Combinazione Microscopia Atomica della Forza e del Laser che Scandiscono Microscopia Confocale Facendo Uso della Strumentazione dagli Strumenti di JPK

Argomenti Coperti

Sfondo

JPK Nanowizard II

Calibratura Accurata delle Immagini Ottiche Confocali

Foglio Di Prova delle Immagini Ottiche Calibrate e delle Immagini del AFM

Clathrin e Caveolin sui Fibroblasti Embrionali del Mouse

Conclusioni

Sfondo

La visualizzazione degli elementi di campione facendo uso di vari moduli di microscopia conta non solo su ingrandimento ma egualmente contrappone. Come tale, moduli differenti di informazioni differenti di offerta di microscopia su un campione. Il Laser che scandisce la microscopia confocale (LSCM) fornisce informazioni sulla posizione 3D di un particolare, contrassegnata componente all'interno di un campione e presenta il vantaggio supplementare di esclusione dall'indicatore luminoso del fuoco. Ciò può piombo alle immagini più marcate di un piano focale dato in un campione. La microscopia Atomica della forza (AFM), d'altra parte, fornisce informazioni strutturali dirette sulla superficie di un campione. La combinazione di questi due moduli di microscopia potrebbe essere uno strumento molto potente nella ricerca poichè è difficile “da macchiare„ le strutture per la rappresentazione del AFM, quindi distinguere gli elementi specifici su una base strutturale da solo non è sempre possibile. L'uso dei contrassegni e della rappresentazione fluorescenti la fetta ottica che corrisponde alla superficie del campione a LSCM significa quello, se le due tecniche possono essere poi contrassegno combinato nell'immagine di LCSM possono essere incrocio correlato alle strutture imaged con il AFM. Ciò ha il vantaggio aggiunto anche di contextualizing la posizione delle proteine contrassegnate (identificate con LSCM) riguardo alle strutture specifiche.

JPK Nanowizard II

per combinare le due tecniche che di microscopia i due strumenti separati devono essere costruiti insieme, tali che nessuno disturba la funzione dell'altra. La combinazione del microscopio confocale di Nikon C1 e del JPK Nanowizard®II permette la rappresentazione della stessa area del campione con entrambe le tecniche, poichè il JPK Wizard® Nano è destinato per essere installato sopra un microscopio ottico invertito. Quindi c'è accesso dal basso al campione per le tecniche di microscopia leggera ed accesso dall'alto in basso per lo stilo del AFM. Il JPK NanoWizard®II richiede soltanto che la fase del Nikon confocale sia scambiata per uno di costruzione altamente stabile. C'è un percorso leggero attraverso il AFM che significa che quella microscopia leggera del riflesso come pure della trasmissione può essere condotta con il AFM sul posto. Quindi, i fissaggi base delle due unità di rappresentazione sono compatibili per il funzionamento simultaneo.

Per la stabilità della rappresentazione del AFM è estremamente importante (quindi il requisito della fase più stabile). Ciò ha significato che l'uso dei coverglass sottili come contributi del campione alla rappresentazione del AFM era a lungo incompatibile con le immagini del AFM di alta qualità. Tuttavia, dato che immagini ottiche superiori è spesso migliore ai campioni di immagine attraverso i coverglass sottili, specialmente quando l'alto ingrandimento, lenti di immersione è usato. Per tali esperimenti, dove l'utente desidera combinare la rappresentazione di alta qualità da entrambi i sistemi, JPK ha progettato i supporti del campione, quale il BioCell, che permettono che l'utente monti stabile i campioni sui coverglass, senza qualità di compromesso di immagine.

Ulteriormente, per integrazione vera, ci deve essere un certo modo calibrare lo spazio di immagine delle due tecniche in moda da poterli sovrapporre precisamente essi. Ciò è necessaria da compensare le aberrazioni inevitabili, anche se piccole, spaziali che risultano dall'uso dell'ottica nel microscopio ottico. Tuttavia, i piezos in ogni strumento di JPK sono linearizzati tali che l'immagine del AFM è precisa a 3Å nelle direzioni di y e di x. Poichè c'è deformazione nell'immagine ottica che non è ripiegata nel AFM, nella maggior parte dei casi le immagini dalle sorgenti separate non ricoprono esattamente. Ciò è specialmente un problema quando l'utente desidera correlare i segnali fluorescenti con le piccole strutture, quali i pozzi endocytic, sulla superficie di una cella.

Sovrapporre le immagini e poi deformare uno dall'occhio comprendono l'input soggettivo significativo che è ad errore incline.

Calibratura Accurata delle Immagini Ottiche Confocali

Mentre l'immagine del AFM è generata facendo uso dei piezos linearizzati molto precisi può essere trattata come “lo reale-spazio„. La trave a mensola (stilo di rappresentazione) del AFM è solitamente quadro televisivo scandito sopra la superficie per sviluppare un'immagine. Tuttavia, questa trave a mensola può anche essere mossa precisamente verso i punti fissi. Ciò significa che la trave a mensola può essere usata per calibrare l'immagine ottica empiricamente determinando la posizione a mensola in un insieme delle immagini ottiche, dove la posizione precisa nel AFM già è conosciuta. In Breve, la trave a mensola è mossa verso un insieme di 25 punti nello reale-spazio, facendo uso dei piezos. Ad ogni punto un'immagine ottica si acquista e successivamente la posizione del suggerimento all'interno dell'immagine ottica è determinata automaticamente. Una funzione della trasformazione poi è calcolata facendo uso di entrambi gli insiemi di 25 punti e questa trasforma applicato all'immagine ottica mentre è incluso nel software di SPM (richiesto per l'esecuzione del JPK NanoWizard AFMs). In tale maniera l'immagine ottica è calibrata ed inclusa nell'ambiente di SPM, in un trattamento automatizzato.

Figura 1.

Nel caso della combinazione del AFM con LSCM l'immagine ottica della trave a mensola del AFM è generata nel modo del riflesso, cioè il filtro dall'emissione è rimosso davanti al rivelatore ed il riflesso del laser di eccitazione dalla trave a mensola è imaged (Figura 1). In tale maniera la posizione a mensola all'interno dell'intervallo di immagine di LSCM può essere individuata facendo uso essenzialmente dello stesso percorso leggero di per la rappresentazione il campione. Figura 1 mostra che un foglio di prova di cinque delle posizioni a mensola (A) con l'immagine corrispondente di LSCM di FITC-phalloidin ha contrassegnato il mouse fibroblasti embrionali (B). Mentre la posizione precisa della trave a mensola nello spazio del AFM è conosciuta, il calcolo della posizione corrispondente del suggerimento nelle immagini di LSCM può essere calcolato e una funzione di trasformazione essere dedotto per permettere i fogli di prova precisi delle due immagini.

Foglio Di Prova delle Immagini Ottiche Calibrate e delle Immagini del AFM

Una Volta Che lo spazio di immagine di entrambi i microscopi inter-è stato correlato una serie di possibilità interessanti sorgono.

L'immagine confocale può essere inclusa nel software del AFM per permettere la rappresentazione di specifico, essere contrassegnata aree, o essere manipolazione delle regioni specifiche della cella ed i fogli di prova offline precisi possono mappare esattamente le componenti contrassegnate alle loro strutture corrispondenti. Per esempio, la superficie delle celle di MDCK è coperta ai dai microvilli basati a actina che possono essere direttamente imaged facendo uso del AFM e l'actina che si forma la base strutturale dei microvilli può essere imaged con LSCM dopo la macchiatura con il phalloidin fluorescente contrassegnato.

Precedentemente, il confronto tra tali immagini non non piombo e per dirigere il foglio di prova di tutto segnale dell'actina con le sporgenze alla superficie la cella, dovuto le leggere differenze in entrambe le immagini. Tuttavia, dopo la calibratura dell'immagine e della trasformazione confocali, il foglio di prova delle immagini del AFM e confocali è preciso (Figura 2).

Figura 2.

Le celle di MDCK sono state fissate con paraformaldeide (4% in PBS, minuto 20), contrassegnato con FITC-phalloidin e la superficie superiore delle celle era imaged con il AFM e LSCM. Nell'immagine confocale (A) le funzionalità corrispondono ai microvilli basati a actina associati superficie ed alle giunzioni delle cellule, in cui l'actina filamentosa è localizzata. Nell'immagine topografica del AFM (B) i microvilli e le giunzioni delle cellule sono egualmente evidenti. Poichè l'immagine del AFM contiene le informazioni strutturali di intero di superficie, non appena le componenti specifiche, l'immagine è stata elaborata per rimuovere la curvatura delle celle e per mostrare appena le più piccole sporgenze di superficie (microvilli). Dentro (C) dell'l'immagine colorata rosso del AFM è stata sovrapposta di fluorescenza verde.

Clathrin e Caveolin sui Fibroblasti Embrionali del Mouse

I microvilli alla superficie apicale delle celle di MDCK sono la struttura dominante sulla superficie nelle immagini del AFM, in modo dal foglio di prova corretto è chiaro. Tuttavia, quando le celle che hanno una superficie molto eterogenea sono imaged è estremamente difficile da definire le funzioni specifiche alle varie strutture di superficie senza certo modulo del contrassegno specifico. In tal caso, se il foglio di prova dei due tipi di immagini non è preciso gli errori nella correlazione trasversale possono essere fatti. Per dimostrare il potenziale dell'uso del Foglio Di Prova Diretto per la combinazione del LSCM con il AFM un più sistema complesso è stato scelto. Le celle embrionali del fibroblasto del Mouse sono state contrassegnate con l'anticorpo anti--caveolin o anti--clathrin, seguito da un anticorpo secondario TRITC-contrassegnato.

Figura 3.

Le celle sono state raffreddate a 4°C e sono state contrassegnate con l'anticorpo anti--clathrin della catena pesante e poi sono state fissate con paraformaldeide (4% in PBS, minuto 20). Per visualizzare i pozzi ricoperti clathrin un anticorpo secondario TRITC-contrassegnato si è aggiunto e l'actina filamentosa è stata macchiata facendo uso di FITCphalloidin.

La funzione di DirectOverlay è stata usata per calibrare l'immagine di LSCM contro l'immagine del AFM come descritto precedentemente. Dopo la calibratura delle immagini confocali, si può determinare quali pozzi sulla superficie corrispondono al clathrin-contrassegnata caratterizza nelle immagini della fluorescenza (Figura 3).

Per visualizzare il caveolin di superficie, i fibroblasti embrionali del mouse sono stati fissati con paraformaldeide (4% in PBS, minuto 20) e poi sono stati contrassegnati con l'anticorpo anti-caveolin-1. Questo anticorpo primario poi è stato macchiato facendo uso di un anticorpo secondario TRITC-contrassegnato. Di Nuovo, la funzione di DirectOverlay è stata usata per calibrare l'immagine di LSCM contro l'immagine del AFM.

Le immagini possono poi essere confrontate per interpretare le funzionalità di superficie vedute dal AFM (Figura 4). Mentre le celle devono soltanto essere fissate, non trattato in qualunque altro modo, questa rappresentazione combinata permette che l'utente ottenga una generalità di come tali strutture si riferiscono ad altre strutture alla superficie della cella.

Figura 4.

Conclusioni

La combinazione di AFM con LSCM può più ulteriormente estendere le applicazioni di entrambe le tecniche. Dal punto di vista della rappresentazione del AFM, la combinazione con LSCM e la calibratura delle immagini permette la determinazione precisa delle strutture particolari alla superficie delle celle, cioè cavaeoli e pozzi clathrincoated. Ulteriormente, la rappresentazione di LSCM congiuntamente a manipolazione usando il AFM permette la rappresentazione dei trattamenti a valle della manipolazione delle cellule. Le possibilità ora estendono molto di più, con tutta la combinazione di manipolazione del AFM e di rappresentazione di LSCM possibili.

Sorgente: Strumenti di JPK

Per ulteriori informazioni su questa sorgente visualizzi prego gli Strumenti di JPK

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:56

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit