JPK 계기에서 장비를 사용하는 Confocal 현미경 검사법 검사 원자 군대 현미경 검사법 및 레이저 결합

커버되는 토픽

배경

JPK Nanowizard II

Confocal 광학적인 심상의 정확한 구경측정

측정된 광학적인 심상 및 AFM 심상의 오바레이

마우스 미발달 섬유아세포에 Clathrin 그리고 Caveolin

결론

배경

다양한 형태 현미경 검사법을 사용하여 견본 성분의 구상은 확대를 뿐만 아니라 의지하고 또한 대조합니다. 따라서, 견본에 관하여 현미경 검사법 제안 다른 정보의 다른 양식. confocal 현미경 검사법을 검사하는 레이저에는 (LSCM) 견본 내의 분대이라고 레테르를 붙인 특정의 3D 위치에 관하여 정보를 제공하고 빛 탈초점 제외의 추가 이점이 있습니다. 이것은 견본에 있는 주어진 촛점면의 날카로운 이미지로 이끌어 낼 수 있습니다. 원자 군대 현미경 검사법은 (AFM), 다른 한편으로는, 견본의 표면에 관하여 직접 구조상 정보를 제공합니다. 현미경 검사법의 이러한 두 종류 양식의 조합은 그러므로 혼자 구조상 기초에 특정 성분을 구별하는 것이 항상 가능하지 않은" AFM 화상 진찰을 위한 구조물을 얼룩이 지기 것은 어렵기 "때문에 연구에 있는 아주 강력한 공구일 수 있었습니다. 형광성 레이블 및 화상 진찰의 사용은 LSCM를 가진 견본 표면에 일치하는 광학적인 조각 2개의 기술이 AFM와 imaged 구조물에 상관된 십자가일 수 있으면 결합한 LCSM 심상에서 그 때 레테르를 붙이는일 수 있는 경우에, 그것을 의미합니다. 이것에는 특정 구조물에 관하여 또한 (LSCM로 확인되는) 레테르를 붙인 단백질의 위치 맥락화의 추가한 이득이 있습니다.

JPK Nanowizard II

어느 쪽도 아니가 그 외의 기능을 방해하지 않다 2개의 분리되는 계기가 함께 건축될 필요가 있는 2개의 현미경 검사법 기술을 결합하기 위하여, 그 같은. Nikon C1 confocal 현미경 및 JPK Nanowizard®II의 조합은 JPK Nano Wizard®가 거꾸로 하기 가벼운 현미경의 위에 설치되기 위하여 디자인되기 때문에, 두 기술 전부를 가진 동일 견본 지역의 화상 진찰을 허용합니다. 그러므로 AFM 첨필을 위한 가벼운 현미경 검사법 기술을 위한 견본에 상향식 접근 그리고 포괄적인 접근이 있습니다. confocal 고도로 안정된 건축의 하나를 위해 Nikon의 단계가 교환되도록 JPK NanoWizard®II는 단지 요구합니다. 그 전송 뿐 아니라 반영 가벼운 현미경 검사법은 그 자리에 AFM로 수행될 수 있다는 것을 의미하는 AFM를 통해서 가벼운 경로가 있습니다. 그러므로, 2개의 이미지화 장치의 기본 하드웨어는 동시 작용을 위해 양립합니다.

AFM 화상 진찰 안정성을 위해 매우 중요합니다 (그러므로 안정되어 있는 단계를 위한 필수품). 이것은 AFM 화상 진찰을 위한 견본 지원으로 얇은 coverglass의 사용이 장시간에 고품질 AFM 심상에 호환되지 않았다는 것을 의미했습니다. 그러나 특히 높은 확대, 침수 렌즈가 사용될 때, 왜냐하면 우량한 광학적인 심상 수시로 얇은 coverglass를 통해서 심상 견본에 더 낫습니다. 사용자가 두 시스템 전부에서 고품질 화상 진찰을 결합하는 것을 바라는 그 같은 실험을 위해, JPK는 타협 심상 질 없이 사용자가 안정적으로 coverglass에 견본을 거치하는 것을 허용하는 견본 홀더를 BioCell와 같은 디자인했습니다.

그(것)들이 정확하게 입힐 수 있다 그래야 게다가, 확실한 통합을 위해, 2개의 기술의 심상 공간을 측정하는 어떤 쪽이 이어야 합니다. 이것은 가벼운 현미경에 있는 광학의 사용에서 발생하는 피할 수 없는, 이기는 하지만 작은, 공간 착오를 보상하기 위하여 필요합니다. 그러나, 각 JPK 계기에 있는 piezos는 AFM 심상이 x와 y 방향에 있는 3Å에 정확하다 그 같은이라고 linearized. AFM에서 복제되지 않는 광학적인 심상에 있는 찡그림이 있기 때문에, 대부분의 경우에 분리되는 근원에서 심상은 정확하게 투영하지 않습니다. 이것은 사용자가 작은 구조물과 형광성 신호를 세포의 표면에 endocytic 구덩이와 같은 상관할 것을 바랄 때 특히 문제입니다.

심상을 입히고 그 후에 눈에 의하여 1개를 휘게 하는 것은 에러를 일으키기 쉬운 중요한 주관적인 입력을 관련시킵니다.

Confocal 광학적인 심상의 정확한 구경측정

AFM 심상은 아주 정확한 linearized piezos를 사용하여 생성되는 때 "실제 공간"로 취급될 수 있습니다. AFM의 외팔보 (화상 진찰 첨필)는 일반적으로 심상을 건설하기 위하여 표면에 검사된 점방식 입니다. 그러나, 이 외팔보는 또한 고정점으로 정확하게 수 있습니다. 이것은 광학적인 심상을 측정하기 위하여 외팔보가 실험적으로 AFM에 있는 정확한 위치가 이미 알려지는 광학적인 심상의 세트에 있는 공가 위치를 결정해서 사용될 수 있다는 것을 의미합니다. 한마디로 말하면, 외팔보는 piezos를 사용하여 실제 공간에 있는 25 점의 세트로. 각 점에 광학적인 심상은 취득되고 연속적으로 광학적인 심상 내의 끝 위치는 자동적으로 결정됩니다. 변형시키 기능은 25 점의 두 세트 전부를 사용하여 그 때 산출되고, (JPK NanoWizard AFMs를 달리기를 위해 요구되는) SPM 소프트웨어로 가져오는 때 이것은 광학적인 심상에 적용되는 변형시킵니다. 그런 쪽에서는 광학적인 심상은 자동화된 프로세스에서 SPM 환경으로, 측정되고 가져옵니다.

숫자 1.

LSCM와 AFM 결합의 경우에 AFM 외팔보의 광학적인 심상은 반영 최빈값에서 생성됩니다, i.e 방출 필터는 검출기의 앞에에서 제거되고 외팔보에서 흥분 레이저의 반영은 imaged 입니다 (숫자 1). 그런 방법으로 LSCM 심상 범위 내의 공가 위치는을 사용하여 화상 진찰을 위한과 동일 가벼운 경로 견본 필수적으로 검출될 수 있습니다. 마우스가 FITC-phalloidin의 대응 LSCM 심상을 가진 외팔보 위치 (a)의 5의 오바레이에 의하여 미발달 섬유아세포이라고 (b) 레테르를 붙였다는 것을 숫자 1은 보여줍니다. AFM 공간에 있는 외팔보의 정확한 위치가 알려지는 때, LSCM 심상에 있는 대응 끝 위치의 계산은 2개의 심상의 정확한 오바레이를 허용하기 위하여 산출되 추론될 수 있고 변형시키 기능.

측정된 광학적인 심상 및 AFM 심상의 오바레이

일단 두 현미경 전부의 심상 공간이 십자가 상관되면 다수 흥미로운 가능성은 발생합니다.

confocal 심상은 AFM 소프트웨어로 또는 조작이라고 레테르를 붙인 특정의 화상 진찰을 세포의 특이 부위의 지역 허용하기 위하여, 가져오골, 정확한 따로 잇기 오바레이는 그들의 대응 구조물에 정확하게 레테르를 붙인 분대를 지도로 나타낼 수 있습니다. 예를 들면, MDCK 세포의 표면은 AFM를 사용하여 직접 imaged 일 수 있는 형성하고 악틴이 미융모의 구조상 기초 형광성으로 레테르를 붙인 phalloidin로 얼룩이 지기 후에 LSCM에 imaged 일 수 있는 악틴 기지를 둔 미융모에 의해 커버됩니다.

이전에, 그 같은 심상의 비교는 세포, 두 심상 전부에 있는 경미한 다름 때문에 표면에 돌출을 가진 악틴 신호 모두의 오바레이를 지시하기 위하여 지도하지 않았습니다. 그러나, confocal 심상 및 전이의 구경측정 후에, confocal 및 AFM 심상의 오바레이는 정확합니다 (숫자 2).

숫자 2.

MDCK 세포는 FITC-phalloidin로 레테르를 붙인 paraformaldehyde (PBS에서 4%, 20 분)로 고쳐지고 세포의 윗 표면은 AFM와 LSCM에 imaged 이었습니다. confocal 심상 (a)에서는 특징은 표면 관련 악틴 기지를 둔 미융모 및 실같은 악틴이 지방화되는 세포 접속점에 대응합니다. AFM 지형도 작성 심상 (b)에서 미융모 및 세포 접속점은 또한 명백합니다. AFM 심상이 전체적인 지상의 구조상 정보를 포함하기 때문에, 다만 특정 소자는, 심상 세포의 곡율을 제거하고 다만 더 작은 지상 돌출 (미융모)를 보여주기 위하여 가공되었습니다. (c) 빨갛 착색된 AFM 심상에서 녹색 형광으로 입혔습니다.

마우스 미발달 섬유아세포에 Clathrin 그리고 Caveolin

MDCK 세포의 정점 표면에 미융모는 AFM 심상에 있는 표면에 지배적인 구조물입니다, 그래서 정확한 오바레이는 명확합니다. 그러나, 아주 이질적인 표면이 있는 세포에는 imaged 때 특정 레이블의 어떤 양식 없이 각종 지상 구조물에 특정 기능을 할당하는 것은 극단적으로 어렵습니다. 심상의 2가지의 모형의 오바레이가 정확하지 않은 경우에 그러한 경우에, 상호 상관에 있는 실수될 수 있습니다. AFM와 LSCM 결합을 위한 직접 오바레이의 사용의 잠재력을 설명하기 위하여는 복합 시스템은 선택되었습니다. 마우스 미발달 섬유아세포 세포는 TRITC 레테르를 붙인 이차 항체에 선행된 반대로 caveolin 또는 반대로 clathrin 항체로 레테르를 붙였습니다.

숫자 3.

세포는 4°C에 냉각되고 반대로 clathrin 중연쇄 항체로 레테르를 붙이고 paraformaldehyde (PBS에서 4%, 20 분)로 그 후에 고쳐졌습니다. Clathrin에 의하여 입힌 구덩이를 구상하기 위하여는 TRITC 레테르를 붙인 이차 항체는 추가되고, 실같은 악틴은 FITCphalloidin를 사용하여 얼룩이 졌습니다.

DirectOverlay 기능은 이전에 묘사된대로 AFM 심상에 대하여 LSCM 심상을 측정하기 위하여 이용되었습니다. confocal 심상의 구경측정 후에, 사람은 clathrin 레테르를 붙인 형광 심상 (숫자 3)에서에 표면에 어느 구덩이가 특색짓는 대응하는지 결정할 수 있습니다.

지상 caveolin를 구상하기 위하여는, 마우스 미발달 섬유아세포는 paraformaldehyde (PBS에서 4%, 20 분)로 고쳐지고 반대로 caveolin 1 항체로 그 후에 레테르를 붙였습니다. 이 1 차적인 항체는 TRITC 레테르를 붙인 이차 항체를 사용하여 그 때 얼룩이 졌습니다. 또 다시, DirectOverlay 기능은 AFM 심상에 대하여 LSCM 심상을 측정하기 위하여 이용되었습니다.

심상은 그 때 AFM (숫자 4)에 의해 보인 지상 특징을 해석하기 위하여 비교될 수 있습니다. 세포가 고쳐지는 필요가 있는 때, 다른 어떤 방법으로서만 취급하지 않아, 이 결합한 화상 진찰은 장악하는 것을 그 같은 구조물이 세포의 표면에 그밖 구조물과 어떻게의 관련되는지 사용자가 개관을 허용합니다.

숫자 4.

결론

LSCM와의 AFM의 조합은 두 기술 전부의 응용을 더 확장할 수 있습니다. AFM 화상 진찰의 관점에서, 심상의 LSCM 그리고 구경측정과의 조합은 세포, i.e cavaeoli와 clathrincoated 구덩이의 표면에 특정한 구조물의 정확한 결심을 허용합니다. 게다가, AFM를 사용해서 조작과 조화하여 LSCM 화상 진찰은 세포 조작의 하류 프로세스의 화상 진찰을 허용합니다. 가능성은 가능한 AFM 조작과 LSCM 화상 진찰의 어떤 조합든지와 더불어 매우 추가를, 지금 연장합니다.

근원: JPK 계기

이 근원에 추가 정보를 위해 JPK 계기를 방문하십시오

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:04

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