Het Combineren van de AtoomMicroscopie en de Laser die van de Kracht Confocal Microscopie aftasten die Apparatuur van Instrumenten JPK Met Behulp Van

Besproken Onderwerpen

Achtergrond

JPK Nanowizard II

Nauwkeurige Kaliberbepaling van Confocal Optische Beelden

Bekleding van Gekalibreerde Optische Beelden en Beelden AFM

Clathrin en Caveolin op de Embryonale Fibroblasten van de Muis

Conclusies

Achtergrond

De visualisatie van steekproefelementen die diverse vormen van de microscopie gebruiken baseert zich niet alleen op vergroting maar ook contrast. Als dusdanig, verschillende vormen van de verschillende informatie van de de microscopieaanbieding over een steekproef. De Laser die confocal microscopie aftasten die (LSCM) verstrekt informatie over de 3D plaats van bijzonder, component binnen een steekproef wordt geëtiketteerd en heeft het extra voordeel om uit nadruklicht uit te sluiten. Dit kan tot scherpere beelden van een bepaald brandpuntsvliegtuig in een steekproef leiden. De Atoom krachtmicroscopie (AFM), anderzijds, verstrekt directe structurele informatie over de oppervlakte van een steekproef. De combinatie deze twee vormen van de microscopie zou een zeer krachtig hulpmiddel in onderzoek kunnen zijn aangezien het moeilijk is structuren voor weergave „om te bevlekken“ AFM, vandaar is onderscheiden van specifieke elementen op een structurele basis alleen niet altijd mogelijk. Het gebruik van fluorescente etiketten en weergave de optische plak die aan de steekproefoppervlakte beantwoorden met LSCM betekent dat, als de twee technieken kunnen worden gecombineerd dan etiketterend in het beeld LCSM dwars met structuren kan worden gecorreleerd imaged met AFM. Dit heeft het toegevoegde voordeel om de plaats van geëtiketteerde die proteïnen (met LSCM worden geïdentificeerd) ook contextualizing met betrekking tot specifieke structuren.

JPK Nanowizard II

Om de twee de microscopietechnieken te combineren moeten de twee afzonderlijke instrumenten samen worden gebouwd, dusdanig dat geen van beiden de functie van andere stoort. De combinatie van de C1 confocal microscoop Nikon en JPK Nanowizard®II staat weergave van het zelfde steekproefgebied met toe beide technieken, aangezien JPK Nano Wizard® om bovenop een omgekeerde lichte microscoop wordt ontworpen worden geïnstalleerd. Vandaar zijn er bottom-up toegang tot de steekproef voor de de lichte microscopietechnieken en top-down toegang voor de naald AFM. JPK NanoWizard®II vereist slechts dat het stadium van confocal Nikon voor één van hoogst stabiele bouw wordt geruild. Er is een lichte weg door AFM die betekent dat transmissie evenals bezinnings de lichte microscopie met AFM kan op zijn plaats worden geleid. Vandaar, is de basishardware van de twee weergaveapparaten compatibel voor het gelijktijdige functioneren.

Voor weergave AFM is de stabiliteit uiterst belangrijk (vandaar de eis ten aanzien van het stabielere stadium). Dit heeft betekend dat het gebruik van dunne coverglass als steekproefsteunen voor weergave AFM lange tijd onverenigbaar met hoogte - kwaliteitsAFM beelden was. Nochtans, voor superieure optische beelden is het vaak beter aan beeldsteekproeven door dunne coverglass, in het bijzonder wanneer de hoge vergroting, onderdompelingslenzen wordt gebruikt. Voor dergelijke experimenten, waar de gebruiker wenst om hoogte te combineren - kwaliteitsweergave van beide systemen, heeft JPK steekproefhouders, zoals BioCell ontworpen, die de gebruiker toestaan om steekproeven op coverglass stabiel op te zetten, zonder beeldkwaliteit te compromitteren.

Bovendien, voor ware integratie, moet er één of andere manier zijn om de beeldruimte van de twee technieken te kalibreren zodat zij precies kunnen worden bedekt. Dit is noodzakelijk om de onvermijdelijke, alhoewel kleine, ruimteaberraties te compenseren die van het gebruik van optica in de lichte microscoop het gevolg zijn. Nochtans, zijn piezos in elk instrument JPK gelineariseerd dusdanig dat het beeld AFM aan 3Å in de x en yrichtingen nauwkeurig is. Aangezien er vervorming in het optische beeld is dat niet in AFM wordt herhaald, in de meeste gevallen nauwkeurig bedekken de beelden uit de afzonderlijke bronnen niet. Dit is in het bijzonder een probleem wanneer de gebruiker wenst om fluorescente signalen met kleine structuren, zoals endocytic kuilen, op de oppervlakte van een cel te correleren.

Het Bedekken van de beelden en dan het scheeftrekken van door oog impliceren significante subjectieve input die aan fout naar voren gebogen is.

Nauwkeurige Kaliberbepaling van Confocal Optische Beelden

Aangezien het beeld AFM gebruikend zeer nauwkeurige gelineariseerde piezos wordt geproduceerd kan het als „echt-ruimte“ worden behandeld. De cantilever (weergavenaald) van AFM is gewoonlijk rooster over de oppervlakte wordt afgetast een beeld te bouwen dat. Nochtans, kan deze cantilever ook precies naar vaste punten worden verplaatst. Dit betekent dat de cantilever kan worden gebruikt om het optische beeld te kalibreren door de cantileverpositie in een reeks optische beelden empirisch te bepalen, waar de nauwkeurige positie in AFM reeds gekend is. In het kort, wordt de cantilever verplaatst naar een reeks van 25 punten in echt-ruimte, gebruikend piezos. Op elk punt wordt een optisch beeld verworven en later wordt de uiteindeplaats binnen het optische beeld automatisch bepaald. Een transformatiefunctie wordt dan berekend gebruikend beide reeksen van 25 punten, en deze die transformatie op het optische die beeld wordt toegepast aangezien het in de software wordt ingevoerd SPM (voor het runnen van JPK NanoWizard AFMs wordt vereist). Op zulke wijze is het optische beeld gekalibreerd en ingevoerd in het milieu SPM, in een geautomatiseerd proces.

Figuur 1.

In het geval van het combineren van AFM met LSCM wordt het optische beeld van de cantilever AFM geproduceerd op bezinningswijze, d.w.z. wordt de emissiefilter verwijderd uit voor de detector en de bezinning van de opwindingslaser van de cantilever is imaged (Figuur 1). Op zulke wijze kan de cantileverpositie binnen de LSCM beeldwaaier worden ontdekt hoofdzakelijk gebruikend de zelfde lichte weg zoals voor weergave de steekproef. Figuur 1 toont een bekleding van vijf van de cantileverposities (a) met het overeenkomstige beeld LSCM van FITC -FITC-phalloidin geëtiketteerde muis embryonale fibroblasten (b). Aangezien de nauwkeurige positie van de cantilever in de ruimte AFM gekend is, kan de berekening van de overeenkomstige uiteindepositie in de beelden LSCM worden berekend en een transformatiefunctie geleid af om nauwkeurige bekledingen van de twee beelden toe te staan.

Bekleding van Gekalibreerde Optische Beelden en Beelden AFM

Zodra de beeldruimte van beide microscopen is dwars-gecorreleerd doen een aantal interessante mogelijkheden zich voor.

Het confocal beeld kan in de software worden ingevoerd AFM om weergave van specifiek toe te staan, geëtiketteerd gebieden, of manipulatie van specifieke gebieden van de cel, en de nauwkeurige off-line bekledingen kunnen geëtiketteerde componenten aan hun overeenkomstige structuren nauwkeurig in kaart brengen. Bijvoorbeeld, wordt de oppervlakte van cellen MDCK behandeld door op actin-gebaseerde microvilli die direct imaged kunnen zijn gebruikend AFM en actin die de structurele basis van microvilli vormt met LSCM imaged kan zijn na het bevlekken met fluorescently geëtiketteerd phalloidin.

Eerder, leidde de vergelijking van dergelijke beelden tot directe bekleding van alle actin signaal met de uitsteeksels aan de oppervlakte niet de cel, wegens de lichte verschillen in beide beelden. Nochtans, na kaliberbepaling van het confocal beeld en de transformatie, zijn de bekleding van confocal en de beelden AFM nauwkeurig (Figuur 2).

Figuur 2.

De cellen MDCK werden bevestigd met paraformaldehyde (4% in PBS, 20 min), geëtiketteerd met FITC -FITC-phalloidin en de hoogste oppervlakte van de cellen waren imaged met AFM en LSCM. In het confocal beeld (a) de eigenschappen beantwoorden aan oppervlakte bijbehorende op actin-gebaseerde microvilli en de celverbindingen, waar draderige actin gelokaliseerd is. In het topografische beeld AFM (b) microvilli en de celverbindingen zijn ook duidelijk. Aangezien het beeld AFM de structurele informatie van de gehele oppervlakte bevat, niet alleen is de specifieke componenten, het beeld verwerkt om de kromming van de cellen te verwijderen en enkel de kleinere oppervlakteuitsteeksels (microvilli) te tonen. In (c) het rood-gekleurde AFM beeld is bedekt met de groene fluorescentie.

Clathrin en Caveolin op de Embryonale Fibroblasten van de Muis

Microvilli aan de apicale oppervlakte van cellen MDCK zijn de dominante structuur op de oppervlakte in beelden AFM, zodat is de correcte bekleding duidelijk. Nochtans, wanneer de cellen die een zeer heterogeene oppervlakte hebben imaged zijn is het uiterst moeilijk om specifieke functies aan diverse oppervlaktestructuren zonder één of andere vorm van specifiek etiket toe te wijzen. In zo een geval, als de bekleding van de twee soorten beelden niet nauwkeurig is kunnen de fouten in dwarscorrelatie worden gemaakt. Om het potentieel van het gebruik van de Directe Bekleding aan te tonen voor het combineren van LSCM met AFM werd een complexer systeem verkozen. Werden de embryonale de fibroblastcellen van de Muis die geëtiketteerd met of anti-caveolin of anti-clathrinantilichaam, door een TRITC-Geëtiketteerd secundair antilichaam wordt gevolgd.

Figuur 3.

De cellen werden gekoeld aan 4°C en geëtiketteerd met antilichaam van de anti-clathrin het zware ketting en werden werden toen bevestigd met paraformaldehyde (4% in PBS, 20 min). Met een laag bedekte clathrin visualiseren maakt kuiltjes in een TRITC-Geëtiketteerd secundair antilichaam werd toegevoegd, en draderige actin was bevlekt gebruikend FITCphalloidin.

De functie DirectOverlay werd gebruikt om het beeld LSCM tegen het beeld te kalibreren AFM zoals eerder beschreven. Na kaliberbepaling van de confocal beelden, kan men bepalen welke kuilen op de oppervlakte aan de clathrin-geëtiketteerde eigenschappen in de fluorescentiebeelden beantwoorden (Figuur 3).

Om oppervlaktecaveolin te visualiseren, werden de muis embryonale fibroblasten bevestigd met paraformaldehyde (4% in PBS, 20 min) en werden toen geëtiketteerd met anti-caveolin-1 antilichaam. Dit primaire antilichaam was toen bevlekt gebruikend een TRITC-Geëtiketteerd secundair antilichaam. Opnieuw, werd de functie DirectOverlay gebruikt om het beeld LSCM tegen het beeld te kalibreren AFM.

De beelden kunnen dan worden vergeleken die de oppervlakteeigenschappen te interpreteren door AFM worden gezien (Figuur 4). Aangezien de cellen slechts moeten worden bevestigd, behandeld niet op een andere manier, staat deze gecombineerde weergave de gebruiker toe om een overzicht van te verkrijgen hoe dergelijke structuren op andere structuren aan de oppervlakte van de cel betrekking hebben.

Figuur 4.

Conclusies

De combinatie van AFM met LSCM kan de toepassingen van beide technieken verder uitbreiden. Van het standpunt van weergave AFM, staat de combinatie met LSCM en kaliberbepaling van de beelden nauwkeurige bepaling van bijzondere structuren aan de oppervlakte van cellen toe, d.w.z. cavaeoli en clathrincoated kuilen. Bovendien, staat de weergave LSCM in combinatie met manipulatie door AFM te gebruiken weergave stroomafwaarts van processen van de celmanipulatie toe. De mogelijkheden breiden zich veel verder, met om het even welke combinatie van nu mogelijke manipulatie AFM en weergave LSCM uit.

Bron: Instrumenten JPK

Voor meer informatie over deze bron te bezoeken gelieve Instrumenten JPK

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:43

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit