使用各種形式的顯微鏡對樣品元素的可視化，不僅依賴於放大倍率，但也對比。 因此，不同形式的顯微鏡提供有關樣本的不同的信息 。 激光掃描共聚焦顯微鏡（LSCM），樣本內的一個特定的標記組件的三維位置信息，並有額外的好處，不包括集中光線。 這可能會導致更清晰的圖像給定樣品中的焦平面 。 原子力顯微鏡（AFM），另一方面，提供直接的樣品表面的結構信息 。 顯微鏡這兩種形式的組合，可能是一個非常強大的工具，因為它是困難的“污點”原子力顯微鏡成像的結構，因此，區分一個結構基礎上的特定元素單獨研究並不總是可行的。 使用熒光標記和成像光片，相應的樣品表面用激光共聚焦顯微鏡意味著，如果可以結合這兩種技術，然後在LCSM圖像標籤可以交叉相關與原子力顯微鏡成像的結構。 這額外的好處也背景的具有特定結構的位置（用激光共聚焦顯微鏡鑑定）標記的蛋白 。 二JPK Nanowizard 要結合兩個顯微技術的兩個單獨的文書，需要建在一起，這樣既不擾亂其他功能 。 JPK Nanowizard ® II尼康C1共聚焦顯微鏡和組合允許同一樣品面積成像兩種技術， JPK納米嚮導 ®被設計成一個倒置光顯微鏡上安裝。因此，自下而上的訪問樣品的光學顯微鏡技術和自上而下的原子力顯微鏡手寫筆的訪問。 JPK NanoWizard ® II只需要一個高度穩定的建設交換了尼康共聚焦階段。是通過原子力顯微鏡的光路，這意味著，傳輸以及反射光顯微鏡與原子力顯微鏡進行。 因此，兩個成像設備的基本硬件是兼容的同時運作 。 原子力顯微鏡成像穩定是極為重要的的（因此為較穩定的階段要求） 。 這意味著，作為原子力顯微鏡成像的樣本支持的使用薄玻璃罩很長一段時間不符合高品質的原子力顯微鏡圖像。 然而，優越的光學圖像往往是通過薄玻璃罩圖像樣本，尤其是在高放大倍率，浸泡鏡片使用 。 對於這樣的實驗，用戶希望從兩個系統結合高品質的影像， JPK設計樣本，如持有人， BioCell，允許用戶穩定裝入樣品上的玻璃罩不影響圖像質量的前提下，。 此外，為真正的一體化，必須有一些方法來校準兩種技術的圖像空間，使他們可以準確地覆蓋 。 這是必要的，以彌補不可避免的，雖然小，空間畸變，從使用的光學在光鏡下出現。然而，在每個piezos JPK儀器線性AFM圖像精確到3A在X和Y方向。由於是在光學圖像失真，這是不會複製在原子力顯微鏡，在大多數情況下單獨的來源不準確覆蓋的圖像。 這是當用戶希望小的結構，如吞坑，相關的細胞表面上的熒光信號，尤其是一個問題。 疊加眼的圖像，然後翹曲之一，涉及顯著的主觀性，很容易出錯。 共焦光學圖像的精確校準 由於原子力顯微鏡圖像生成使用非常精確的線性piezos的，它可以被視為“真正的空間“。 通常的原子力顯微鏡的懸臂（成像手寫筆 ） 光柵掃描在表面建立形象。然而，這懸臂也可以被精確移動到固定點。這意味著，懸臂可以用來校正光學圖像，由經驗確定的光學圖像的設置，在原子力顯微鏡的精確位置是已知的懸臂位置。 總之，懸臂移動到了25點在現實空間的設置，使用piezos 。 在每個點上獲得光學圖像，隨後內光學圖像的一角位置自動確定 。 轉換功能，然後使用兩套25分計算，此變換應用到的光學圖像，因為它是到SPM軟件（運行所需的進口JPK NanoWizard原子力顯微鏡 ）。 在這樣一種方式的光學圖像進行校準和進口到SPM環境，在一個自動化的過程。  圖1： 使用直接覆蓋功能的激光共聚焦顯微鏡圖像的校準。 原子力顯微鏡的懸臂可以使用激光掃描共聚焦顯微鏡在反射模式成像 。 這裡，五個獨立的懸臂式圖像疊加（A），然後通過相應的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像的FITC -鬼筆環肽標記的小鼠胚胎成纖維細胞（B）疊加 。 結合激光共聚焦顯微鏡原子力顯微鏡的情況下，光學圖像的原子力顯微鏡的懸臂產生的反射模式，即排放過濾器是從探測器前，從懸臂激發激光的反射成像 （圖1）。 在這樣一種方式，激光共聚焦顯微鏡圖像範圍內的懸臂位置可以使用基本上是相同的光路成像樣品進行檢測。 圖1顯示了相應的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像的FITC -鬼筆環肽標記的小鼠胚胎成纖維細胞（B）（一）5懸臂位置重疊 。 由於精確的立場是眾所周知的在原子力顯微鏡的空間的懸臂，在激光共聚焦顯微鏡圖像的相應的尖端位置的計算，可以計算的轉換函數推導，讓兩個圖像的精確覆蓋。 校準的光學圖像和原子力顯微鏡圖像的疊加 一旦雙方顯微鏡圖像空間已經交叉關聯出現了一些有趣的可能性 。 共聚焦圖像可以導入到原子力顯微鏡的軟件，讓成像具體的，標示的地區，或操縱細胞的特定區域，精確的離線疊加，可以準確的地圖標記組件及其相應的結構。 例如，MDCK細胞的表面覆蓋由肌動蛋白為基礎的微絨毛，用原子力顯微鏡和肌動蛋白構成的微絨毛結構的基礎上，可以用激光掃描共聚焦顯微鏡成像與熒光標記的鬼筆環肽染色後 ，可直接成像。 在此之前，這樣的圖像進行比較並沒有導致直接與肌動蛋白在細胞表面的突起，由於在兩個圖像的細微差異信號覆蓋。 然而，校準後的共聚焦圖像和改造，共聚焦和原子力顯微鏡圖像的疊加精確（圖2 ）。  圖2。MDCK 細胞成像。固定MDCK細胞，肌動蛋白與FITC -鬼筆環肽標記。 （一）在MDCK細胞單層表面共聚焦顯微鏡圖像，顯示表面相關的肌動蛋白為基礎的微絨毛和細胞路口。 AFM圖像（二）同一地區已被處理，以去除細胞的曲率和只包含表面突起（微絨毛）的信息。 （c）中的兩幅圖像重疊。 MDCK細胞是固定的多聚甲醛（4％的PBS，20分鐘），FITC -鬼筆環肽標記細胞的頂面與原子力顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡成像 。 在共聚焦圖像（一）功能符合相關的肌動蛋白為基礎的微絨毛和細胞連接處，絲狀肌動蛋白是本地化的表面。 （二）在原子力顯微鏡地形圖像的微絨毛和細胞交界處也是顯而易見的。由於原子力顯微鏡圖像中包含的整個表面的結構信息，而不是特定的組件，圖像已被處理，以去除細胞的曲率，並且只顯示表面突起的小 （微絨毛）。 （c）中紅色的原子力顯微鏡圖像已覆蓋的綠色熒光 。 網格蛋白及對小鼠胚胎成纖維細胞的Caveolin 在MDCK細胞的頂端表面微絨毛上表面的原子力顯微鏡圖像的主導結構，所以正確的疊加是明確的。 然而，當細胞表面有一個非常龐雜的的成像是非常困難的，沒有一些特定的標籤形式分配各種表面結構的特定功能。 在這種情況下，如果圖像的兩種類型的覆蓋是不交叉相關的精確的錯誤。 為了證明使用激光共聚焦顯微鏡與原子力顯微鏡相結合的更複雜的系統被選為直接覆蓋的潛力 。 由TRITC標記的二抗，要么反小窩或反網格蛋白抗體標記的小鼠胚胎成纖維細胞細胞。  圖3。MEF 細胞表面結合網格蛋白塗層坑成像。小鼠胚胎成纖維細胞被打成反網格蛋白重鏈抗體。可視化網格蛋白塗層坑添加一個TRITC標記的二抗，絲狀肌動蛋白染色使用FITC -鬼筆環肽。概述細胞作為原子力顯微鏡的地形標記的肌動蛋白（二）（一），和兩個疊加（三 ）提供。 較高的分辨率地形原子力顯微鏡（四）被收購，作為一個激光共聚焦顯微鏡圖像的區域（五）參展標記網格蛋白在細胞表面 。 （F）的兩個圖像疊加顯示，熒光標記對應於細胞表面的坑。地形從一個相關領域（在F標記）電子變焦是在（g）。 這些細胞被冷卻到4 ° C，和反網格蛋白重鏈抗體標記，然後用多聚甲醛（4％的PBS，20分鐘）固定 。 可視化網格蛋白塗層坑添加一個TRITC標記的二抗，絲狀肌動蛋白染色使用FITCphalloidin。 DirectOverlay功能是用於對AFM圖像校準的激光共聚焦顯微鏡圖像，如前面所述 。 共聚焦圖像進行校準後，可以決定表面上的坑對應的熒光圖像的網格蛋白標記的功能（圖3）。 可視表面的小窩，是固定的小鼠胚胎成纖維細胞與多聚甲醛（4％的PBS，20分鐘），然後與抗Caveolin - 1基因抗體標記。這個主要的抗體，然後使用TRITC標記的二抗染色 。 再次，DirectOverlay功能是用於校準對原子力顯微鏡圖像的激光共聚焦顯微鏡圖像 。 圖像，然後可以相比，解釋看到表面的原子力顯微鏡（圖4）功能 。 由於細胞只需要加以固定，不以任何其他方式治療，這種組合的成像，使用戶能夠獲得這樣的結構如何與其他結構的細胞表面的概述。  圖4。MEF 細胞表面結合的小窩成像。小鼠胚胎成纖維細胞與多聚甲醛固定，然後用抗Caveolin - 1基因抗體標記。這個主要的抗體，然後使用TRITC標記的二抗染色 。 概述AFM細胞的地形圖像被收購（A）和激光共聚焦顯微鏡圖像的空間校正，以使原子力顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡的比較。 較高的分辨率的AFM圖像（二）被收購，並與表面相關的小窩（三）相應的激光掃描共聚焦顯微鏡圖像相比。 （d）中，是一個覆蓋到標記的區域放大（E）。 結論 激光共聚焦顯微鏡與原子力顯微鏡相結合，可以進一步擴大這兩種技術的應用。 從原子力顯微鏡成像，結合激光掃描共聚焦顯微鏡和圖像校準點允許特定結構的精確測定，在表面的細胞，即cavaeoli clathrincoated坑。 此外，激光共聚焦顯微鏡成像允許使用的原子力顯微鏡操縱結合成像處理的細胞操縱下游。進一步延伸的可能性，任何操縱原子力顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡成像現在可能的組合 。 |