A visualização de elementos da amostra usando várias formas de microscopia baseia não só na ampliação, mas também o contraste. Como tal, diferentes formas de microscopia de oferecer informações diferentes sobre uma amostra. Microscopia de varredura a laser confocal (LSCM) fornece informações sobre a localização 3D de um componente particular, rotulados dentro de uma amostra e tem a vantagem adicional de exclusão fora da luz do foco. Isso pode levar a imagens mais nítidas de um dado plano focal em uma amostra. Microscopia de força atômica (AFM), por outro lado, fornece informações estruturais direta sobre a superfície de uma amostra. A combinação destas duas formas de microscopia pode ser uma ferramenta muito poderosa na investigação como é difícil "mancha" de estruturas de AFM, portanto distinguir elementos específicos em uma base estrutural sozinho nem sempre é possível. O uso de etiquetas fluorescentes e de imagem óptico a fatia correspondente à superfície da amostra com LSCM significa que, se as duas técnicas podem ser combinadas, em seguida, rotulagem na imagem LCSM pode ser correlacionada com a cruz estruturas fotografada com AFM. Isto tem o benefício adicional de também contextualizar a localização de proteínas rotulada (identificado com LSCM) em relação a estruturas específicas. JPK NanoWizard II Para combinar as duas técnicas de microscopia os dois instrumentos distintos precisam ser construídos em conjunto, de tal forma que nem perturba o funcionamento do outro. A combinação do microscópio confocal C1 Nikon ea JPK NanoWizard ® II permite imagens da área de mesma amostra, com ambas as técnicas, como o JPK Nano Assistente ® é projetado para ser instalado no topo de um microscópio de luz invertida. Portanto, há bottom-up de acesso à amostra para as técnicas de microscopia de luz e top-down de acesso para a stylus AFM. O JPK NanoWizard ® II requer apenas que a fase do confocal Nikon é trocado por um de construção altamente estável. Há um caminho de luz através da AFM que significa que a transmissão, bem como a microscopia de luz reflexão pode ser realizado com a AFM no lugar. Assim, o hardware básico dos dois dispositivos de imagem é compatível para o funcionamento simultâneo. AFM para a estabilidade de imagem é extremamente importante (daí a exigência para a fase mais estável). Isto significou que o uso de lamela fina como suportes de amostra para AFM foi por um longo tempo incompatível com imagens de alta qualidade AFM. No entanto, para imagens ópticas superiores muitas vezes é melhor a imagem através de amostras lamela fina, especialmente quando alta ampliação, as lentes de imersão são utilizados. Para tais experiências, onde o usuário deseja combinar imagens de alta qualidade a partir de ambos os sistemas, JPK projetou porta-amostras, como o BioCell , que permitem ao usuário montar amostras estável em lamínula, sem comprometer a qualidade da imagem. Além disso, para uma verdadeira integração, deve haver alguma maneira de calibrar o espaço da imagem das duas técnicas, para que possam ser precisamente sobrepostas. Isto é necessário para compensar o inevitável, embora pequeno, aberrações do espaço que surgem a partir do uso da óptica no microscópio de luz. No entanto, o piezos em cada JPK instrumento são linearizadas de tal forma que a imagem AFM é preciso para 3A na direções x e y. Como não há distorção na imagem óptico que não é replicado na AFM, na maioria dos casos, as imagens de duas fontes distintas não sobreposição com precisão. Isto é particularmente um problema quando o usuário deseja correlacionar os sinais fluorescentes com pequenas estruturas, tais como poços endocítica, na superfície de uma célula. Sobrepondo as imagens e, em seguida, uma deformação por olho envolve entrada subjetiva significativo que é propenso a erros. Calibração precisa de Confocal imagens ópticas Como a imagem de AFM é gerado usando muito preciso piezos linearizado pode ser tratada como "espaço real". O cantilever (imagem stylus) do AFM é normalmente raster digitalizadas sobre a superfície a construir uma imagem. No entanto, este cantilever também pode ser movido com precisão a pontos fixos. Isto significa que o cantilever pode ser usado para calibrar a imagem óptica por empiricamente determinar a posição em cantilever um conjunto de imagens ópticas, onde a posição exata na AFM já é conhecido. Em suma, o cantilever é movido para um conjunto de 25 pontos no espaço real, utilizando o piezos. Em cada ponto de uma imagem óptica é adquirido e, posteriormente, a localização da ponta dentro da ótica de imagem é determinado automaticamente. A função de transformação é então calculada usando os dois sets de 25 pontos, e esta transformação aplicada à imagem óptica, que é importado para o software SPM (necessário para a execução do MFAs JPK NanoWizard ). De tal forma a imagem óptico é calibrado e importados para o ambiente SPM, em um processo automatizado.  Figura 1. Calibração de imagens LSCM usando a função Overlay Direct. O cantilever AFM podem ser visualizados no modo de reflexão usando LSCM. Aqui, cinco imagens cantilever individuais são sobrepostos (A), e depois sobreposta sobre uma imagem LSCM correspondente de FITC-phalloidin fibroblastos de rato marcado embrionárias (B). No caso da combinação de AFM com LSCM a imagem ótica do cantilever de AFM é gerado em modo de reflexão, ou seja, o filtro é retirado de emissão na frente do detector ea reflexão do laser de excitação do cantilever é fotografada (Figura 1). De tal forma a posição cantilever dentro da faixa de imagem LSCM podem ser detectadas usando essencialmente o caminho da luz mesmo que para geração de imagens da amostra. A Figura 1 mostra uma sobreposição de cinco das posições cantilever (A) com a imagem LSCM correspondente de FITC-phalloidin fibroblastos de rato marcado embrionárias (B). Como a posição exacta do cantilever no espaço AFM é conhecido, o cálculo da posição da ponta correspondente nas imagens LSCM pode ser calculado e uma função de transformação deduzido para permitir sobreposições precisa das duas imagens. Sobreposição de imagens ópticas Calibrado e Imagens AFM Uma vez que o espaço da imagem de ambos os microscópios tem sido correlacionada uma série de possibilidades interessantes surgem. A imagem confocal pode ser importado para o software AFM para permitir que imagens específicas e áreas assinaladas, ou manipulação de regiões específicas da célula, e precisa overlays offline pode mapear com precisão os componentes rotulados para as suas estruturas correspondentes. Por exemplo, a superfície das células MDCK é coberto por actina baseado microvilos que podem ser diretamente fotografada usando AFM e os filamentos de actina que formam a base estrutural da microvilosidades podem ser visualizados com LSCM após coloração com phalloidin fluorescente etiquetado. Anteriormente, a comparação de tais imagens não conduz à sobreposição de todos os sinais de actina com as saliências na superfície da célula, devido à pequenas diferenças nas duas imagens. No entanto, após a calibração da imagem confocal e transformação, sobreposição das imagens confocal e AFM é preciso (Figura 2).  Figura 2. Imagem combinada de células MDCK. Fixa as células MDCK actina, rotulado com FITC-phalloidin. (A) imagem de microscopia confocal da superfície da monocamada MDCK, mostrando de superfície associadas actina baseado microvilosidades e as junções celulares. A imagem AFM (B) da mesma região foi processada para remover a curvatura da célula e contêm apenas informações sobre as saliências da superfície (microvilosidades). Em (C) as duas imagens são sobrepostas. As células MDCK foram fixadas com paraformaldeído (4% em PBS, 20 min), marcado com FITC-phalloidin ea superfície superior das células foram fotografadas com a AFM e LSCM. Na imagem confocal (A) os recursos correspondem à superfície associados actina baseado microvilos e nas junções das células, onde actina filamentosa é localizada. Na imagem AFM topográfica (B) a microvilosidades e junções celulares também são aparentes. Como a imagem de AFM contém as informações estruturais de toda a superfície, e não apenas componentes específicos, a imagem foi processada para remover a curvatura das células e apenas mostrar as saliências menor superfície (microvilosidades). Em (C) a cor vermelha imagem AFM foi sobreposta com a fluorescência verde. Clatrina e caveolina em fibroblastos de rato embrionárias O microvilosidades na superfície apical das células MDCK são a estrutura dominante na superfície em imagens AFM, de modo a sobreposição correta é claro. No entanto, quando as células que têm uma superfície muito heterogêneas são gravadas é extremamente difícil atribuir funções específicas para várias estruturas de superfície sem alguma forma de rótulo específico. Nesse caso, se a sobreposição dos dois tipos de imagens não é preciso erros na correlação cruzada pode ser feita. Para demonstrar o potencial do uso do Overlay direto para combinar com LSCM AFM um sistema mais complexo foi escolhido. Fibroblastos embrionárias de camundongos foram marcados com um anticorpo anti-caveolina ou anti-clatrina, seguido por um anticorpo marcado com TRITC secundário.  Figura 3. Imagem combinada de clatrina poços revestidos na superfície de células MEF. Fibroblastos embrionárias de camundongos foram marcados com anticorpos anti-clatrina cadeia pesada. Para visualizar clathrin poços revestidos de um anticorpo marcado com TRITC secundário foi adicionado, e actina filamentosa estava manchada com FITC-phalloidin. Uma visão geral de como as células AFM topografia (A), rotulados de actina (B), e uma sobreposição dos dois (C) é fornecido. Uma resolução mais alta AFM topografia (D) foi adquirido como era uma imagem LSCM (E) de uma área exibindo rotulados clatrina na superfície da célula. Uma sobreposição das duas imagens (F) mostra que etiqueta fluorescente corresponde a pits na superfície da célula. De um zoom da topografia de uma área relevante (marcado em F) é apresentado em (G). As células foram resfriadas a 4 ° C e marcadas com anticorpos anti-clatrina cadeia pesada e, em seguida, fixadas com paraformaldeído (4% em PBS, 20 min). Para visualizar clathrin poços revestidos de um anticorpo marcado com TRITC secundário foi adicionado, e actina filamentosa foi coradas FITCphalloidin. A função DirectOverlay foi usada para calibrar a imagem LSCM contra a imagem AFM como descrito anteriormente. Após a calibração das imagens confocal, pode-se determinar qual pits na superfície correspondem às características clathrin marcado nas imagens de fluorescência (Figura 3). Para visualizar superfície caveolina, fibroblastos embrionárias de camundongos foram fixados com paraformaldeído (4% em PBS, 20 min) e, em seguida, rotulados com anticorpo anti-caveolina 1. Este anticorpo primário foi, em seguida, coradas utilizando um anticorpo marcado com TRITC secundário. Mais uma vez, a função DirectOverlay foi utilizado para calibrar a imagem LSCM contra a imagem AFM. As imagens podem então ser comparado a interpretar as características da superfície visto pelo AFM (Figura 4). Como as únicas células precisam ser corrigidos, não tratados de qualquer outra forma, esta imagem combinada permite ao usuário obter uma visão geral de como tais estruturas se relacionam com outras estruturas na superfície da célula.  Figura 4. Imagem combinada de cavéolas na superfície de células MEF. Fibroblastos embrionárias de camundongos foram fixados com paraformaldeído e, em seguida, rotulados com anticorpo anti-caveolina 1. Este anticorpo primário foi, em seguida, coradas utilizando um anticorpo marcado com TRITC secundário. Uma visão geral de imagem AFM da topografia da célula foi adquirida (A) e do espaço da imagem LSCM calibrada para permitir a comparação da AFM e LSCM. A maior resolução de imagem AFM foi adquirida (B) e comparados com a imagem LSCM correspondente de superfície associadas cavéolas (C). Uma sobreposição é apresentado em (D), e um zoom na área marcada no (E). Conclusões A combinação de AFM com LSCM podem ampliar ainda mais as aplicações de ambas as técnicas. Do ponto de vista da AFM, combinação com LSCM e calibração das imagens permite a determinação precisa de estruturas particulares na superfície das células, ou seja cavaeoli e poços clathrincoated. Além disso, LSCM imagem em combinação com a manipulação, utilizando o AFM permite imagens de processos a jusante da manipulação de células. As possibilidades vão muito mais longe, com qualquer combinação de AFM e manipulação de imagens LSCM agora possível. |