共焦点の顕微鏡検査をスキャンする原子力の顕微鏡検査およびレーザーの結合

カバーされるトピック

背景

JPK Nanowizard II

共焦点の光学画像の正確な口径測定

目盛りを付けられた光学画像および AFM の画像のオーバーレイ

マウス萌芽期の繊維芽細胞の Clathrin そして Caveolin

結論

背景

さまざまな形の顕微鏡検査を使用してサンプル要素の視覚化は拡大にだけ頼りますが、また対比します。 したがって、サンプルについての顕微鏡検査の提供の別の情報の相違形式。 共焦点の顕微鏡検査をスキャンするレーザーは (LSCM)サンプル内のコンポーネントと分類される点の 3D 位置についての情報を提供し、焦点ライトから除く追加利点があります。 これはサンプルのある特定の焦点面のシャープなイメージの原因となる場合があります。 原子力の顕微鏡検査は (AFM)、一方では、サンプルの表面についての直接構造的情報を提供します。 顕微鏡検査のこれら二つの形式の組合せはそれ故に単独で構造基礎の特定の要素を区別することが可能常にではない」 AFM イメージ投射のための構造を汚すことは困難 「であるので研究の非常に強力なツールであることができます。 蛍光ラベルおよびイメージ投射の使用は LSCM のサンプル表面に相当する光学スライス 2 つの技術が AFM に視覚化された構造に関連する十字である場合もあれば結合された LCSM の画像のそれから分類である場合もあれば、それを意味します。 これに特定の構造に関してまた分類された蛋白質の位置を (LSCM と識別される) 前後関係に置くことの追加された利点があります。

JPK Nanowizard II

どちらも他の機能を妨げないこと 2 つの別の器械が一緒に構築される必要がある 2 つの顕微鏡検査の技術を結合するためそのような物。 Nikon C1 の共焦点の顕微鏡および JPK Nanowizard®II の組合せは JPK Nano Wizard® が逆にされた光学顕微鏡の上にインストールされるように設計されているので、両方の技術の同じサンプル領域のイメージ投射を可能にします。 それ故に AFM スタイラスの光学顕微鏡検査の技術のためのサンプルへの上昇形アクセスそしてトップダウンアクセスがあります。 共焦点非常に安定した構築の 1 のために Nikon の段階が交換されることだけを JPK NanoWizard®II は必要とします。 その伝達、また反射の光学顕微鏡検査は AFM と行なうことができることを意味する AFM を通って軽い経路があります。 それ故に、 2 つの撮像装置のベーシックハードウェアは同時作用のために互換性があります。

AFM イメージ投射安定性のために非常に重要です (それ故により安定した段階のための条件)。 これは AFM イメージ投射のためのサンプルサポートとして薄い coverglass の使用が良質 AFM の画像に長い間対応しなかったことを意味しました。 ただし、なぜなら優秀な光学画像それは頻繁に特に高い拡大、液浸レンズが使用されるとき、薄い coverglass を通して画像のサンプルによりよいです。 ユーザーが両方のシステムからの良質イメージ投射を結合したいそのような実験のために、 JPK は妥協の画像の品質なしでユーザーが固定して coverglass にサンプルを取付けることを可能にするサンプルホールダーを、 BioCell のような設計しました。

さらにそれらが正確にオーバーレイをすることができるように、本当の統合のために、 2 つの技術の像空間に目盛りを付ける方法がなければなりません。 これは光学顕微鏡の光学の使用から起こる不可避、とはいえ小さく、空間的な異常を補正して必要です。 ただし、各 JPK の器械の piezos は AFM の画像が x および y の方向の 3Å に精密であることそのような物一直線に並べられます。 AFM で複製されない光学画像にゆがみがあるので、ほとんどの場合別のソースからの画像は正確に上にありません。 これはユーザーが小さい構造に蛍光シグナルを、セルの表面の endocytic ピットのような、関連させたいとき特に問題です。

画像をオーバーレイをし、次に目によって 1 つを歪めることはエラーを起こしやすい重要で主観的な入力を含みます。

共焦点の光学画像の正確な口径測定

AFM の画像は非常に精密な一直線に並べられた piezos を使用して生成されると同時に 「実質スペース」として扱うことができます。 AFM の片持梁 (イメージ投射スタイラス) は通常画像を構築するために表面にスキャンされるラスターです。 ただし、この片持梁はまた固定小数点に正確に移動することができます。 これは光学画像に目盛りを付けるのに片持梁が経験的に AFM の精密な位置が既に知られている一組の光学画像ことをの片持梁位置を定めることによって使用することができることを意味します。 つまり、片持梁は piezos を使用して一組の実質スペースの 25 ポイントに、移動されます。 各ポイントで光学画像は得られ、続いて光学画像内の先端の位置は自動的に定められます。 変形機能は 25 ポイントの両方のセットを使用してそれから計算され、 SPM のソフトウェアにインポートされると同時にこれは光学画像に応用を変形させます (JPK NanoWizard AFMs を実行するために必要な)。 そのような方法では光学画像は自動化されたプロセスの SPM の環境に、目盛りが付き、インポートされます。

直接オーバーレイ機能を使用して LSCM の画像の図 1. 口径測定。 AFM の片持梁は LSCM を使用して反射のモードで視覚化されます。 ここでは、 5 つの個々の片持梁画像は重ねられた (a) であり、 FITC-phalloidin の対応する LSCM の画像にそれから重ねられてマウスを萌芽期の繊維芽細胞と (b) 分類しました。

LSCM と AFM を結合することの場合には AFM の片持梁の光学画像は反射のモードで生成されます、すなわち放出フィルターは探知器の前にから除去され、片持梁からの刺激レーザーの反射は視覚化されています (図 1)。 そのような方法で LSCM の画像の範囲内の片持梁位置はを使用してイメージ投射のためのと同じ軽い経路サンプル本質的に検出することができます。 FITC-phalloidin の対応する LSCM の画像の片持梁位置 (a) の 5 のオーバーレイがマウスを萌芽期の繊維芽細胞と (b) 分類したことを図 1 は示します。 AFM スペースの片持梁の精密な位置が知られていると同時に、 LSCM の画像の対応する先端の位置の計算は 2 つの画像の精密なオーバーレイを可能にするために計算される推論することができ、変形機能。

目盛りを付けられた光学画像および AFM の画像のオーバーレイ

両方の顕微鏡の像空間が交差関連したらいくつかの興味深い可能性は起こります。

共焦点の画像は AFM のソフトウェアにセルの特定の領域の領域許可するために、か処理と分類される特定のイメージ投射をインポートし精密なオフ・ラインオーバーレイは対応する構造に正確に分類されたコンポーネントをマップできます。 例えば、 MDCK のセルの表面は AFM を使用して直接視覚化されます形作り、アクチンが微絨毛の構造基礎蛍光に分類された phalloidin との汚損の後で LSCM と視覚化されますアクチンベースの微絨毛によってカバーされます。

以前は、そのような画像の比較は表面で突起のアクチンシグナルすべてのオーバーレイを指示するためにセル、両方の画像のわずかな相違が原因で導きませんでした。 ただし、共焦点の画像および変形の口径測定の後に、共焦点および AFM の画像のオーバーレイは精密です (図 2)。

図 2. MDCK のセルの結合されたイメージ投射。 固定 MDCK のセル、 FITC-phalloidin と分類されるアクチン。 (a) MDCK の単一層の表面の共焦点の顕微鏡検査の画像、表面準のアクチンベースの微絨毛およびセル接続点を示します。 同じ領域の AFM の画像 (b) はセルの湾曲を取除き、ちょうど表面の突起 (微絨毛) についての情報を含むために処理されました。 (c) 2 つの画像でオーバーレイをされます。

MDCK のセルはパラホルムアルデヒド (PBS の 4%、 20 分分類された) と、 FITC-phalloidin と固定され、セルの表面は AFM および LSCM と視覚化されていました。 共焦点の画像 (a) では機能は表面関連アクチンベースの微絨毛および糸状のアクチンが集中するセル接続点に対応します。 AFM の地勢画像 (b) で微絨毛およびセル接続点はまた明白です。 AFM の画像が全表面の構造的情報を含んでいるのでセルの湾曲を取除き、ちょうどより小さい表面の突起 (微絨毛) を示すために、ちょうど特定のコンポーネントは、画像処理されました。 (c) 赤色の AFM の画像で緑の蛍光性とオーバーレイをされました。

マウス萌芽期の繊維芽細胞の Clathrin そして Caveolin

MDCK のセルの頂点の表面の微絨毛は AFM の画像の表面の支配的な構造です、従って正しいオーバーレイは明確です。 ただし、非常に異質表面があるセルが視覚化されているとき特定のラベルの形式なしでさまざまな表面の構造に特定の機能を割り当てることは非常に困難です。 このような場合 2 つのタイプの画像のオーバーレイが精密でなければ、クロス相関の間違えることができます。 AFM と LSCM を結合するための直接オーバーレイの使用の潜在性を示すためには複雑なシステムは選択されました。 マウス萌芽期の繊維芽細胞のセルは TRITC 分類された二次抗体に先行している反caveolin または反clathrin 抗体と分類されました。

図 3. は MEF のセルの表面で clathrin によって塗られたピットのイメージ投射を結合しました。 マウス萌芽期の繊維芽細胞は反clathrin 重鎖の抗体と分類されました。 Clathrin によって塗られたピットを視覚化するためには TRITC 分類された二次抗体は追加され、糸状のアクチンは FITC-phalloidin を使用して汚れました。 アクチン (b)、および 2 (c) のオーバーレイと分類される AFM の地形 (a) としてセルの概要は提供されます。 セル表面で分類された clathrin を表わす領域の LSCM の画像 (e) があったように高リゾリューション AFM の地形 (d) は得られました。 2 つの画像 (f) のオーバーレイは蛍光ラベルがセル表面でピットに対応することを示します。 1 つの関連した領域からの地形の電子ズームレンズ (F) で (G) で示されますマークされる。

セルは 4°C に冷却され、反clathrin 重鎖の抗体と分類され、そして次にパラホルムアルデヒド (PBS の 4%、 20 分) と固定されました。 Clathrin によって塗られたピットを視覚化するためには TRITC 分類された二次抗体は追加され、糸状のアクチンは FITCphalloidin を使用して汚れました。

DirectOverlay 機能が前に記述されているように AFM の画像に対して LSCM の画像に目盛りを付けるのに使用されました。 共焦点の画像の口径測定の後で、 1 つは clathrin 分類される蛍光性の画像 (図 3) でに表面のどのピットが特色になる対応するか定めることができます。

表面の caveolin を視覚化するためには、マウス萌芽期の繊維芽細胞はパラホルムアルデヒド (PBS の 4%、 20 分) と固定され、次に反caveolin 1 抗体と分類されました。 この一次抗体は TRITC 分類された二次抗体を使用してそれから汚れました。 再度、 DirectOverlay 機能が AFM の画像に対して LSCM の画像に目盛りを付けるのに使用されました。

画像は AFM (図 4) によって見られる表面機能を解読するためにそれから比較することができます。 セルが修復される必要があると同時に他のどの方法でも扱われなくて、この結合されたイメージ投射は得ることをそのような構造がセルの表面で他の構造にどのようにだけの関連しているかユーザーが概要を可能にします。

図 4. は MEF のセルの表面で caveolae のイメージ投射を結合しました。 マウス萌芽期の繊維芽細胞はパラホルムアルデヒドと固定され、次に反caveolin 1 抗体と分類されました。 この一次抗体は TRITC 分類された二次抗体を使用してそれから汚れました。 セルの概要 AFM の地形の画像は得られた (a) および AFM および LSCM の比較を許可するために目盛りが付いていた LSCM の像空間でした。 高リゾリューション AFM の画像は得られた (b) であり、表面の対応する LSCM の画像と比較されて caveolae (c) を関連付けました。 オーバーレイは (d) および (e) のマーク付き領域にズームレンズで示されます。

結論

LSCM との AFM の組合せは更に両方の技術のアプリケーションを拡張できます。 AFM イメージ投射の視点から、画像の LSCM そして口径測定との組合せはセル、すなわち cavaeoli および clathrincoated ピットの表面で特定の構造の精密な決定を可能にします。 さらに、 AFM の使用による処理と組み合わせた LSCM イメージ投射はセル処理の下流でプロセスのイメージ投射を可能にします。 可能性は可能な AFM の処理および LSCM イメージ投射のあらゆる組合せとの大いにそれ以上を、今伸ばします。

ソース: JPK の器械

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