Combinando a Microscopia Atômica da Força e o Laser que Fazem A Varredura da Microscopia Confocal Usando o Equipamento dos Instrumentos de JPK

Assuntos Cobertos

Fundo

JPK Nanowizard II

Calibração Exacta de Imagens Ópticas Confocal

Folha De Prova de Imagens Ópticas Calibradas e de Imagens do AFM

Clathrin e Caveolin em Fibroblasto Embrionários do Rato

Conclusões

Fundo

O visualisation dos elementos de amostra que usam vários formulários da microscopia confia não somente na ampliação mas igualmente contrasta. Como tal, formulários de deferimento da informação diferente da oferta da microscopia sobre uma amostra. O Laser que faz a varredura da microscopia confocal (LSCM) fornece a informação sobre o lugar 3D de um detalhe, etiquetado componente dentro de uma amostra e tem a vantagem adicional da exclusão fora da luz do foco. Isto pode conduzir a umas imagens mais afiadas de um plano focal dado em uma amostra. A microscopia Atômica da força (AFM), por outro lado, fornece a informação estrutural directa sobre a superfície de uma amostra. A combinação destes dois formulários da microscopia poderia ser uma ferramenta muito poderosa na pesquisa porque é difícil “manchar” estruturas para a imagem lactente do AFM, daqui distinguir elementos específicos em uma base estrutural apenas não é sempre possível. O uso de etiquetas e da imagem lactente fluorescentes a fatia óptica que corresponde à superfície da amostra com o LSCM significa aquele, se as duas técnicas podem ser então rotulagem combinada na imagem de LCSM podem ser cruz correlacionada a estruturas imaged com o AFM. Isto tem o benefício adicionado igualmente de contextualizing o lugar das proteínas etiquetadas (identificadas com LSCM) no que diz respeito às estruturas específicas.

JPK Nanowizard II

Para combinar as duas técnicas que da microscopia os dois instrumentos separados precisam de ser construídos junto, tais que nenhum perturba a função da outro. A combinação do microscópio confocal de Nikon C1 e do JPK Nanowizard®II permite a imagem lactente da mesma área da amostra com ambas as técnicas, porque o JPK Wizard® Nano é projectado ser instalado sobre um fotomicroscópio invertido. Daqui há um acesso de baixo para cima à amostra para as técnicas da fotomicroscopia e um acesso invertido para o estilete do AFM. O JPK NanoWizard®II exige somente que a fase do Nikon confocal está trocada por uma da construção altamente estável. Há um trajecto leve através do AFM que significa que essa fotomicroscopia da transmissão assim como da reflexão pode ser conduzida com o AFM no lugar. Daqui, a ferragem básica dos dois dispositivos de imagem lactente é compatível para o funcionamento simultâneo.

Para a estabilidade da imagem lactente do AFM é extremamente importante (daqui a exigência para a fase mais estável). Isto significou que o uso de coverglass finos como apoios da amostra para a imagem lactente do AFM era por muito tempo incompatível com imagens de alta qualidade do AFM. Contudo, porque imagens ópticas superiores é frequentemente melhor às amostras da imagem através dos coverglass finos, particularmente quando a ampliação alta, lentes da imersão é usada. Para tais experiências, onde o usuário deseja combinar a imagem lactente de alta qualidade de ambos os sistemas, JPK projectou os suportes da amostra, tais como o BioCell, que permitem que o usuário monte estàvel amostras em coverglass, sem qualidade de comprometimento da imagem.

Adicionalmente, para a integração verdadeira, deve haver alguma maneira de calibrar o espaço de imagem das duas técnicas de modo que possam precisamente ser cobertos. Isto é necessário para compensar as aberrações inevitáveis, embora pequenas, espaciais que elevaram do uso do sistema ótico no fotomicroscópio. Contudo, os piezos em cada instrumento de JPK são tornados linear tais que a imagem do AFM é precisa a 3Å nos sentidos de x e de y. Porque há uma distorção na imagem óptica que não replicated no AFM, na maioria dos casos as imagens das fontes separadas não overlay exactamente. Este é particularmente um problema quando o usuário deseja correlacionar sinais fluorescentes com as estruturas pequenas, tais como poços endocytic, na superfície de uma pilha.

Cobrir as imagens e então entortar um pelo olho envolvem a entrada subjetiva significativa que é erro inclinado.

Calibração Exacta de Imagens Ópticas Confocal

Enquanto a imagem do AFM é gerada usando piezos tornados linear muito precisos pode ser tratada como o “real-espaço”. O modilhão (estilete da imagem lactente) do AFM é geralmente quadriculação feita a varredura sobre a superfície para construir uma imagem. Contudo, este modilhão pode igualmente ser movido precisamente para pontos fixos. Isto significa que o modilhão pode ser usado para calibrar a imagem óptica empìrica determinando a posição do modilhão em um grupo de imagens ópticas, onde a posição precisa no AFM é sabida já. Em curto, o modilhão é movido para um grupo de 25 pontos no real-espaço, usando os piezos. Em cada ponto uma imagem óptica é adquirida e o lugar da ponta dentro da imagem óptica é determinado subseqüentemente automaticamente. Uma função da transformação é calculada então usando ambos os grupos de 25 pontos, e esta transforma aplicado à imagem óptica enquanto é importado no software de SPM (exigido executando o JPK NanoWizard AFMs). Em tal maneira a imagem óptica é calibrada e importada no ambiente de SPM, em um processo automatizado.

Figura 1.

No caso de combinar o AFM com o LSCM a imagem óptica do modilhão do AFM é gerada no modo da reflexão, isto é o filtro da emissão é removido na frente do detector e a reflexão do laser da excitação do modilhão é imaged (Figura 1). Em tal maneira a posição do modilhão dentro da escala da imagem de LSCM pode ser detectada usar essencialmente o mesmo trajecto leve que para a imagem lactente a amostra. Figura 1 mostra que uma folha de prova de cinco das posições do modilhão (a) com a imagem correspondente de LSCM de FITC-phalloidin etiquetou o rato fibroblasto embrionários (b). Enquanto a posição precisa do modilhão no espaço do AFM é sabida, o cálculo da posição correspondente da ponta nas imagens de LSCM pode ser calculado e uma função da transformação ser deduzido para permitir as folhas de prova precisas das duas imagens.

Folha De Prova de Imagens Ópticas Calibradas e de Imagens do AFM

Uma Vez Que o espaço de imagem de ambos os microscópios cruz-foi correlacionado um número de possibilidades interessantes elevaram.

A imagem confocal pode ser importada no software do AFM para permitir a imagem lactente de específico, etiquetada áreas, ou manipulação de regiões específicas da pilha, e as folhas de prova autónomas precisas podem exactamente traçar componentes etiquetados a suas estruturas correspondentes. Por exemplo, a superfície de pilhas de MDCK é coberta pelos microvilli actínio-baseados que podem ser directamente AFM de utilização imaged e o actínio que forma a base estrutural dos microvilli pode ser imaged com o LSCM após a mancha com phalloidin fluorescente etiquetado.

Previamente, a comparação de tais imagens não conduziu para dirigir a folha de prova de todo o sinal do actínio com as saliências na superfície a pilha, devido às diferenças ligeiras em ambas as imagens. Contudo, após a calibração da imagem e da transformação confocal, a folha de prova das imagens confocal e do AFM é precisa (Figura 2).

Figura 2.

As pilhas de MDCK foram fixadas com o paraformaldehyde (4% em PBS, minuto 20), etiquetado com FITC-phalloidin e a superfície superior das pilhas era imaged com AFM e LSCM. Na imagem confocal (a) as características correspondem aos microvilli actínio-baseados associados superfície e às junções da pilha, onde o actínio filamentous é localizado. Na imagem topográfica do AFM (b) os microvilli e as junções da pilha são igualmente aparentes. Porque a imagem do AFM contem a informação estrutural da superfície do todo, não apenas os componentes específicos, a imagem foram processados para remover a curvatura das pilhas e para mostrar apenas as saliências de superfície menores (microvilli). (c) na imagem vermelho-colorida do AFM foi coberto com a fluorescência verde.

Clathrin e Caveolin em Fibroblasto Embrionários do Rato

Os microvilli na superfície apical de pilhas de MDCK são a estrutura dominante na superfície em imagens do AFM, assim que a folha de prova correcta é clara. Contudo, quando as pilhas que têm uma superfície muito heterogênea são imaged é extremamente difícil atribuir funções específicas às várias estruturas de superfície sem algum formulário da etiqueta específica. Em tal caso, se a folha de prova dos dois tipos de imagens não é erros precisos na correlação transversal pode ser feito. Para demonstrar o potencial do uso da Folha De Prova Directa para combinar LSCM com o AFM um sistema mais complexo foi escolhido. As pilhas embrionárias do fibroblasto do Rato foram etiquetadas com o anti-caveolin ou anti-clathrin anticorpo, seguido por um anticorpo secundário TRITC-etiquetado.

Figura 3.

As pilhas foram refrigeradas a 4°C e etiquetadas com o anti-clathrin anticorpo da corrente pesada e fixadas então com paraformaldehyde (4% em PBS, minuto 20). Para visualizar poços revestidos clathrin um anticorpo secundário TRITC-etiquetado foi adicionado, e o actínio filamentous foi manchado usando FITCphalloidin.

A função de DirectOverlay foi usada para calibrar a imagem de LSCM contra a imagem do AFM como descrita previamente. Após a calibração das imagens confocal, se pode determinar que poços na superfície correspondem ao clathrin-etiquetada caracterizam nas imagens da fluorescência (Figura 3).

Para visualizar o caveolin de superfície, os fibroblasto embrionários do rato foram fixados com paraformaldehyde (4% em PBS, minuto 20) e etiquetados então com o anticorpo anti-caveolin-1. Este anticorpo preliminar foi manchado então usando um anticorpo secundário TRITC-etiquetado. Além Disso, a função de DirectOverlay foi usada para calibrar a imagem de LSCM contra a imagem do AFM.

As imagens podem então ser comparadas para interpretar as características de superfície consideradas pelo AFM (Figura 4). Enquanto as pilhas precisam somente de ser fixadas, não tratado em toda a outra maneira, esta imagem lactente combinada permite que o usuário obtenha uma vista geral de como tais estruturas se relacionam a outras estruturas na superfície da pilha.

Figura 4.

Conclusões

A combinação de AFM com o LSCM pode mais estender as aplicações de ambas as técnicas. Do ponto de vista da imagem lactente do AFM, a combinação com o LSCM e a calibração das imagens permite a determinação precisa de estruturas particulares na superfície das pilhas, isto é cavaeoli e poços clathrincoated. Adicionalmente, a imagem lactente de LSCM em combinação com a manipulação usando o AFM permite a imagem lactente dos processos rio abaixo da manipulação da pilha. As possibilidades estendem muito mais longe, com toda a combinação de manipulação do AFM e de imagem lactente de LSCM agora possíveis.

Source: Instrumentos de JPK

Para obter mais informações sobre desta fonte visite por favor Instrumentos de JPK

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:20

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