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AZoNano 著
トピックのリスト
背景
サンプル準備
総合的なサポートの Vancmycin の先端を使用してダイナミックな力の分光学
生きている細菌のアンバインドのイベントのマップ
結論
確認応答
背景
現在の抗菌性薬剤は pharmacoresistance と呼出される現象が近い将来に非効果的な原因になるかもしれません。 これは微生物の機能を抗生物質によって引き起こされる bacteriocidal (セル殺害) または bacteriostatic (成長の阻止) 効果に抗する示します。 細菌は抗生物質の広まった使用そして誤用によって運転される進化の過程によって薬剤耐性を得るために知られています。 この公衆衛生問題が克服されなかったら、感染症の広い範囲は不治になってもよい。 微生物に対する薬剤の効果のメカニズムは今までに十分理解されていないです。 多くの質問は答えられることを残ります: 薬剤はなぜ効率的であることを停止しますか。 私達はどのようによりよく物を選んでもいいですか。 私達は薬物対抗性の細菌の開発を減速してもいいですか。
バンコマイシンはぶどう状球菌、連鎖球菌および enterococci のようなグラム陽性の細菌で機能する糖蛋白質の抗生物質です。 それは peptidoglycan 前駆物質のターミナル D 翼部の D 翼部に specifi を cally 結合しま、 transglycosylation および transpeptidation を、 peptidoglycan 統合のために必要とされる 2 つの主要なステップ防ぎ cellysis に結局導きます。 原子力の顕微鏡検査は (AFM)薬剤によってがターゲットと相互に作用している方法についての関連情報を提供する薬理学のフィールドで既に利点を示してしまいました。 単一の生体物質間の pico ニュートン力の感度のイベントをアンバインドすることを測定するのにまたこの技術が使用することができます。
現在の調査では vancomycin/D 翼部 D 翼部の相互作用の力そして原動力を測定するのに、 vancomycinmodified 先端が使用されました。 これらの測定はモデル基板で、また生存 Lactococcus の lactis の細菌でなされました。
図 1. テストの functionalized AFM の結合の特定性はひっくり返まモデル基板を使用します
サンプル準備
細菌は指数関数的に育てられた文化から収穫され、バッファで再停止され、そして多孔性のポリカーボネートの膜に固定しました。 AFM の接触モードの画像および forcedistance のカーブは Bruker マルチモード AFM を使用して得られました。 測定は Bruker の三角型の窒化珪素の片持梁を使用して行われました。 力の測定のために刻み目を最小化するために、最大応用力は 250 pN で保たれました。 親和性の画像は 16 x 16 の力の間隔のカーブのアレイを記録し、ある特定の領域にそれぞれのための付着力を計算することによって得られました。 片持梁のばねの定数は ~0.011 N/m. であると見つけられました。
総合的なサポートの図 2. vancomycin/D 翼部 D 翼部の相互作用の単一分子力の分光学。 金の先端は bis (バンコマイシン) の cysteamide と OEG と反応する金サポート終わる OEG が D 翼部 D 翼部のペプチッドとプロピオン酸の一部分共有に間 functionalized。 (a) 代表的な力のカーブおよび高い再現性のバンコマイシンの先端と D 翼部 D 翼部サポート間の PBS バッファで、得られる付着のヒストグラム (n = 978)。 (b) 付着の頻度の劇的な減少を示す自由な D 翼部 D 翼部のペプチッドと達成される制御実験。 (c) 一定した対話単位時間保っている間およびアプローチ (各データ点のための 100 つの測定) 速度引き込みの間のローディングレートのロガリズムの機能として付着力のプロット。 (d) 一定したアプローチおよび引き込みの速度 (各データ点のための 100 つの測定) を保っている間対話単位時間の機能として付着の頻度のプロット。
表 1。 化学作戦はそれに応じて測定され、外挿法で推定される実験データの概要が付いている図 1 で記述されています
実験
| 確認
| 結果
|
記録力の間隔は図 2A を対制御実験曲げます
図 2B
| 単一の分子の付着力
| 98 ± 33 pN (n=978)
|
さまざまなロードレートの記録力のカーブ
図 2C
| エネルギー障壁の長さのスケール
| XB ~ 0.36 nm
|
| ゼロ力の分離の運動以外レートの定数
| Koff = 2x10-3 s-1
|
ローディングレートの定数を保っている間さまざまな対話単位時間
第 2 を計算して下さい
| 必要な不良部分の半極大確率のための対話単位時間
| t0.5 = 0.25s
|
| 連合のレートの定数
Kon = t0.5 -1NAVoff
| Kon = 5 つの M-1 s-1
|
| 平衡定数
KD = K/Koffon
| Kd = 0.4 mM
|
総合的なサポートの Vancmycin の先端を使用してダイナミックな力の分光学
力の間隔のカーブの測定は総合的なサポートのバンコマイシンと D 翼部 D 翼部間の単一および specifi c の付着力を確認します。 ダイナミックな分光学データは遅いバインディングプロセスを示します。 このイベントの平衡の分離の定数は前の調査のより高く 0.4 mM、すなわちであると見つけられました。 これは認識プロセスを変えるかもしれない D 翼部DAla のペプチッド説明することができますおよびバンコマイシンのまわりの立体妨害の効果によって。
生きている細菌のアンバインドのイベントのマップ
図 3 に示すように Lactococcus の生存 lactis の単一の D 翼部 D 翼部のペプチッドの分布をマップするのに、バンコマイシンの先端が使用されました。 力のカーブはケースの約 12% の記録された提示アンバインドのイベントでした。 平面サポートの前の実験に対して、付着力のヒストグラムは 83 ± で (n = 1536) 最大値の付着力の双峰分布を 22 pN および 150 ± 16 pN (図 3C) 明らかにしました。 最初のピークは値が平面サポート (~98 pN) で見つけられるものに近いので単一の相互作用を反映すると考えられます。 他のピークはバンコマイシンのための有名な現象である協力的な結合を反映するかもしれません。 この相互作用の特定性は突然変異体の細菌の使用によって証明され D 翼部 D 翼部の代りに D 翼部 D ラックによって終了する peptidoglycan 前駆物質を作り出します。
生きている細菌の D 翼部 D 翼部のサイトの図 3. イメージ投射および精査。 (a) 特に分割プロセスの間に非侵襲的な、そのままのイメージ投射のために適応する多孔性ポリマー膜に引っ掛かる versalia のセルで重量の Lactococcus の単一の latics を示す AFM の画像。 隔壁領域、またリングそっくりの構造は最近総合された peptidoglycan で豊富であると考えられます (ホワイトボックス)。 (B、 C) 隔壁領域のバンコマイシンの先端と生きている細菌の間に記録される代表的な力のカーブが付いている付着の地図作成および付着力のヒストグラム (n = 1536)。 (マップする付着とヒストグラムのアンバインドのイベントの豪華な減少に終って D 翼部 D 翼部の代りに D 翼部 D ラックの終りを、表わしている突然変異体の細菌で遂行される D、 E、 F) 同じ実験。
結論
抗生物質修正された先端の単一分子 AFM 力の測定は抗生物質のアンバインド力の測定および生きている細菌の対応する配位子のマップを可能にします。 関連したパラメータは新しい薬剤の開発そして改善のための多大な助力である場合もある薬物ターゲット相互作用の specifi 都市そして原動力についての情報を提供する力の分光学の測定から得ることができます。
確認応答
この作業は科学研究 (FNRS) のための各国用の基礎によって、 Université の catholique de ルーバン (Fonds Speciauxx de Recherche)、 Scientifi c のための Offi の中央政府セリウム、技術的な、文化的な出来事 (魅力プログラムの Interuniversity ポーランド人)、およびオーストリア科学の基礎 (プロジェクト P-15295) サポートされました。 J. Errington の実験室の作業は BBSRC からの許可によって資金を供給されました。 私達は熱蒸化器の使用に L. Piraux、走査型電子顕微鏡の使用のための E. Ferain に感謝します。 Y.F. Dufrenee および P. Hols は FNRS の研究教授です。 アメリカ化学会の許可と出版される。
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