Kombinera Atom- StyrkaMicroscopy och Laser som Avläser Confocal Microscopy som Använder Utrustning från JPK, Instrumenterar

Täckte Ämnen

Bakgrund

JPK Nanowizard II

Den Exakta Kalibreringen av Confocal Optiskt Avbildar

Överdra av Kalibrerat Optiskt Avbildar, och AFM Avbildar

Clathrin och Caveolin på Foster- Fibroblasts för Mus

Avslutningar

Bakgrund

Visualisationen av tar prov beståndsdelar som att använda som är olikt, bildar av microscopy relies inte endast på förstoring men kontrasterar också. Som sådan, bildar att skilja sig åt av olik information om microscopyerbjudande om en ta prov. Laser som avläser confocal microscopy, (LSCM) ger information om läget 3D av en detalj som märks del- inom en ta prov och, har den extra fördelen av att utesluta ut ur som lätt fokuserar. Detta kan leda till skarpare avbildar av ett givet fokal- hyvlar i en ta prov. Atom- styrkamicroscopy (AFM), ger å andra sidan riktar strukturell information om ytbehandla av en ta prov. Kombinationen av dessa två bildar av microscopy kunde vara ett mycket kraftigt bearbetar i forskning, som det är svårt ”att befläcka” strukturerar för AFM som avbildar, hence att skilja specifika beståndsdelar på en strukturell bas bara inte är alltid möjligheten. Bruket av fluorescerande etiketter och att avbilda den optiska skivan som motsvarar till ta prov, ytbehandlar med LSCM-hjälpmedel som, om de två teknikerna kan vara kombinerat märka därefter i LCSMEN avbilda kan vara korrelerat argt till strukturerar avbildat med AFM. Detta har det ökat att gynna av contextualizing också av läget av märkta proteiner (som identifieras med LSCM) med hänsyn till närmare detalj strukturerar.

JPK Nanowizard II

Till sammanslutningen instrumenterar de två microscopyteknikerna de separata tvåna behov att byggas tillsammans, sådan att neither störer fungera av annan. Kombinationen av Nikon C1 det confocal mikroskopet och JPKEN Nanowizard®II låter att avbilda av samma tar prov område med båda tekniker, som JPKEN Nano Wizard® planläggs för att installeras överst av ett inverterat ljust mikroskop. Hence finns det botten-upp tar fram till ta prov för de ljusa microscopyteknikerna och bästa-besegrar tar fram för AFM-nålen. JPKEN NanoWizard®II kräver endast att arrangera av den confocal Nikonen utbyts för en av högt stabil konstruktion. Det finns en ljus bana till och med AFMEN att hjälpmedlet, som ljus microscopy för överföring såväl som för reflexion kan föras med AFMEN in förlägger. Hence är den grundläggande maskinvaran av de två avbilda apparaterna kompatibel för samtidigt fungera.

För AFM extremt viktigt det är att avbilda stabilitet (kravet för det mer stall arrangerar hence). Detta har betytt att bruket av tunna coverglass som tar prov service för att avbilda för AFM var okompatibelt med högkvalitativ AFM avbildar på länge. Emellertid for överlägset optiskt avbildar det är ofta bättre att avbilda tar prov till och med tunna coverglass, när bestämt kickförstoring, immersionlinser används. För sådan experiment var användaren önskar till högkvalitativt avbilda för sammanslutning från båda system, har JPK planlagt tar prov hållare, liksom BioCellen, som låter användaren fast montera tar prov på coverglass, utan att kompromissa, avbildar kvalitets-.

Dessutom för riktig integration, måste det finnas något långt som kalibrerar avbildautrymmet av de två teknikerna, så att de kan exakt överdras. Detta är nödvändigt beträffande att kompensera för de oundvikliga, albeit små rumsliga avvikelserna som uppstår från bruket av optik i det ljusa mikroskopet. Emellertid instrumenterar piezosna i varje JPK är linearized sådan att AFMEN avbildar är preciserar till 3Å i x- och y-riktningarna. Avbilda, som inte reproduceras i AFMEN, Som det finns distorsion i det optiskt, avbildar ofta från de separata källorna överdrar inte exakt. Detta är bestämt ett problem, när användarewishesna som korrelerar fluorescerande, signalerar med litet strukturerar, liksom endocytic gropar, på ytbehandla av en cell.

att Överdra avbildar, och därefter snedvrida en syna by gäller viktigt subjektivt matar in som är benägen till felet.

Den Exakta Kalibreringen av Confocal Optiskt Avbildar

Som AFMEN avbildar är frambragt använda mycket preciserar linearized piezos som den kan behandlas som ”verklig-utrymme”. Cantileveren (som avbildar nålen) av AFMEN är vanligt rastret som avläs över ytbehandla för att bygga en avbilda. Emellertid kan denna cantilever också vara rörd exakt till fixat pekar. Detta kalibrerar hjälpmedlet, att cantileveren kan vara van vid, det optiskt avbildar, genom empirically att bestämma cantileveren, placerar i en uppsättning av optiskt avbildar, var precisera placerar i AFMEN är redan bekant. I kort stavelse är cantileveren rörd till en uppsättning av 25 pekar i verklig-utrymme, genom att använda piezosna. På varje peka ett optiskt avbildar fås, och därpå avbildar spetsläget inom det optiskt är automatiskt beslutsamt. En omformning fungerar beräknas därefter genom att använda båda uppsättningar av 25 pekar, och denna omformar applicerat till det optiskt avbildar, som den importeras in i SPM-programvaran (som krävs för spring JPKEN NanoWizard AFMs). I sådan långt avbildar de optiska kalibreras, och importerat in i SPM-miljön, i ett automatiserat bearbeta.

Figurera 1.

I fallet av kombination av AFM med LSCM som de optiska avbildar av AFM-cantileveren, frambrings i reflexionsfunktionsläge, dvs. filtrerar utsläppet bort tas från framme av avkännaren, och reflexionen av magnetiseringslaseren från cantileveren avbildas (Figurera 1). I sådan långt placerar cantileveren inom LSCMEN avbildar spänner kan avkännas att använda i grunden samma lätt banan som för att avbilda ta prov. Figurera shows 1 som en överdra av fem av cantileveren placerar (A) med den motsvarande LSCMEN avbildar av FITC-phalloidin märkte musen foster- fibroblasts (B). Som precisera placerar av cantileveren i AFM-utrymmet är bekant, placerar beräkningen av den motsvarande spetsen i LSCMEN avbildar kan beräknas och, en omformning fungerar sluta sig till för att låta preciserar överdrar av tvåna avbildar.

Överdra av Kalibrerat Optiskt Avbildar, och AFM Avbildar

En Gång har avbildautrymmet av båda mikroskop arg-korrelerats ett nummer av intressant möjligheter uppstår.

De confocal avbildar kan importeras in i AFM-programvaran för att låta att avbilda av närmare detalj som märks områden eller behandlig av specifika regioner av cellen och preciserar överdrar offline kan exakt kartlägga märkta delar till deras motsvara strukturerar. För anföra som exempel, täckas ytbehandla av MDCK-celler av actin-baserade microvilli som kan direkt avbildas genom att använda AFM, och actinen, som bildar, den strukturella basen av microvillina kan avbildas med LSCM, når du har befläckt med fluorescerande märkt phalloidin.

Föregående avbildar jämförelsen av sådan ledde inte för att rikta överdrar allra av actinen signalerar med framstickandena på ytbehandla cellen, tack vare de obetydliga skillnaderna i båda avbildar. Överdra av det confocal och AFMEN avbildar är preciserar (Figurera 2), Emellertid, efter kalibreringen av det confocal avbildar och omformning.

Figurera 2.

MDCK-cellerna fixades med paraformaldehyde (4% i PBS, minut 20) som märktes med FITC-phalloidin, och det bästa ytbehandlar av cellerna avbildades med AFM och LSCM. I det confocal avbilda (A) särdragen motsvarar till de tillhörande actin-baserade microvillina för ytbehandla och cellföreningspunkterna, var trådlik actin lokaliseras. I den topographic AFMEN avbilda (B) microvillina, och cellföreningspunkter är också påtagliga. Som AFMEN avbildar innehåller den strukturella informationen av helheten ytbehandlar, inte precis specifika delar, har avbilda bearbetats för att ta bort krökningen av cellerna, och precis att visa ytbehandlar de mindre framstickanden (microvilli). I (C) denfärgade AFMEN avbilda har överdrats med den gröna fluorescencen.

Clathrin och Caveolin på Foster- Fibroblasts för Mus

Microvillina på det apical ytbehandlar av MDCK-celler är det framträdande strukturerar på ytbehandla i AFM avbildar, så de korrekta överdrar är klara. Emellertid när celler, som har ett mycket heterogent att ytbehandla, avbildas, är det extremt svårt att tilldela närmare detalj fungerar till olikt ytbehandlar strukturerar utan något bildar av specifik etikett. I ett sådan fall om överdra av de två typerna av avbildar, inte är att precisera missförstår i arg korrelation kan göras. Att visa det potentiellt av bruket av Rikta Överdra för kombination av LSCM med AFM som ett mer komplex system valdes. Märktes foster- fibroblastceller för Mus med endera den anti-caveolin eller anti-clathrin antikroppen som följdes av enmärkt sekundär antikropp.

Figurera 3.

Cellerna kyldes till 4°C, och märkt med den anti-clathrin skurkrollen kedja antikroppen och som fixar därefter med paraformaldehyde (4% i PBS, minut 20). Att visualisera clathrinen täckte gropar tillfogades enmärkt sekundär antikropp, och trådlik actin befläcktes genom att använda FITCphalloidin.

DirectOverlayen fungerar var van vid kalibrerar LSCMEN avbildar mot AFMEN avbildar som beskrivit föregående. (Figurera 3), Efter kalibreringen av det confocal har avbildat, kan man bestämma vilka clathrin-märkta gropar på ytbehandla motsvarar till presenterar i fluorescencen avbildar.

Att visualisera ytbehandla caveolinen, mus som foster- fibroblasts fixades med paraformaldehyde (4% i PBS, minut 20) och märktes därefter med antikroppen anti-caveolin-1. Denna primära antikropp befläcktes därefter genom att använda enmärkt sekundär antikropp. Igen fungerar DirectOverlayen var van vid kalibrerar LSCMEN avbildar mot AFMEN avbildar.

Avbildar kan därefter jämföras för att tolka ytbehandlasärdragen som ses av AFMEN (Figurera 4). Som cellerna behöver endast att fixas, inte behandlat i någon annat långt, låter denna kombinerat avbilda användaren erhålla en överblick av hur sådan strukturerar förbinder till annat strukturerar på ytbehandla av cellen.

Figurera 4.

Avslutningar

Kombinationen av AFM med LSCM kan vidare fördjupa applikationerna av båda tekniker. Från peka av beskåda av AFM som avbildar, kombination med LSCM, och kalibreringen av avbildar låter preciserar beslutsamhet av detaljen strukturerar på ytbehandla av celler, dvs. cavaeoli och clathrincoated gropar. Dessutom låter LSCM som avbildar i kombination med behandlig, genom att använda AFMEN, att avbilda av bearbetar downstream av cellbehandligen. Möjligheterna fördjupa mycket vidare, med någon kombination av AFM-behandlig och LSCM som nu avbildar möjlighet.

Källa: JPK Instrumenterar

För mer information på denna källa behaga besök JPK Instrumenterar

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 18:32

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit