Visualisasi elemen sampel menggunakan berbagai bentuk mikroskop bergantung tidak hanya pada pembesaran tetapi juga kontras. Dengan demikian, bentuk-bentuk yang berbeda dari mikroskop menawarkan informasi yang berbeda tentang sampel. Laser mikroskop confocal (LSCM) menyediakan informasi tentang lokasi 3D dari komponen, khususnya dalam sampel berlabel dan memiliki keuntungan tambahan termasuk keluar cahaya fokus. Hal ini dapat menyebabkan gambar yang lebih tajam dari sebuah bidang fokus yang diberikan dalam sampel. Kekuatan mikroskop atom (AFM), di sisi lain, menyediakan informasi struktural langsung tentang permukaan sampel. Kombinasi dari kedua bentuk mikroskop bisa menjadi alat yang sangat kuat dalam penelitian sebagai sulit untuk "noda" struktur untuk AFM pencitraan, maka membedakan elemen tertentu pada dasar struktural saja tidak selalu mungkin. Penggunaan label fluorescent dan pencitraan optik slice sesuai dengan permukaan sampel dengan LSCM berarti bahwa, jika dua teknik dapat dikombinasikan maka label pada gambar LCSM bisa cross berkorelasi dengan struktur dicitrakan dengan AFM. Hal ini memiliki manfaat tambahan juga mengkontekstualitaskan lokasi protein berlabel (diidentifikasi dengan LSCM) sehubungan dengan struktur tertentu. JPK NanoWizard II Untuk menggabungkan dua teknik mikroskop dua instrumen yang terpisah perlu dibangun bersama-sama, sehingga tidak mengganggu fungsi yang lain. Kombinasi dari mikroskop Nikon confocal C1 dan JPK NanoWizard ® II memungkinkan pencitraan dari daerah sampel yang sama dengan kedua teknik, sebagai JPK Nano Wisaya ® dirancang untuk dipasang di atas sebuah mikroskop cahaya terbalik. Oleh karena itu ada bottom-up akses ke sampel untuk teknik mikroskop cahaya dan top-down akses untuk stylus AFM. Para JPK NanoWizard ® II hanya memerlukan bahwa tahap Nikon confocal ditukar satu konstruksi yang sangat stabil. Ada jalan cahaya melalui AFM yang berarti bahwa transmisi serta refleksi mikroskop cahaya dapat dilakukan dengan AFM di tempat. Oleh karena itu, perangkat keras dasar dari kedua perangkat pencitraan kompatibel untuk fungsi simultan. Untuk stabilitas pencitraan AFM adalah sangat penting (maka persyaratan untuk tahap lebih stabil). Ini berarti bahwa penggunaan coverglass tipis seperti mendukung sampel untuk AFM pencitraan adalah untuk waktu yang lama sesuai dengan gambar berkualitas tinggi AFM. Namun, untuk gambar optik superior sering lebih baik untuk sampel gambar melalui coverglass tipis, terutama ketika pembesaran tinggi, lensa pencelupan digunakan. Untuk percobaan tersebut, di mana pengguna ingin menggabungkan pencitraan berkualitas tinggi dari kedua sistem, JPK telah merancang pemegang sampel, seperti Biocell , yang memungkinkan pengguna untuk me-mount secara stabil sampel pada coverglass, tanpa mengorbankan kualitas gambar. Selain itu, untuk integrasi sejati, harus ada beberapa cara untuk mengkalibrasi ruang gambar dari dua teknik sehingga mereka dapat tepat overlay. Hal ini diperlukan untuk mengkompensasi tidak dapat dihindari, meskipun kecil, penyimpangan tata ruang yang timbul dari penggunaan optik dalam mikroskop cahaya. Namun, piezos di setiap JPK instrumen linierisasi sedemikian rupa sehingga gambar AFM adalah tepat untuk 3a dalam arah x dan y.. Seperti ada distorsi pada citra optik yang tidak direplikasi di AFM, dalam kebanyakan kasus gambar dari sumber-sumber yang terpisah tidak secara akurat overlay. Hal ini terutama masalah ketika pengguna ingin berkorelasi sinyal neon dengan struktur kecil, seperti lubang endocytic, pada permukaan sel. Overlay gambar dan kemudian satu warping oleh mata melibatkan masukan subjektif signifikan yang rentan terhadap kesalahan. Akurat Kalibrasi Gambar Optik confocal Sebagai gambar AFM dihasilkan menggunakan piezos linierisasi sangat tepat dapat diperlakukan sebagai "real-ruang". Kantilever (pencitraan stylus) dari AFM biasanya raster scan atas permukaan untuk membangun citra. Namun, kantilever ini juga dapat dipindahkan tepat ke titik tetap. Ini berarti bahwa kantilever dapat digunakan untuk mengkalibrasi citra optik dengan empiris menentukan posisi kantilever dalam satu set gambar optik, dimana posisi yang tepat dalam AFM sudah dikenal. Singkatnya, kantilever tersebut akan dipindahkan ke satu set 25 poin secara real-ruang, menggunakan piezos. Pada setiap titik gambar optik diperoleh dan kemudian lokasi ujung dalam gambar optik secara otomatis ditentukan. Fungsi transform kemudian dihitung menggunakan kedua set 25 poin, dan ini mengubah diterapkan pada gambar optik seperti yang diimpor ke dalam perangkat lunak SPM (diperlukan untuk menjalankan JPK NanoWizard AFMs ). Sedemikian rupa gambar optik dikalibrasi dan diimpor ke lingkungan SPM, dalam proses otomatis.  Gambar 1. Kalibrasi gambar LSCM menggunakan fungsi Overlay langsung. Kantilever AFM dapat dicitrakan dalam modus refleksi menggunakan LSCM. Di sini, lima gambar kantilever individu ditumpangkan (A), dan kemudian ditumpangkan atas gambar LSCM sesuai FITC-phalloidin fibroblas embrio tikus berlabel (B). Dalam kasus menggabungkan AFM dengan LSCM gambar optik dari kantilever AFM dihasilkan dalam mode refleksi, yaitu filter emisi dihapus dari depan detektor dan refleksi dari laser eksitasi dari kantilever yang dicitrakan (Gambar 1). Sedemikian rupa posisi kantilever dalam kisaran LSCM gambar dapat dideteksi dengan menggunakan dasarnya jalan cahaya yang sama seperti untuk pencitraan sampel. Gambar 1 menunjukkan overlay dari lima posisi kantilever (A) dengan gambar yang sesuai LSCM FITC-phalloidin fibroblas embrio tikus berlabel (B). Sebagai posisi yang tepat dari kantilever di ruang AFM diketahui, perhitungan posisi ujung yang sesuai dalam gambar LSCM dapat dihitung dan fungsi transformasi menyimpulkan untuk memungkinkan overlay tepat dari dua gambar. Overlay Gambar Optik dikalibrasi dan Gambar AFM Setelah ruang gambar kedua mikroskop telah berkorelasi lintas sejumlah kemungkinan yang menarik muncul. Gambar confocal dapat diimpor ke dalam perangkat lunak AFM untuk memungkinkan pencitraan yang spesifik, daerah diberi label, atau manipulasi daerah tertentu dari sel, dan overlay Pengunjung tepat akurat dapat memetakan komponen label dengan struktur yang sesuai mereka. Sebagai contoh, permukaan sel MDCK ditutupi oleh aktin berbasis mikrovili yang dapat langsung dicitrakan menggunakan AFM dan aktin yang membentuk dasar struktural dari mikrovili dapat dicitrakan dengan LSCM setelah pewarnaan dengan phalloidin fluorescently berlabel. Sebelumnya, perbandingan gambar tersebut tidak menghasilkan overlay langsung dari semua sinyal aktin dengan tonjolan pada permukaan sel, karena sedikit perbedaan di kedua gambar. Namun, setelah kalibrasi dari gambar confocal dan transformasi, overlay gambar confocal dan AFM adalah tepat (Gambar 2).  Gambar 2. Pencitraan Gabungan sel MDCK. Sel MDCK tetap, aktin berlabel FITC-phalloidin. (A) gambar mikroskop confocal dari permukaan monolayer MDCK, menunjukkan permukaan terkait aktin berbasis mikrovili dan persimpangan sel. Gambar AFM (B) dari daerah yang sama telah diproses untuk menghilangkan kelengkungan sel dan hanya berisi informasi tentang tonjolan permukaan (mikrovili). Dalam (C) dua gambar yang dilapis. Sel-sel MDCK itu tetap paraformaldehyde (4% dalam PBS, 20 menit), diberi label dengan FITC-phalloidin dan permukaan atas sel dicitrakan dengan AFM dan LSCM. Dalam gambar confocal (A) sesuai dengan fitur permukaan terkait aktin berbasis mikrovili dan persimpangan sel, di mana aktin berfilamen terlokalisasi. Dalam gambar topografi AFM (B) mikrovili dan persimpangan sel juga jelas. Sebagai gambar AFM berisi informasi struktural dari seluruh permukaan, tidak hanya komponen tertentu, gambar yang telah diproses untuk menghilangkan kelengkungan sel dan hanya menunjukkan tonjolan permukaan yang lebih kecil (mikrovili). Dalam (C) berwarna merah AFM citra telah dilapis dengan fluoresensi hijau. Clathrin dan Caveolin pada fibroblast embrio mouse Mikrovili pada permukaan apikal sel MDCK adalah struktur yang dominan pada permukaan dalam gambar AFM, sehingga overlay yang benar jelas. Namun, ketika sel-sel yang memiliki permukaan yang sangat heterogen yang dicitrakan sangat sulit untuk menetapkan fungsi khusus untuk struktur permukaan yang bervariasi tanpa beberapa bentuk label tertentu. Dalam kasus seperti itu, jika overlay dua jenis gambar tidak kesalahan tepat dalam korelasi silang dapat dibuat. Untuk menunjukkan potensi penggunaan Hamparan langsung untuk menggabungkan LSCM dengan AFM sistem yang lebih kompleks dipilih. Fibroblas embrio sel-sel tikus diberi label dengan baik antibodi anti-caveolin atau anti-clathrin, diikuti dengan antibodi berlabel TRITC sekunder.  Gambar 3. Pencitraan Gabungan lubang dilapisi clathrin pada permukaan sel MEF. Fibroblast embrio tikus diberi label dengan anti-clathrin antibodi rantai berat. Untuk memvisualisasikan lubang dilapisi clathrin antibodi berlabel TRITC sekunder ditambahkan, dan aktin berfilamen bernoda menggunakan FITC-phalloidin. Gambaran dari sel sebagai AFM topografi (A), berlabel aktin (B), dan overlay dari dua (C) disediakan. Sebuah resolusi yang lebih tinggi AFM topografi (D) diakuisisi seperti gambar LSCM (E) suatu daerah menunjukkan berlabel clathrin pada permukaan sel. Overlay dua gambar (F) menunjukkan bahwa label neon sesuai dengan lubang pada permukaan sel. Zoom elektronik topografi dari satu bidang yang relevan (ditandai dalam F) disajikan dalam (G). Sel-sel didinginkan sampai 4 ° C dan diberi label dengan anti-clathrin antibodi rantai berat dan kemudian tetap dengan paraformaldehyde (4% dalam PBS, 20 menit). Untuk memvisualisasikan lubang dilapisi clathrin antibodi berlabel TRITC sekunder ditambahkan, dan aktin berfilamen ternoda menggunakan FITCphalloidin. Fungsi DirectOverlay digunakan untuk mengkalibrasi citra LSCM terhadap gambar AFM seperti yang dijelaskan sebelumnya. Setelah kalibrasi gambar confocal, seseorang dapat menentukan lubang-lubang pada permukaan sesuai dengan clathrin-label fitur dalam gambar fluoresensi (Gambar 3). Untuk memvisualisasikan permukaan caveolin, fibroblas embrio tikus itu tetap paraformaldehyde (4% dalam PBS, 20 menit) dan kemudian diberi label dengan anti-caveolin-1 antibodi. Ini antibodi primer kemudian diwarnai menggunakan antibodi berlabel TRITC sekunder. Sekali lagi, fungsi DirectOverlay digunakan untuk mengkalibrasi citra LSCM terhadap gambar AFM. Gambar kemudian dapat dibandingkan untuk menafsirkan fitur permukaan terlihat oleh AFM (Gambar 4). Seperti sel-sel hanya perlu diperbaiki, tidak diperlakukan dengan cara lain, ini pencitraan dikombinasikan memungkinkan pengguna untuk mendapatkan gambaran bagaimana struktur seperti berhubungan dengan struktur lain pada permukaan sel.  Gambar 4. Pencitraan Gabungan caveolae pada permukaan sel MEF. Fibroblast embrio tikus itu tetap paraformaldehyde dan kemudian diberi label dengan anti-caveolin-1 antibodi. Ini antibodi primer kemudian diwarnai menggunakan antibodi berlabel TRITC sekunder. AFM gambaran topografi citra sel diperoleh (A) dan ruang gambar LSCM dikalibrasi untuk memungkinkan perbandingan AFM dan LSCM. Sebuah resolusi yang lebih tinggi AFM gambar diakuisisi (B) dan dibandingkan dengan gambar yang sesuai dari permukaan LSCM terkait caveolae (C). Overlay disajikan dalam (D), dan zoom ke daerah ditandai dengan (E). Kesimpulan Kombinasi AFM dengan LSCM dapat lebih memperluas aplikasi dari kedua teknik. Dari sudut pandang pencitraan AFM, kombinasi dengan LSCM dan kalibrasi gambar memungkinkan penentuan yang tepat dari struktur tertentu pada permukaan sel, yaitu cavaeoli dan lubang clathrincoated. Selain itu, pencitraan LSCM dalam kombinasi dengan manipulasi dengan menggunakan AFM memungkinkan pencitraan proses hilir dari manipulasi sel. Kemungkinan memperpanjang lebih jauh, dengan kombinasi AFM manipulasi dan pencitraan LSCM sekarang mungkin. |