Совмещать Атомную Микроскопию Усилия и Лазер Просматривая Confocal Микроскопию Используя Оборудование от Аппаратур JPK

Покрытые Темы

Предпосылка

JPK Nanowizard II

Точная Тарировка Confocal Оптически Изображений

Верхний Слой Откалибрированных Оптически Изображений и Изображений AFM

Clathrin и Caveolin на Фиброцитах Мыши Зародышевых

Заключения

Предпосылка

Визуализирование элементов образца используя различные формы микроскопии полагается не только на увеличении но также сравнивается. Как таковой, отличая формы данных по предложения микроскопии различных о образце. Лазер просматривая confocal микроскопию (LSCM) обеспечивает информацию о обозначенном положении 3D частности, компонентом внутри образец и имеет дополнительное преимущество исключать из света фокуса. Это может вести к более острым изображениям, котор дали фокальной плоскости в образце. Атомная микроскопия усилия (AFM), с другой стороны, обеспечивает сразу структурную информацию о поверхности образца. Сочетание из эти 2 формы микроскопии смогло быть очень мощным инструментом в исследовании по мере того как трудно «запятнать» структуры для воображения AFM, следовательно различать специфические элементы на структурное основание самостоятельно всегда не возможен. Польза дневных ярлыков и воображения оптически ломтик соответствие к поверхности образца с LSCM значит то, если 2 метода могут быть совмещенный после этого обозначать в изображении LCSM могут быть крестом сопоставленным к структурам imaged с AFM. Это имеет добавленное преимущество также вносить расположение в контекст обозначенных протеинов (определенных с LSCM) по отношению к специфическим структурам.

JPK Nanowizard II

Совместить 2 метода микроскопии 2 отдельно аппаратурам нужно быть построенным совместно, такие что ни то нарушает функцию другого. Сочетание из микроскоп Nikon C1 confocal и JPK Nanowizard®II позволяет воображению такой же зоны образца с обоими методами, по мере того как JPK Nano Wizard® конструировано быть установленным na górze перевернутого светлого микроскопа. Следовательно вверх ногами доступ к образцу для методов светлой микроскопии и идущий сверху вниз доступ для грифеля AFM. JPK NanoWizard®II только требует что этап Nikon confocal обменян для одной из сильно стабилизированной конструкции. Светлый путь до AFM который значит что ту микроскопию передачи так же, как отражения светлую можно дирижировать с AFM в месте. Следовательно, основное оборудование 2 приборов воображения совместимо для одновременный действовать.

Для стабилности воображения AFM весьма важен (следовательно требование для более стабилизированного этапа). Это значило что польза тонких coverglass как поддержки образца для воображения AFM была в течение длительного времени несовместима с высокомарочными изображениями AFM. Однако, ибо главные оптически изображения часто более лучшее к образцам изображения через тонкие coverglass, в частности когда использовано высокое увеличение, объективы погружения. Для таких экспериментов, где пользователь желает совместить высокомарочное воображение от обеих систем, JPK конструировало держатели образца, как BioCell, которые позволяют пользователю стабилизированно установить образцы на coverglass, без компрометируя качества изображения.

Дополнительно, для истинного внедрения, должно быть некоторый путь откалибрировать пространство изображений 2 методов так, что они можно точно overlaid. Это необходимо возмещало потерю неизбежные, albeit малые, пространственные аберрации которые возникают от пользы оптики в светлом микроскопе. Однако, piezos в каждой аппаратуре JPK линеаризованы таким что изображение AFM точно к 3Å в направлениях x и y. По Мере Того Как искажение в оптически изображении которое не скопировано в AFM, в большинств случаи изображения от отдельно источников точно overlay. Это в частности проблема когда пользователь желает сопоставить дневные сигналы с малыми структурами, как endocytic ямы, на поверхности клетки.

Overlaying изображения и после этого сновать одно глазом включают значительно субъективный входной сигнал который прональн к ошибке.

Точная Тарировка Confocal Оптически Изображений

По Мере Того Как изображение AFM произведено используя очень точные линеаризованные piezos его можно обработать как «реальн-космос». Cantilever (грифель воображения) AFM обычно растр просмотренный над поверхностью для того чтобы построить изображение. Однако, этот cantilever можно также двинуть точно к фиксированным точкам. Это значит что cantilever может быть использован для того чтобы откалибрировать оптически изображение эпирически определять консольное положение в комплекте оптически изображений, где точное положение в AFM уже знано. Вкратце, cantilever двинут к комплекту 25 пунктов в реальн-космосе, используя piezos. На каждый этап оптически изображение приобретено и затем положение подсказки в пределах оптически изображения автоматически определено. Функция преобразовывать после этого высчитана используя оба комплекта 25 пунктов, и это преобразовывает прикладное к оптически изображению по мере того как оно импортировано в ПО SPM (требуемое для работать JPK NanoWizard AFMs). Таким образом оптически изображение откалибрировано и импортировано в окружающую среду SPM, в автоматизированном процессе.

Диаграмма 1.

В случае совмещать AFM с LSCM оптически изображение cantilever AFM произведено в режиме отражения, т.е. фильтр излучения извлекается от перед детектора и отражение лазера возбуждения от cantilever imaged (Диаграмма 1). Таким образом консольное положение внутри ряд изображения LSCM можно обнаружить используя существенно такой же светлый путь как для воображения образец. Показано что на Диаграмму 1 верхний слой 5 из консольных положений (A) с соответствуя изображением LSCM FITC-phalloidin обозначил мышь зародышевыми фиброцитами (B). По Мере Того Как знано точное положение cantilever в космосе AFM, вычисление соответствуя положения подсказки в изображениях LSCM можно быть высчитаны, что и функция преобразовывать дедуцировать позволило точным верхним слоям 2 изображений.

Верхний Слой Откалибрированных Оптически Изображений и Изображений AFM

Как Только пространство изображений обоих микроскопов былосопоставлено несколько интересных возможностей возникают.

Confocal изображение можно импортировать в ПО AFM для того чтобы позволить обозначенному воображению специфического, зонами, или манипуляцией специфических зон клетки, и точные автономные верхние слои могут точно отобразить обозначенные компоненты к их соответствуя структурам. На пример, поверхность клеток MDCK покрыта актин-основанными microvilli которые могут быть сразу imaged используя AFM и актин который формирует структурная основа microvilli может быть imaged с LSCM после пятнать с дневно обозначенным phalloidin.

Ранее, сравнение таких изображений не вело для того чтобы сразу верхний слой всего сигнала актина с выступаниями на поверхности клетка, должный к небольшим разницам в обоих изображениях. Однако, после тарировки confocal изображения и преобразования, верхний слой изображений confocal и AFM точен (Диаграмма 2).

Диаграмма 2.

Клетки MDCK были зафиксированы при параформальдегид (4% в PBS, минута 20), обозначенный с FITC-phalloidin и верхняя поверхность клеток была imaged с AFM и LSCM. В confocal изображении (A) характеристики соответствуют к microvilli связанным поверхностью актин-основанным и соединениям клетки, где filamentous актин локализован. В изображении AFM топографическом (B) microvilli и соединения клетки также ясны. По Мере Того Как изображение AFM содержит структурную информацию все поверхностного, не как раз специфические компоненты, изображение были обработаны для того чтобы извлечь погнутость клеток и как раз показать более малые поверхностные выступания (microvilli). В (C) красн-покрашенном изображении AFM overlaid с зеленым флуоресцированием.

Clathrin и Caveolin на Фиброцитах Мыши Зародышевых

Microvilli на верхушечной поверхности клеток MDCK доминантная структура на поверхности в изображениях AFM, поэтому правильный верхний слой ясн. Однако, когда клетки которые имеют очень несродную поверхность imaged весьма трудно задать специфические функции к различным поверхностным структурам без некоторой формы специфического ярлыка. В подобном случае, если верхний слой 2 типов изображений не точен, то ошибки в взаимной корреляции можно совершить. Для того чтобы продемонстрировать потенциал пользы Сразу Верхнего Слоя для совмещать LSCM с AFM была выбрана комплексная система. Клетки фиброцита Мыши зародышевые были обозначены при или анти--caveolin или анти--clathrin антитело, следовать TRITC-обозначенным вторичным антителом.

Диаграмма 3.

Клетки были охлажены к 4°C и были обозначены с анти--clathrin антителом тяжелой цепи и после этого были зафиксированы с параформальдегидом (4% в PBS, минута 20). Визуализировало ямы покрынные clathrin TRITC-обозначенное вторичное антитело были добавлены, что, и filamentous актин был запятнан используя FITCphalloidin.

Функция DirectOverlay была использована для того чтобы откалибрировать изображение LSCM против изображения AFM как описано ранее. После тарировки confocal изображений, можно определить которые ямы на clathrin-обозначенной поверхности соответствуют к отличают в изображениях флуоресцирования (Диаграмме 3).

Для того чтобы визуализировать поверхностное caveolin, зафиксировали с параформальдегидом (4% в PBS, минута 20) и после этого обозначили фиброциты мыши зародышевые с антителом anti-caveolin-1. Это первичное антитело после этого было запятнано используя TRITC-обозначенное вторичное антитело. Опять, функция DirectOverlay была использована для того чтобы откалибрировать изображение LSCM против изображения AFM.

Изображения можно после этого сравнить для того чтобы интерпретировать поверхностные характеристики увиденные AFM (Диаграммой 4). По Мере Того Как клеткам только нужно быть исправленным, не обработано в любом другом путе, это совмещенное воображение позволяет пользователю получить обзор как такие структуры относят к другим структурам на поверхности клетки.

Диаграмма 4.

Заключения

Сочетание из AFM с LSCM может более далее расширить применения обоих методов. С точки зрения воображения AFM, комбинация с LSCM и тарировкой изображений позволяет точному определению определенных структур на поверхности клеток, т.е. cavaeoli и clathrincoated ям. Дополнительно, воображение LSCM в комбинации с манипуляцией путем использование AFM позволяет воображению процессов по потоку манипуляции клетки. Возможности расширяют очень дальнейшее, с любой манипуляцией AFM сочетание из и воображением LSCM теперь возможными.

Источник: Аппаратуры JPK

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Аппаратуры JPK

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:23

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit