Por AZoNano
Filete del Tema
Antecedentes
Preparación de la Muestra
Espectroscopia Dinámica de la Fuerza Usando las Puntas de Vancmycin en Soporte Sintetizado
Correspondencia de Acciones de Desatadura en Bacterias Vivas
Conclusión
Acuses De Recibo
Antecedentes
Las drogas antibacterianas Actuales pudieron vencer en un futuro próximo ineficaz a un fenómeno llamado pharmacoresistance. Esto refiere a la capacidad de microorganismos de soportar (inhibición del incremento) los efectos bacteriocidal (matanza de la célula) o bacterioestáticos causados por los antibióticos. Las Bacterias se saben para detectar resistencia a los medicamentos con un proceso evolutivo, que es impulsado por el uso y el uso erróneo dispersos de antibióticos. Si este problema de salud pública no se supera, una amplia gama de enfermedades infecciosas podrían llegar a ser incurables. Los mecanismos de los efectos de la droga sobre microorganismos son mal entendidos hasta la fecha. Sigue habiendo Muchas preguntas ser contestado: ¿por qué las drogas paran el ser eficientes? ¿Cómo podemos seleccionar mejor unos? ¿Podemos retrasar el revelado de bacterias drogorresistentes?
La Vancomicina es un antibiótico del glicopéptido que actúa en bacterias Grampositivas tales como estafilococos, estreptococos y enterococos. Ata specifi cally al D-Ala terminal del D-Ala de precursores peptidoglycan, previniendo el transglycosylation y el transpeptidation, dos pasos de progresión importantes necesarios para la síntesis peptidoglycan, eventual llevando al cellysis. La microscopia Atómica de la fuerza (AFM) ha mostrado ya sus ventajas en el campo de la farmacología, proporcionando a la información relevante sobre la manera que las drogas obran recíprocamente con sus metas. Esta técnica se puede también utilizar para medir el desatar de acciones con sensibilidad de la fuerza del pico-neutonio entre las únicas biomoléculas.
En el actual estudio, las puntas vancomycinmodified fueron utilizadas para medir las fuerzas y la dinámica de la acción recíproca de vancomycin/D-Ala-D-Ala. Estas mediciones fueron hechas en los substratos modelo así como en bacterias de vida del lactis de Lactococcus.
El Cuadro 1. especificidad obligatoria De Prueba del AFM functionalized inclina con los substratos modelo
Preparación de la Muestra
Las Bacterias fueron cosechadas de culturas exponencial crecidas, suspendidas de nuevo en almacenador intermediaro, e inmovilizadas sobre las membranas porosas del policarbonato. Las curvas de las imágenes y del forcedistance del modo de contacto del AFM fueron obtenidas usando un Bruker AFM Con varios modos de funcionamiento. Las Mediciones fueron realizadas usando los voladizos triangular-dados forma del nitruro del silicio de Bruker. Para las mediciones de la fuerza, la fuerza aplicada máxima fue guardada en 250 pN para disminuir el sangrado de márgenes. Las imágenes de la Afinidad fueron obtenidas registrando arsenal de la curva de la distancia de 16 x 16 fuerzas, y calculando la fuerza de la adherencia para cada uno sobre cierta área. Los constantes del muelle de los voladizos fueron encontrados para ser ~0,011 N/m.
Cuadro 2. espectroscopia de la fuerza de la Único-Molécula de la acción recíproca de vancomycin/D-Ala-D-Ala en soporte sintetizado. Las puntas del Oro functionalized con cysteamide del bis (vancomicina) mientras que los soportes del oro terminados con OEG y las mitades del ácido propiónico de OEG covalente se reaccionan con los péptidos del D-Ala-D-Ala. (a) Curva Representativa de la fuerza e histograma de la adherencia (n = 978) obtenido en almacenador intermediaro de PBS entre una punta de la vancomicina y un soporte del D-Ala-D-Ala, con una alta reproductibilidad. (b) Experimento de Mando logrado con los péptidos libres del D-Ala-D-Ala que muestran una disminución dramática de la frecuencia de la adherencia. (c) Gráfico de la fuerza de la adherencia en función del logaritmo de la velocidad de carga durante la contracción, mientras que guarda constante el tiempo de acción recíproca y el velocidad de aproximación (100 mediciones para cada punto de referencias). (d) Gráfico de la frecuencia de la adherencia en función del tiempo de acción recíproca mientras que guarda constante la aproximación y la velocidad de la contracción (100 mediciones para cada punto de referencias).
Cuadro 1. La estrategia química se describe en el Cuadro 1 con un resumen de los datos experimentales medidos y extrapolados por consiguiente
Experimento
| Validación
| Resultados
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La distancia de la fuerza del Registro curva la Figura 2A comparado con el experimento de mando
Figura 2B
| Únicas fuerzas de la adherencia de la molécula
| 98 ± 33 pN (n=978)
|
Curvas de la fuerza del Registro con tipos diversos de la carga
Figura 2C
| Escala de la Longitud de la barrera de energía
| ~B x 0,36 nanómetros
|
| Constante Cinético del lejos-tipo de la disociación en la fuerza cero
| Koff = 2x10-3 s-1
|
Tiempo de acción recíproca Diverso mientras que guarda el constante de la velocidad de carga
Figure el 2.o
| Tiempo de Acción Recíproca necesario para la probabilidad mitad-máxima de atar
| t0.5 = 0.25s
|
| Constante del tipo de la Asociación
Kon = t0.5 -1NAVoff
| Kon = 5 M-1 s-1
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| Constante de Equilibrio
KD = K/Koffon
| Kd = 0,4 milímetros
|
Espectroscopia Dinámica de la Fuerza Usando las Puntas de Vancmycin en Soporte Sintetizado
Las mediciones de la curva de la distancia de la Fuerza confirman fuerzas únicas y del specifi c de la adherencia entre la vancomicina y el D-Ala-D-Ala en soporte sintetizado. Los datos dinámicos de la espectroscopia muestran un proceso obligatorio lento. El constante de la disociación del equilibrio de esta acción fue encontrado para ser 0,4 milímetros, es decir más arriba que en estudios anteriores. Esto se puede explicar por efectos estéricos del obstáculo alrededor de la vancomicina y de los péptidos del D-Ala-DAla, que pueden alterar el proceso del reconocimiento.
Correspondencia de Acciones de Desatadura en Bacterias Vivas
Tal y como se muestra en del Cuadro 3, las puntas de la vancomicina fueron utilizadas para correlacionar la distribución de los únicos péptidos del D-Ala-D-Ala en el lactis de vida de Lactococcus. Las curvas de la Fuerza eran acciones de desatadura registradas de la demostración en el cerca de 12% de los casos. En comparación con experimentos anteriores en un soporte planar, el histograma de la fuerza de la adherencia (n = 1536) reveló una distribución bimodal de las fuerzas de la adherencia con máximos en 83 el ± 22 pN y 150 el ± 16 pN (Figura 3C). El primer pico se piensa para reflejar únicas acciones recíprocas puesto que su valor está cercano al que está encontrado en el soporte planar (~98 pN). El otro pico puede reflejar el atascamiento cooperativo, que es un fenómeno bien conocido para la vancomicina. La especificidad de esta acción recíproca fue probada por el uso de una bacteria del mutante produciendo los precursores peptidoglycan que terminaban por la D-Ala-D-Laca en vez del D-Ala-D-Ala.
Cuadro 3. Proyección De Imagen y sondeo de los sitios del D-Ala-D-Ala en bacterias vivas. (a) Imagen del AFM que muestra un único latics de Lactococcus del peso en la célula del versalia atrapada en una membrana porosa del polímero adaptada especialmente para la proyección de imagen no invasor e in situ durante un proceso de la división. El área del tabique así como anillo-como las estructuras es probablemente rica en peptidoglycan nuevamente sintetizada (el rectángulo blanco). (B, C) histograma de la fuerza de la cartografía de la Adherencia y de la adherencia (n = 1536) con las curvas representativas de la fuerza registradas entre las puntas de la vancomicina y la bacteria viva en el área del tabique. (D, E, F) los Mismos experimentos realizados en una bacteria del mutante que exhibe conclusiones de la D-Ala-D-Laca en vez del D-Ala-D-Ala, dando por resultado una reducción espectacular de las acciones de desatadura, en la adherencia que correlaciona y en el histograma.
Conclusión
las mediciones de la fuerza del AFM de la Único-Molécula con puntas antibiótico-modificadas activan la medición de las fuerzas de desatadura del antibiótico y la correspondencia de sus ligands correspondientes en bacterias vivas. Los parámetros Relevantes se pueden extraer de las mediciones de la espectroscopia de la fuerza, proporcionando a la información sobre la ciudad del specifi y la dinámica de la acción recíproca de la droga-meta, que puede estar de gran ayuda para el revelado y la mejoría de nuevas drogas.
Acuses De Recibo
Este trabajo fue utilizado por el Asiento Nacional para la Investigación Científica (FNRS), el catholique de Lovaina (Fonds Spéciaux de Recherche) de Université, el ce Federal de Offi para Scientifi c, los Asuntos Técnicos y Culturales (Polos Interuniversitarios del Programa de la Atracción), y el Asiento Austríaco de la Ciencia (proyecto P-15295). El Trabajo en el laboratorio de J. Errington fue financiado por una concesión del BBSRC. Agradecemos a L. Piraux por el uso del evaporador aire acondicionado térmica, E. Ferain para el uso del microscopio electrónico de exploración. Y.F. Dufrêne y P. Hols son Socios de Investigación del FNRS. Publicado con la autorización de la Sociedad de Substancia Química Americana.
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Esta información ha sido originaria, revisada y adaptada de los materiales proporcionados por Bruker AXS.
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