. Cependant, parce que des images optiques supérieures il est souvent meilleur aux échantillons d'image par les coverglass minces, en particulier quand l'agrandissement élevé, objectifs de submersion sont utilisés. Pour de telles expériences, où l'utilisateur souhaite combiner la représentation de haute qualité des deux systèmes, JPK a conçu les supports témoin, tels que le BioCell, qui permettent à l'utilisateur de monter stablement des échantillons sur des coverglass, sans qualité des images compromettante.

Supplémentaire, pour l'intégration vraie, il doit y avoir une certaine voie d'étalonner l'espace d'image des deux techniques de sorte qu'ils puissent être avec précision recouverts. C'est nécessaire pour compenser l'inévitable, quoique le petit, les aberrations spatiales qui résultent de l'utilisation du bloc optique dans le photomicroscope. Cependant, les piezos dans chaque instrument de JPK sont linéarisés tels que l'image d'AFM est précise à 3Å dans les sens de x et de y. Car il y a déformation dans l'image optique qui n'est pas reproduite dans l'AFM, dans la plupart des cas les images des sources indépendantes ne recouvrent pas exactement. C'est en particulier un problème quand l'utilisateur souhaite marquer les signes fluorescents avec de petites structures, telles que les piqûres endocytic, sur la surface d'une cellule.

Le Recouvrement des images et puis fausser un par l'oeil concerne la puissance d'entrée subjective significative qui est à erreur encline.

Étalonnage Précis des Images Optiques Confocales

Pendant Que l'image d'AFM est produite utilisant des piezos linéarisés très précis elle peut être traitée en tant que « réel-espace ». L'encorbellement (stylet de représentation) de l'AFM est habituellement trame balayée au-dessus de la surface pour établir une image. Cependant, cet encorbellement peut également être déménagé avec précision aux remarques fixes. Ceci signifie que l'encorbellement peut être employé pour étalonner l'image optique en déterminant empiriquement la position en porte-à-faux dans un ensemble d'images optiques, où la position précise dans l'AFM est déjà connue. En Bref, l'encorbellement est déménagé à un ensemble de 25 remarques dans le réel-espace, utilisant les piezos. À chaque remarque une image optique est saisie et ultérieurement l'emplacement d'extrémité dans l'image optique est automatiquement déterminé. Un fonctionnement de transformation est alors prévu utilisant les deux ensembles de 25 remarques, et ceci transforment appliqué à l'image optique pendant qu'il est importé dans le logiciel de SPM (requis pour faire fonctionner le JPK NanoWizard AFMs). D'une telle voie l'image optique est étalonnée et importée dans l'environnement de SPM, dans un traitement automatisé.

Le Schéma 1.

Dans le cas de combiner l'AFM avec LSCM l'image optique de l'encorbellement d'AFM est produite en mode de réflexion, c.-à-d. le filtre d'émission est retiré de devant le détecteur et la réflexion du laser d'excitation de l'encorbellement est imagée (le Schéma 1). D'une telle voie la position en porte-à-faux dans la marge d'image de LSCM peut être trouvée utilisant essentiellement le même chemin léger que pour la représentation l'échantillon. Le Schéma 1 affiche qu'un transparent de cinq des positions d'encorbellement (a) avec l'image correspondante de LSCM de FITC-phalloidin a étiqueté la souris les fibroblastes embryonnaires (b). Pendant Que la position précise de l'encorbellement dans l'espace d'AFM est connue, le calcul de la position correspondante d'extrémité dans les images de LSCM peut être prévu et un fonctionnement de transformation être déduit pour permettre les transparents précis des deux images.

Transparent des Images Optiques Étalonnées et des Images d'AFM

Une Fois Que l'espace d'image des deux microscopes croix-a été marqué un certain nombre de possibilités intéressantes se présentent.

L'image confocale peut être importée dans le logiciel d'AFM pour permettre la représentation de particulier, étiquetée des zones, ou manipulation des régions particulières de la cellule, et les transparents hors ligne précis peuvent exactement tracer les composants étiquetés à leurs structures correspondantes. Par exemple, la surface des cellules de MDCK est couverte par les microvilli actine-basés qui peuvent être directement imagés utilisant l'AFM et l'actine qui forme la base structurelle des microvilli peut être imagée avec LSCM après la souillure avec le phalloidin fluorescent étiqueté.

Précédemment, la comparaison de telles images n'a pas abouti à diriger le transparent de tout les signe d'actine avec les protrusions sur la surface la cellule, dû aux différences minces dans les deux images. Cependant, après étalonnage de l'image et de la transformation confocales, le transparent des images confocales et d'AFM est précis (le Schéma 2).

Le Schéma 2.

Les cellules de MDCK ont été fixées avec du paraformaldéhyde (4% dans PBS, mn 20), étiqueté avec FITC-phalloidin et la première surface des cellules étaient imagée avec l'AFM et le LSCM. Dans l'image confocale (a) les caractéristiques techniques correspondent aux microvilli actine-basés associés extérieurs et aux jonctions de cellules, où l'actine filamenteuse est localisée. Dans l'image topographique d'AFM (b) les microvilli et les jonctions de cellules sont également apparents. Car l'image d'AFM contient l'information structurelle de l'extérieur entier, pas simplement des éléments spécifiques, l'image a été traités pour enlever la lordose des cellules et pour afficher juste les protrusions extérieures plus petites (microvilli). Dans (c) l'image de couleur rouge d'AFM a été recouvert avec la fluorescence verte.

Clathrin et Caveolin sur les Fibroblastes Embryonnaires de Souris

Les microvilli sur la surface apicale des cellules de MDCK sont la structure dominante sur la surface dans des images d'AFM, ainsi le transparent correct est clair. Cependant, quand les cellules qui ont une surface très hétérogène sont imagées il est extrêmement difficile d'attribuer des fonctionnements particuliers aux structures extérieures variées sans une certaine forme d'étiquette particulière. En pareil cas, si le transparent des deux types d'images n'est pas précis des erreurs dans la corrélation croisée peuvent être effectuées. Pour expliquer le potentiel de l'utilisation du Transparent Direct pour combiner LSCM avec l'AFM un système plus complexe a été choisi. Des cellules embryonnaires de fibroblaste de Souris ont été étiquetées avec du l'anti-caveolin ou anti-clathrin anticorps, suivi d'un anticorps secondaire TRITC-étiqueté.

Le Schéma 3.

Les cellules ont été refroidies à 4°C et étiquetées avec du l'anti-clathrin anticorps de réseau lourd et puis fixées avec du paraformaldéhyde (4% dans PBS, mn 20). Pour concevoir les piqûres vêtues par clathrin un anticorps secondaire TRITC-étiqueté a été ajouté, et l'actine filamenteuse a été souillée utilisant FITCphalloidin.

Le fonctionnement de DirectOverlay a été employé pour étalonner l'image de LSCM contre l'image d'AFM comme décrit précédemment. Après étalonnage des images confocales, on peut déterminer quelles piqûres sur la surface correspondent au clathrin-étiquetée comporte dans les images de fluorescence (le Schéma 3).

Pour concevoir le caveolin extérieur, des fibroblastes embryonnaires de souris ont été fixés avec du paraformaldéhyde (4% dans PBS, mn 20) et puis étiquetés avec de l'anticorps anti-caveolin-1. Cet anticorps primaire a été alors souillé utilisant un anticorps secondaire TRITC-étiqueté. De Nouveau, le fonctionnement de DirectOverlay a été employé pour étalonner l'image de LSCM contre l'image d'AFM.

Les images peuvent alors être comparées pour interpréter les caractéristiques techniques extérieures vues par l'AFM (le Schéma 4). Pendant Que les cellules doivent seulement être fixées, non traité de n'importe quelle autre voie, cette représentation combinée permet à l'utilisateur d'obtenir une synthèse de la façon dont de telles structures associent à d'autres structures sur la surface de la cellule.

Le Schéma 4.

Conclusions

La combinaison de l'AFM avec LSCM peut davantage étendre les applications des deux techniques. Du point de vue de la représentation d'AFM, la combinaison avec LSCM et étalonnage des images permet la détermination précise des structures particulières sur la surface des cellules, c.-à-d. cavaeoli et piqûres clathrincoated. Supplémentaire, la représentation de LSCM en combination avec la manipulation à l'aide de l'AFM permet la représentation des procédés en aval de la manipulation de cellules. Les possibilités étendent beaucoup plus loin, avec n'importe quelle combinaison de la manipulation d'AFM et de la représentation de LSCM maintenant possibles.

Source : Instruments de JPK

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît les Instruments de JPK

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:48

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