结合基本强制浏览共焦的显微学的显微学和激光使用从 JPK 仪器的设备

包括的事宜

背景

JPK Nanowizard II

共焦的光学图象的准确定标

被校准的光学图象和 AFM 图象重叠

Clathrin 和 Caveolin 在鼠标胚胎成纤维细胞

结论

背景

范例要素的形象化使用各种各样显微学的依靠不仅放大,而且对比。 同样地,显微学聘用另外信息的不同于的表单关于范例的。 浏览共焦的显微学的激光 (LSCM)关于特殊性的 3D 地点的情报,被标记在范例内的要素并且有排除的另外的好处出于重点光。 这可能导致一个特定焦平面的清晰的图象在范例的。 基本强制显微学 (AFM),另一方面,提供关于范例的表面的直接结构信息。 显微学的这两份表单的组合可能是在研究的一个非常强大的工具,因为 “弄脏” AFM 想象的结构是难的,因此区分根据单独一个结构上的基本类型的特定要素总是不是可能的。 如果二个技术可以是联合的然后标记在 LCSM 图象可以是与结构关联的交叉印象与 AFM,使用萤光标签和想象与范例表面相应的光学片式与 LSCM 意味那。 这有也把被标记的蛋白质的地点的放在上下文中被添加的福利 (识别与 LSCM) 关于特定结构。

JPK Nanowizard II

结合二台单独仪器需要一起被编译的二个显微学技术,这样都不干扰其他的功能。 因为 JPK 纳诺 Wizard® 被设计被安装在一个被倒置的光学显微镜顶部, Nikon C1 共焦的显微镜和 JPK Nanowizard®II 的组合允许同一范例区的想象与两个技术的。 因此有对范例的自下向上存取光学显微学技术的和自顶向下存取的 AFM 铁笔。 JPK NanoWizard®II 只要求共焦的 Nikon 的阶段为一个很稳定的建筑被交换。 有一个轻的路径通过意味的 AFM 该传输以及反映光学显微学可以执行与到位 AFM。 因此,二套摄象装置的基本硬件为同时发挥作用是兼容的。

对于 AFM 想象稳定性是非常重要的 (因此更加稳定的阶段的需求)。 这意味着使用稀薄的 coverglass 作为范例技术支持 AFM 想象与优质 AFM 图象长期是不兼容的。 然而,特别地当使用时,为了优越光学图象经常是好对图象范例通过稀薄的 coverglass 高放大,浸没透镜。 对这样实验,这个用户希望结合从两个系统的优质想象, JPK 设计了范例持有人,例如 BioCell,在 coverglass 允许这个用户稳定地挂接范例,不用影响的图象质量。

另外,为真的综合化,必须有某个方式校准二个技术的象方,以便可以精密地覆盖他们。 这是必要补尝从使用在光学显微镜的光学出现的不可避免,虽然小,空间的变型。 然而,在每台 JPK 仪器的 piezos 线性化这样 AFM 图象是准确的对在 x 和 y 方向的 3Å。 尽管有 在 AFM 没有被复制的光学图象的畸变,从单独来源的图象不准确地在许多情况下躺在。 当这个用户希望关联萤光信号与小的结构,例如 endocytic 坑,在细胞的表面时,这是特殊问题。

覆盖图象然后翘曲一由眼睛介入是易出错的重大的主观输入。

共焦的光学图象的准确定标

当 AFM 图象被生成使用非常准确的线性化的 piezos 它可以对待 “实际空间”。 悬臂 (想象铁笔) AFM 通常是光栅浏览在表面建立图象。 然而,此悬臂可能精密地也被移动向固定点。 这意味着悬臂可以通过经验主义确定在一套的悬臂式位置用于校准光学图象光学图象,在 AFM 的准确的位置已经知道。 简而言之,使用 piezos,悬臂被移动向一套在实际空间的 25 点。 在每点一个光学图象获取,并且自动地随后确定在光学图象内的技巧地点。 使用两套 25 点,变换功能然后被计算,并且这变换应用对光学图象,当它被导入到 SPM 软件 (是必需的对于运行 JPK NanoWizard AFMs)。 用这样方式光学图象被校准并且被导入到 SPM 环境,在一个自动化的进程中。

图 1。

一旦结合 AFM 与 LSCM AFM 悬臂的光学图象在反映模式下被生成,即放射补白从在这台探测器前面被去除,并且励磁激光的反映从悬臂的是印象的 (图 1)。 用这样方式在 LSCM 图象范围内的悬臂式位置可以根本被检测使用轻的路径和一样想象的这个范例。 图 1 显示重叠五与 FITC-phalloidin 的对应的 LSCM 图象的悬臂位置 (a) 标记了鼠标胚胎成纤维细胞 (b)。 当悬臂的准确的位置在 AFM 空间知道,对应的技巧位置的计算在 LSCM 图象的可以被计算,并且变换功能推导允许二个图象的准确的重叠。

被校准的光学图象和 AFM 图象重叠

一旦两个显微镜象方跨关联一定数量的有趣可能性来了。

这个共焦的图象可以被导入到 AFM 软件允许想象特定,被标记这个细胞的特定区域的区或者处理,并且准确的脱机重叠可能准确地映射被标记的要素到他们对应的结构。 例如, MDCK 细胞表面由可以直接地是印象的使用 AFM,并且肌动蛋白形成微绒毛的结构上的基本类型可以是印象的与 LSCM 在弄脏与萤光被标记的 phalloidin 以后的基于肌动蛋白的微绒毛报道。

以前,比较的这样图象没有导致处理所有的重叠与伸进的肌动蛋白信号在表面这个细胞,由于在两个图象上的轻微的区别。 然而,在这个共焦的图象和转换的定标以后,共焦和 AFM 图象的重叠是准确的 (图 2)。

图 2。

MDCK 细胞修理了与多聚甲醛 (4% 在 PBS, 20 分钟),标记与 FITC-phalloidin,并且细胞的顶面是印象的与 AFM 和 LSCM。 在这个共焦的图象 (a) 功能对应于表面被关联的基于肌动蛋白的微绒毛和细胞连接点,纤维状肌动蛋白局限化。 在 AFM 地形学图象 (b) 微绒毛和细胞连接点也是明显的。 因为 AFM 图象包含结构信息全部表面,不仅仅特定组件,这个图象被处理取消细胞的曲度和显示更小的表面伸进 (微绒毛)。 在 (c) 红色 AFM 图象用绿色荧光覆盖了。

Clathrin 和 Caveolin 在鼠标胚胎成纤维细胞

微绒毛在 MDCK 细胞顶端表面是在表面的统治结构在 AFM 图象,因此正确的重叠是确切。 然而,当有非常异种表面时的细胞是印象的分配特定功能到多种表面结构没有特定标签的某种表单是非常难的。 在这种情况下,如果图象的二种类型的重叠不是准确的在互相关的错误可以被犯。 要展示使用的潜在结合的 LSCM 直接重叠与 AFM 复杂系统被选择。 鼠标胚胎成纤维细胞细胞标记了与反caveolin 或反clathrin 抗体,跟随由 TRITC 被标记的附属抗体。

图 3。

细胞冷却了对 4°C 并且标记了与反clathrin 重链抗体然后修理了与多聚甲醛 (4% 在 PBS, 20 分钟)。 要形象化 clathrin 被涂上的坑 TRITC 被标记的附属抗体被添加,使用 FITCphalloidin,并且纤维状肌动蛋白被弄脏了。

DirectOverlay 功能用于校准 LSCM 图象 AFM 图象如所描述以前。 在共焦的图象的定标以后,一个人可能确定在对应于 clathrin 被标记的表面的哪些坑在荧光图象 (图 3) 以为特色。

要形象化表面 caveolin,鼠标胚胎成纤维细胞修理与多聚甲醛 (4% 在 PBS, 20 分钟) 然后标记了与反caveolin 1 抗体。 使用 TRITC 被标记的附属抗体,此主要抗体然后被弄脏了。 再次, DirectOverlay 功能用于校准 LSCM 图象 AFM 图象。

图象可能然后被比较解释 AFM 看到的表面功能 (图 4)。 当细胞只需要被修理,没对待用其他方式,此联合的想象允许这个用户获得概览这样结构如何与其他结构关连在这个细胞的表面。

图 4。

结论

AFM 的组合与 LSCM 可能进一步扩大两个技术的应用。 从 AFM 想象角度看,与图象的 LSCM 和定标的组合允许特殊结构的准确的确定在细胞,即 cavaeoli 和 clathrincoated 坑表面。 另外,与处理的组合 LSCM 想象通过使用 AFM 允许进程想象顺流细胞处理。 可能性现在延伸进一步,与 AFM 的处理和可能 LSCM 的想象的所有组合。

来源: JPK 仪器

关于此来源的更多信息请参观 JPK 仪器

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:34

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit