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Durch AZoNano
Thema Liste
Hintergrund
Probenaufbereitung
Dynamische Kraft-Spektroskopie Unter Verwendung Vancmycin-Spitzen auf Synthetischer Halterung
Abbilden von Befreienden Ereignissen auf Lebenden Bakterien
Schlussfolgerung
Quittungen
Hintergrund
Aktuelle antibakterielle Drogen würden möglicherweise zu einem Phänomen unwirksames in naher Zukunft passendes, das pharmacoresistance genannt wird. Dieses spricht die Fähigkeit von Mikroorganismen an, den bacteriocidal (Zelltötung) oder bakteriostatischen (Hemmung des Wachstums) Effekten zu widerstehen, die durch Antibiotika verursacht werden. Bakterien bekannt, um Medikamentenresistenz durch einen Evolutionsprozess zu erwerben, der durch den weit verbreiteten Gebrauch und den Missbrauch von Antibiotika getrieben wird. Wenn dieses allgemeine Gesundheitsproblem nicht überwunden wird, könnte eine große Auswahl von Infektionskrankheiten unheilbar werden. Die Vorrichtungen von Drogenwirkungen auf Mikroorganismen sind bis jetzt kaum erforscht. Viele Fragen bleiben beantwortet zu werden: warum stoppen die Drogen, effizient zu sein? Wie können wir besser eine auswählen? Können wir die Entwicklung von drogenwiderstehenden Bakterien verlangsamen?
Vancomycin ist ein Glykopeptidantibiotikum, das nach Grampositiven Bakterien wie Staphylokokken, Streptokokken und Enterokokken handelt. Er bindet specifi cally an den Terminald-ala D-Ala von peptidoglycan Vorläufern und verhindert transglycosylation und transpeptidation, zwei bedeutende Schritte, die für peptidoglycan Synthese benötigt werden und schließlich führt zu cellysis. Atomkraftmikroskopie (AFM) hat bereits seine Vorteile im Bereich von Pharmakologie gezeigt und relevante Information über die Methode bereitgestellt, die Drogen auf ihre Ziele einwirken. Diese Technik kann auch verwendet werden, um Ereignisse, mit Piconewton Kraftempfindlichkeit zwischen einzelnen Biomolekülen zu befreien zu messen.
In der vorliegenden Untersuchung wurden vancomycinmodified Spitzen verwendet, um die Kräfte und die Dynamik der vancomycin/D-Ala-D-Ala Interaktion zu messen. Diese Maße wurden auf vorbildlichen Substratflächen sowie auf LebenLactococcus-Lactisbakterien gemacht.
Abbildung 1. Prüfende verbindliche Besonderheit von functionalized FLUGHANDBUCH neigt sich mit vorbildlichen Substratflächen
Probenaufbereitung
Bakterien wurden von exponential gewachsenen Kulturen geerntet, erneut ausgesetzt im Buffer und stillgestellt auf poröse Polycarbonatsmembranen. FLUGHANDBUCH-Kontaktmodus Bild- und forcedistancekurven wurden unter Verwendung eines Bruker Mehrmoden-FLUGHANDBUCHS erreicht. Maße wurden unter Verwendung Brukers der dreieckig-förmigen Silikonnitridkragbalken durchgeführt. Für Kraftmessungen wurde die maximale angewandte Kraft bei 250 pN gehalten, um Einrückung herabzusetzen. Affinitätsbilder wurden erhalten, indem man Abstands-Kurvenreihe mit 16 x 16 Kräften aufzeichnete, und die Beitrittskraft für jedes über einem bestimmten Bereich berechnete. Die Federkonstanten der Kragbalken wurden gefunden, um ~0,011 N/m. zu sein.
Abbildung 2. Einzel-Molekül Kraftspektroskopie der vancomycin/D-Ala-D-Ala Interaktion auf synthetischer Halterung. Goldspitzen functionalized mit cysteamide BIS (Vancomycin), während die Goldhalterungen abgebrochen mit OEG und Propionsäurehälften OEG kovalent mit D-Ala-D-Alapeptiden reagiert werden. (a) Repräsentativkraftkurve und Beitrittshistogramm (N = 978) erhalten in PBS-Buffer zwischen einer Vancomycinspitze und einer D-Ala-D-Alahalterung, mit einer hohen Reproduzierbarkeit. (b) Kontrolltest erzielt mit den freien D-Ala-D-Alapeptiden, die eine drastische Abnahme der Beitrittsfrequenz zeigen. (c) Plan der Beitrittskraft als Funktion des Logarithmus der Belastungsrate während des Einfahrens, beim (100 Maße für jeden Datenpunkt) halten konstant die Interaktionszeit und die Anflugdrehzahl. (d) Plan der Beitrittsfrequenz als Funktion der Interaktionszeit beim Halten konstant des Anfluges und der Einfahrendrehzahl (100 Maße für jeden Datenpunkt).
Tabelle 1. Die chemische Strategie wird in Abbildung 1 mit einer Zusammenfassung der experimentellen Daten beschrieben, die dementsprechend gemessen werden und extrapoliert sind
Experiment
| Bestätigung
| Ergebnisse
|
Aufnahmekraftabstand kurvt Abbildung 2A gegen Kontrolltest
Abbildung 2B
| Einzelne Molekülbeitrittskräfte
| 98 ± 33 pN (n=978)
|
Aufnahmekraftkurven mit unterschiedlichen Belastungskinetik
Abbildung 2C
| Längenschuppe der Energiesperre
| ~B x 0,36 nm
|
| Kinetische AusRatedissoziationskonstante an der nullkraft
| Koff = 2x10-3 s-1
|
Unterschiedliche Interaktionszeit beim Halten der Belastungsratekonstante
Stellen Sie 2D dar
| Interaktionszeit erforderlich für halb-maximale Wahrscheinlichkeit des Bindens
| t0.5 = 0.25s
|
| Vereinigungskinetikkonstante
Kon = t0.5 -1NAVoff
| Kon = 5 M-1 s-1
|
| Gleichgewichtskonstante
KD = K/Koffon
| Kd = 0,4 mm
|
Dynamische Kraft-Spektroskopie Unter Verwendung Vancmycin-Spitzen auf Synthetischer Halterung
Kraftabstands-Kurvenmaße bestätigen die einzelne und specifi c Beitrittskräfte zwischen Vancomycin und D-Ala-D-Ala auf synthetischer Halterung. Die dynamischen Spektroskopiedaten zeigen einen langsamen verbindlichen Prozess. Die Gleichgewichtsdissoziationskonstante dieses Ereignisses wurde gefunden, um 0,4 mm, d.h. höher als in den vorhergehenden Studien zu sein. Dieses kann durch sterische Behinderungseffekte um Vancomycin und D-Ala-DAlapeptide erklärt werden, die möglicherweise den Anerkennungsprozeß ändern.
Abbilden von Befreienden Ereignissen auf Lebenden Bakterien
Wie in Abbildung 3 gezeigt, wurden Vancomycinspitzen verwendet, um die Verteilung von einzelnen D-Ala-D-Alapeptiden auf LebenLactococcus-Lactis abzubilden. Kraftkurven waren aufgezeichnete befreiende Ereignisse der Vertretung in ungefähr 12% der Fälle. Im Gegensatz zu vorhergehenden Experimenten auf einer planaren Halterung, deckte das Beitrittskrafthistogramm (N = 1536) eine Verteilung mit zwei Verfahren von Beitrittskräften mit Maxima bei 83 ± 22 pN und 150 ± 16 pN auf (Abbildung 3C). Die erste Spitze wird gedacht, um einzelne Interaktionen zu reflektieren, da sein Wert bis den nah ist, der auf der planaren Halterung (~98 pN) gefunden wird. Die andere Spitze reflektiert möglicherweise Genossenschaftsschwergängigkeit, die ein weithin bekanntes Phänomen für Vancomycin ist. Die Besonderheit dieser Interaktion wurde unter Anwendung von einer Mutantbakterie nachgewiesen, die peptidoglycan Vorläufer produzierend, die durch D-Ala-D-Gummilack anstelle des D-Ala-D-Ala beenden.
Abbildung 3. Darstellung und Prüfen von D-Ala-D-Alasites auf lebenden Bakterien. (a) FLUGHANDBUCH-Bild, das ein einzelnes Gewicht Lactococcus-latics in versalia Zelle eingeschlossen in eine poröse Polymermembran besonders angepasst für nichtinvasive und in-situdarstellung während eines Abteilungsprozesses zeigt. Der Scheidewandbereich sowie die ringförmigen Zellen sind wahrscheinlich in eben synthetisiertem peptidoglycan reich (weißer Kasten). (B, C) Beitrittskartographie- und Beitrittskrafthistogramm (N = 1536) mit den Repräsentativkraftkurven aufgezeichnet zwischen Vancomycinspitzen und der lebenden Bakterie im Scheidewandbereich. (D, E, F) die Gleichen Experimente durchgeführt auf einer Mutantbakterie, die D-Ala-D-Gummilack Enden anstelle des D-Ala-D-Ala, mit dem Ergebnis einer großartigen Reduzierung der befreienden Ereignisse, auf dem abbildenden Beitritt und auf dem Histogramm aufweist.
Schlussfolgerung
Einzel-Molekül FLUGHANDBUCH-Kraftmessungen mit Antibiotikum-geänderten Spitzen aktivieren das Maß von befreienden Kräften des Antibiotikums und das Abbilden ihrer entsprechenden Ligands auf Livebakterien. Relevante Parameter können von den Kraftspektroskopiemaßen extrahiert werden und Informationen über die specifi Stadt und die Dynamik der Drogenziel Interaktion bereitstellen, die von der großen Hilfe für die Entwicklung und die Verbesserung von neuen Drogen sein kann.
Quittungen
Diese Arbeit wurde durch die Nationale Basis für Wissenschaftliche Forschung (FNRS), das Université-catholique De Löwen (Fonds Spéciaux de Recherche), das Bundes- Offi-Cer für Scientifi c, Technische und Kulturelle Angelegenheiten (Interuniversitäts-Polen des Anziehungskraft-Programms) und die Österreichische Wissenschafts-Stiftung (Projekt P-15295) unterstützt. Arbeit im Labor von J. Errington wurde durch eine Bewilligung vom BBSRC finanziert. Wir danken L. Piraux für den Gebrauch des thermischen Verdampfers, E. Ferain für den Gebrauch des Rasterelektronenmikroskops. Y.F. Dufrêne und P. Hols sind Wissenschaftliche Mitarbeiter des FNRS. Veröffentlicht mit Erlaubnis der Amerikanische Chemikalien-Gesellschaft.
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