Interactions Médicamenteuses Vérifiées Utilisant la Microscopie Atomique de Force avec des Extrémités de Functionalized de Bruker

Par AZoNano

Liste de Sujet

Mouvement Propre
Préparation des Échantillons
Spectroscopie Dynamique de Force Utilisant des Extrémités de Vancmycin sur le Support Synthétique
Cartographie des Événements Défaisants sur les Bactéries Vivantes
Conclusion
Remerciements

Mouvement Propre

Les médicaments antibactériens Actuels pourraient devenir dans un avenir proche dus inutile à un pharmacoresistance appelé de phénomène. Ceci se rapporte à la capacité des micros-organismes de supporter (inhibition d'accroissement) des effets bacteriocidal (massacre de cellules) ou bactériostatiques provoqués par des antibiotiques. Des Bactéries sont connues pour saisir la résistance au médicament par un processus évolutif, qui est piloté par l'usage répandu d'utiliser-et des antibiotiques. Si ce problème de santé publique n'est pas surmonté, un large éventail de maladies infectieuses pourraient devenir incurables. Les mécanismes des effets de la drogue sur des micros-organismes sont mal compris jusqu'à présent. Beaucoup de questions restent à répondre : pourquoi les médicaments cessent-ils d'être efficaces ? Comment pouvons-nous sélecter mieux ceux ? Pouvons-nous ralentir le développement des bactéries résistant à la drogue ?

La Vancomycine est un antibiotique de glycopeptide agissant sur les bactéries Grampositives telles que des staphylocoques, des streptocoques et des enterocoques. Elle grippe le specifi cally aux D-Aluminiums terminaux de D-Aluminiums des précurseurs peptidoglycan, évitant le transglycosylation et le transpeptidation, deux phases importantes requises pour la synthèse peptidoglycan, éventuellement menant au cellysis. La microscopie Atomique de force (AFM) a déjà affiché ses avantages dans le domaine de la pharmacologie, fournissant les informations importantes au sujet de la voie que les médicaments agissent l'un sur l'autre avec leurs objectifs. Cette technique peut également être employée pour mesurer défaire des événements avec la sensibilité de force de pico-Newton entre les biomolécules uniques.

Dans la présente étude, des extrémités vancomycinmodified ont été employées pour mesurer les forces et la dynamique de l'interaction de vancomycin/D-Ala-D-Ala. Ces mesures ont été effectuées sur les substrats modèles ainsi que sur les bactéries vivantes de lactis de Lactococcus.

Le Schéma 1. spécificité obligatoire de Test de l'AFM functionalized dirige utilisant les substrats modèles

Préparation des Échantillons

Des Bactéries ont été moissonnées des cultures exponentiellement développées, resuspendues dans le tampon, et immobilisées sur les membranes poreuses de polycarbonate. Des images de mode de contact d'AFM et les courbures de forcedistance ont été obtenues utilisant un Bruker AFM À plusieurs modes de fonctionnement. Des Mesures ont été exécutées utilisant les encorbellements en forme triangulaire de nitrure du silicium de Bruker. Pour des mesures de force, la force appliquée maximum a été maintenue à 250 NA pour réduire à un minimum l'indentation. Des images d'Affinité ont été obtenues en enregistrant l'alignement de courbure de distance de 16 x 16 forces, et en prévoyant la force d'adhérence pour chacun au-dessus d'une certaine zone. Les constantes de source des encorbellements se sont avérées ~0,011 N/m.

Le Schéma 2. spectroscopie de force d'Unique-Molécule de l'interaction de vancomycin/D-Ala-D-Ala sur le support synthétique. Des extrémités d'Or functionalized avec le cysteamide de BRI (vancomycine) tandis que des supports d'or mis fin avec OEG et des parties d'acide propionique d'OEG sont en covalence mis à réagir avec des peptides de D-Aluminium-D-Aluminiums. (a) L'histogramme Représentatif de courbure et d'adhérence de force (n = 978) obtenu en tampon de PBS entre une vancomycine dirigent et un support de D-Aluminium-D-Aluminiums, avec une reproductibilité élevée. (b) Expérience de Contrôle réalisée avec des peptides libres de D-Aluminium-D-Aluminiums affichant une diminution excessive de la fréquence d'adhérence. (c) Traçage de la force d'adhérence en fonction du logarithme du taux de chargement pendant la rétraction, tout en maintenant la constante le temps d'interaction et la vitesse d'élan (100 mesures pour chaque point d'informations). (d) Traçage de la fréquence d'adhérence en fonction du temps d'interaction tout en maintenant la constante l'élan et la vitesse de rétraction (100 mesures pour chaque point d'informations).

Tableau 1. La stratégie chimique est décrite sur le Schéma 1 avec un résumé des données expérimentales mesurées et extrapolées en conséquence

Expérience Validation Résultats
La distance de force d'Enregistrement courbe la Figure 2A contre l'expérience de contrôle
Figure 2B
Forces Uniques d'adhérence de molécule 98 ± 33 NA (n=978)
Courbures de force d'Enregistrement avec des tarifs variables de charge
Figure 2C
Échelle de Longueur de barrage d'énergie ~B X 0,36 nanomètres
  Constante Cinétique de hors circuit-rate de dissociation à la force nulle Koff = 2x10-3 s-1
Temps d'interaction Variable tout en maintenant le taux de chargement constant
Figure le 2D
Temps d'Interaction nécessaire pour la probabilité moitié-maximale de gripper t0.5 = 0.25s
  Constante de tarifs d'Association
Kon = t0.5 -1NAVoff
Kon = 5 M-1 s-1
  Constante d'Équilibre
KD = K/Koffon
Kd = 0,4 millimètres

 

Spectroscopie Dynamique de Force Utilisant des Extrémités de Vancmycin sur le Support Synthétique

Les mesures de courbure de distance de Force confirment les forces uniques et du specifi c d'adhérence entre les vancomycines et les D-Aluminium-D-Aluminiums sur le support synthétique. Les données dynamiques de spectroscopie affichent un procédé obligatoire lent. La constante de dissociation d'équilibre de cet événement s'est avérée de 0,4 millimètres, c.-à-d. plus haut que dans des études précédentes. Ceci peut être expliqué par des effets stériques d'obstacle autour des vancomycines et des peptides de D-Aluminiums-DAla, qui peuvent modifier le procédé de reconnaissance.

Cartographie des Événements Défaisants sur les Bactéries Vivantes

Suivant les indications du Schéma 3, des extrémités de vancomycines ont été employées pour tracer la distribution des peptides uniques de D-Aluminium-D-Aluminiums sur le lactis vivant de Lactococcus. Les courbures de Force étaient des événements défaisants enregistrés d'apparence dans environ 12% des cas. Par opposition aux expériences précédentes sur un support planaire, l'histogramme de force d'adhérence (n = 1536) a indiqué une distribution bimodale des forces d'adhérence avec des maxima 83 au ± 22 NA et 150 le ± 16 NA (Figure 3C). La première crête est pensée pour réfléchir des interactions uniques puisque sa valeur est proche de celle trouvée sur le support planaire (~98 NA). L'autre crête peut réfléchir le grippement coopératif, qui est un phénomène réputé pour des vancomycines. La spécificité de cette interaction était prouvée en employant une bactérie de mutant produisant les précurseurs peptidoglycan terminant par la D-Aluminium-D-Laque au lieu des D-Aluminium-D-Aluminiums.

Le Schéma 3. Représentation et sondage des sites de D-Aluminium-D-Aluminiums sur les bactéries vivantes. (a) Image d'AFM affichant un latics unique de Lactococcus de grammage en cellule de versalia enfermée dans une membrane poreuse de polymère particulièrement adaptée pour la représentation non envahissante et in situ pendant un procédé de division. La zone de septum ainsi que les structures en forme d'anneau sont vraisemblablement riches en peptidoglycan neuf synthétisé (boîtier blanc). (B, C) histogramme de force de cartographie d'Adhérence et d'adhérence (n = 1536) avec les courbures représentatives de force enregistrées entre les extrémités de vancomycines et la bactérie vivante dans la zone de septum. (D, E, F) les Mêmes expériences effectués sur une bactérie de mutant montrant des fins de D-Aluminium-D-Laque au lieu des D-Aluminium-D-Aluminiums, ayant pour résultat une réduction spectaculaire des événements défaisants, sur le mappage d'adhérence et sur l'histogramme.

Conclusion

les mesures de force d'AFM d'Unique-Molécule avec des extrémités antibiotique-modifiées activent la mesure des forces défaisantes d'antibiotique et la cartographie de leurs ligands correspondants sur les bactéries sous tension. Des paramètres Appropriés peuvent être extraits des mesures de spectroscopie de force, fournissant des informations au sujet de la ville de specifi et de la dynamique de l'interaction de médicament-objectif, qui peut être d'un secours grand pour le développement et l'amélioration des médicaments neufs.

Remerciements

Ce travail a été supporté par la Fondation Nationale pour la Recherche Scientifique (FNRS), le catholique De Louvain (Fonds Spéciaux de Recherche) d'Université, le ce Fédéral d'Offi pour Scientifi c, les Affaires Techniques et Culturelles (Pôles Inter-universitaires de Programme d'Attraction), et la Fondation Autrichienne de la Science (projet P-15295). Le Travail dans le laboratoire de J. Errington a été financé par une concession du BBSRC. Nous remercions L. Piraux pour l'usage de l'évaporateur thermique, E. Ferain pour l'usage du microscope électronique de lecture. Y.F. Dufrêne et P. Hols sont des Associés de Recherches du FNRS. Publié avec l'autorisation de la Société Chimique Américaine.

Cette information a été originaire, révisée et adaptée des matériaux fournis par des Surfaces de Nano de Bruker.

Pour plus d'informations sur cette source visitez s'il vous plaît les Surfaces de Nano de Bruker.

Date Added: Apr 2, 2008 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:09

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