結合基本強制瀏覽共焦的顯微學的顯微學和激光使用從 JPK 儀器的設備

包括的事宜

背景

JPK Nanowizard II

共焦的光學圖像的準確定標

被校準的光學圖像和 AFM 圖像重疊

Clathrin 和 Caveolin 在鼠標胚胎成纖維細胞

結論

背景

範例要素的形象化使用各種各樣顯微學的依靠不僅放大,而且對比。 同樣地,顯微學聘用另外信息的不同於的表單關於範例的。 瀏覽共焦的顯微學的激光 (LSCM)關於特殊性的 3D 地點的情報,被標記在範例內的要素并且有排除的另外的好處出於重點光。 這可能導致一個特定焦平面的清晰的圖像在範例的。 基本強制顯微學 (AFM),另一方面,提供關於範例的表面的直接結構信息。 顯微學的這兩份表單的組合可能是在研究的一個非常強大的工具,因為 「弄髒」 AFM 想像的結構是難的,因此區分根據單獨一個結構上的基本類型的特定要素總是不是可能的。 如果二個技術可以是聯合的然後標記在 LCSM 圖像可以是與結構關聯的交叉印象與 AFM,使用螢光標籤和想像與範例表面相應的光學片式與 LSCM 意味那。 這有也把被標記的蛋白質的地點的放在上下文中被添加的福利 (識別與 LSCM) 關於特定結構。

JPK Nanowizard II

結合二臺單獨儀器需要一起被編譯的二個顯微學技術,這樣都不干擾其他的功能。 因為 JPK 納諾 Wizard® 被設計被安裝在一個被倒置的光學顯微鏡頂部, Nikon C1 共焦的顯微鏡和 JPK Nanowizard®II 的組合允許同一範例區的想像與兩個技術的。 因此有對範例的自下向上存取光學顯微學技術的和自頂向下存取的 AFM 鐵筆。 JPK NanoWizard®II 只要求共焦的 Nikon 的階段為一个很穩定的建築被交換。 有一個輕的路徑通過意味的 AFM 該傳輸以及反映光學顯微學可以執行與到位 AFM。 因此,二套攝像裝置的基本硬件為同時發揮作用是兼容的。

對於 AFM 想像穩定性是非常重要的 (因此更加穩定的階段的需求)。 這意味著使用稀薄的 coverglass 作為範例技術支持 AFM 想像與優質 AFM 圖像長期是不兼容的。 然而,特別地當使用時,為了優越光學圖像經常是好對圖像範例通過稀薄的 coverglass 高放大,浸沒透鏡。 对這樣實驗,這個用戶希望結合從兩個系統的優質想像, JPK 設計了範例持有人,例如 BioCell,在 coverglass 允許這個用戶穩定地掛接範例,不用影響的圖像質量。

另外,為真的綜合化,必須有某個方式校準二個技術的像方,以便可以精密地覆蓋他們。 這是必要補嘗從使用在光學顯微鏡的光學出現的不可避免,雖然小,空間的變型。 然而,在每臺 JPK 儀器的 piezos 線性化這樣 AFM 圖像是準確的對在 x 和 y 方向的 3Å。 儘管有 在 AFM 沒有被複製的光學圖像的畸變,從單獨來源的圖像不準確地在許多情況下躺在。 當這個用戶希望關聯螢光信號與小的結構,例如 endocytic 坑,在細胞的表面時,這是特殊問題。

覆蓋圖像然後翹曲一由眼睛介入是易出錯的重大的主觀輸入。

共焦的光學圖像的準確定標

當 AFM 圖像被生成使用非常準確的線性化的 piezos 它可以對待 「實際空間」。 懸臂 (想像鐵筆) AFM 通常是光柵瀏覽在表面建立圖像。 然而,此懸臂可能精密地也被移動向固定點。 這意味著懸臂可以通過經驗主義確定在一套的懸臂式位置用於校準光學圖像光學圖像,在 AFM 的準確的位置已經知道。 簡而言之,使用 piezos,懸臂被移動向一套在實際空間的 25 點。 在每點一個光學圖像獲取,并且自動地隨後確定在光學圖像內的技巧地點。 使用兩套 25 點,變換功能然後被計算,并且這變換應用對光學圖像,當它被導入到 SPM 軟件 (是必需的對於運行 JPK NanoWizard AFMs)。 用這樣方式光學圖像被校準并且被導入到 SPM 環境,在一個自動化的進程中。

圖 1。

一旦結合 AFM 與 LSCM AFM 懸臂的光學圖像在反映模式下被生成,即放射補白從在這臺探測器前面被去除,并且勵磁激光的反映從懸臂的是印象的 (圖 1)。 用這樣方式在 LSCM 圖像範圍內的懸臂式位置可以根本被檢測使用輕的路徑和一樣想像的這個範例。 圖 1 顯示重疊五與 FITC-phalloidin 的對應的 LSCM 圖像的懸臂位置 (a) 標記了鼠標胚胎成纖維細胞 (b)。 當懸臂的準確的位置在 AFM 空間知道,對應的技巧位置的計算在 LSCM 圖像的可以被計算,并且變換功能推導允許二個圖像的準確的重疊。

被校準的光學圖像和 AFM 圖像重疊

一旦兩個顯微鏡像方跨關聯一定數量的有趣可能性來了。

這個共焦的圖像可以被導入到 AFM 軟件允許想像特定,被標記這個細胞的特定區域的區或者處理,并且準確的脫機重疊可能準確地映射被標記的要素到他們對應的結構。 例如, MDCK 細胞表面由可以直接地是印象的使用 AFM,并且肌動蛋白形成微絨毛的結構上的基本類型可以是印象的與 LSCM 在弄髒與螢光被標記的 phalloidin 以後的基於肌動蛋白的微絨毛報道。

以前,比較的這樣圖像沒有導致處理所有的重疊與伸進的肌動蛋白信號在表面這個細胞,由於在兩個圖像上的輕微的區別。 然而,在這個共焦的圖像和轉換的定標以後,共焦和 AFM 圖像的重疊是準確的 (圖 2)。

圖 2。

MDCK 細胞修理了與多聚甲醛 (4% 在 PBS, 20 分鐘),標記與 FITC-phalloidin,并且細胞的頂面是印象的與 AFM 和 LSCM。 在這個共焦的圖像 (a) 功能對應於表面被關聯的基於肌動蛋白的微絨毛和細胞連接點,纖維狀肌動蛋白局限化。 在 AFM 地形學圖像 (b) 微絨毛和細胞連接點也是明顯的。 因為 AFM 圖像包含結構信息全部表面,不僅僅特定組件,這個圖像被處理取消細胞的曲度和顯示更小的表面伸進 (微絨毛)。 在 (c) 紅色 AFM 圖像用綠色熒光覆蓋了。

Clathrin 和 Caveolin 在鼠標胚胎成纖維細胞

微絨毛在 MDCK 細胞頂端表面是在表面的統治結構在 AFM 圖像,因此正確的重疊是確切。 然而,當有非常異種表面時的細胞是印象的分配特定功能到多種表面結構沒有特定標籤的某種表單是非常難的。 在這種情況下,如果圖像的二種類型的重疊不是準確的在互相關的錯誤可以被犯。 要展示使用的潛在結合的 LSCM 直接重疊與 AFM 複雜系統被選擇。 鼠標胚胎成纖維細胞細胞標記了與反caveolin 或反clathrin 抗體,跟隨由 TRITC 被標記的附屬抗體。

圖 3。

細胞冷卻了對 4°C 并且標記了與反clathrin 重鏈抗體然後修理了與多聚甲醛 (4% 在 PBS, 20 分鐘)。 要形象化 clathrin 被塗上的坑 TRITC 被標記的附屬抗體被添加,使用 FITCphalloidin,并且纖維狀肌動蛋白被弄髒了。

DirectOverlay 功能用於校準 LSCM 圖像 AFM 圖像如所描述以前。 在共焦的圖像的定標以後,一個人可能確定在對應於 clathrin 被標記的表面的哪些坑在熒光圖像 (圖 3) 以為特色。

要形象化表面 caveolin,鼠標胚胎成纖維細胞修理與多聚甲醛 (4% 在 PBS, 20 分鐘) 然後標記了與反caveolin 1 抗體。 使用 TRITC 被標記的附屬抗體,此主要抗體然後被弄髒了。 再次, DirectOverlay 功能用於校準 LSCM 圖像 AFM 圖像。

圖像可能然後被比較解釋 AFM 看到的表面功能 (圖 4)。 當細胞只需要被修理,沒對待用其他方式,此聯合的想像允許這個用戶獲得概覽這樣結構如何與其他結構關連在這個細胞的表面。

圖 4。

結論

AFM 的組合與 LSCM 可能進一步擴大兩個技術的應用。 從 AFM 想像角度看,與圖像的 LSCM 和定標的組合允許特殊結構的準確的確定在細胞,即 cavaeoli 和 clathrincoated 坑表面。 另外,與處理的組合 LSCM 想像通過使用 AFM 允許進程想像順流細胞處理。 可能性現在延伸進一步,與 AFM 的處理和可能 LSCM 的想像的所有組合。

來源: JPK 儀器

關於此來源的更多信息请請參觀 JPK 儀器

Date Added: Feb 25, 2008 | Updated: Jun 11, 2013

Last Update: 13. June 2013 17:38

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