Взаимодействия Снадобья Расследованные Используя Атомную Микроскопию Усилия с Подсказками Functionalized от Bruker

AZoNano

Список Темы

Предпосылка
Подготовка Образца
Спектроскопия Динамического Усилия Используя Подсказки Vancmycin на Синтетической Поддержке
Отображать Unbinding Случаи на Живущих Бактериях
Заключение
Подтверждения

Предпосылка

Настоящие противобактериологические снадобья могли стать недействительные в ближайшее время должными к вызванному явлению pharmacoresistance. Это ссылается к способности микроорганизмов выдержать bacteriocidal (умерщвление клетки) или бактериостатические (ингибитирование роста) влияния причиненные антибиотиками. Знают, что приобретают Бактерии сопротивление снадобья через постепеновский процесс, который управляется широко распространённый пользой и неправильным использованием антибиотиков. Если эта проблема общественных здравоохранений не отжата, то широкий диапазон инфекционных заболеваний смог стать неизлечимым. Поняты, что датируют механизмы наркотических действий на микроорганизмах бедно. Остают, что отвечены Много вопросов: почему снадобья останавливают быть эффективны? Как можем мы выбрать более лучше одни? Можем мы замедлить развитие бактерий снадобья упорных?

Vancomycin антибиотик гликопептида действуя на Грамположительных бактериях как стафилококки, стрептококки и энтерококки. Он связывает specifi cally к терминальной D-Але D-Алы peptidoglycan прекурсоров, предотвращающ transglycosylation и transpeptidation, 2 крупного шага необходимо для peptidoglycan синтеза, окончательно водящ к cellysis. Атомная микроскопия усилия (AFM) уже показывала свои преимущества в поле лекарствоведения, обеспечивая релевантную информацию о путе снадобья взаимодействуют с их целями. Этот метод можно также использовать для того чтобы измерить unbinding случаи с чувствительностью усилия pico-ньютона между одиночными биомолекулами.

В текущем исследовании, vancomycinmodified подсказки были использованы для того чтобы измерить усилия и динамику взаимодействия vancomycin/D-Ala-D-Ala. Эти измерения были сделаны на модельных субстратах так же, как на живя бактериях lactis Lactococcus.

Диаграмма 1. Испытывая binding характерность functionalized AFM наклоняет использующ модельные субстраты

Подготовка Образца

Сжали от в геометрической прогрессии, котор росли культур, ресуспензировали Бактерии в буфере, и лишили подвижности на пористые мембраны поликарбоната. Кривые изображений и forcedistance режима контакта AFM были получены используя Bruker Мультимодный AFM. Измерения были выполнены используя cantilevers нитрида кремния Bruker триангулярн-форменные. Для измерений усилия, максимальное прикладное усилие было сдержано на 250 pN для того чтобы уменьшить вмятие. Изображения Сродства были получены путем записывать блок кривого расстояния 16 x 16 усилий, и высчитывать усилие прилипания для каждого над некоторой областью. Были найдены, что были константы весны cantilevers ~0,011 N/m.

Диаграмма 2. спектроскопия усилия Одиночн-Молекулы взаимодействия vancomycin/D-Ala-D-Ala на синтетической поддержке. Подсказки Золота functionalized с cysteamide bis (vancomycin) пока поддержки золота законченные OEG и moieties пропионовой кислоты OEG ковалентно прореагированы с пептидами D-Ал-D-Алы. (A) Репрезентивная кривый усилия и гистограмма прилипания (n = 978) полученная в буфере PBS между подсказкой vancomycin и поддержкой D-Ал-D-Алы, с высокой воспроизводимостью. (B) Эксперимент по Управления достиганный при свободные пептиды D-Ал-D-Алы показывая драматическое уменшение частоты прилипания. (C) График усилия прилипания как функция логарифма тарифа нагрузки во время стягивания, пока держать постоянн время взаимодействия и скорость захода на посадку (100 измерений для каждого частного значения). (D) График частоты прилипания как функция времени взаимодействия пока держащ постоянн подход и скорость стягивания (100 измерений для каждого частного значения).

Таблица 1. Химическая стратегия описана в Диаграмме 1 с сводкой экспериментальных данных измеренных и экстраполированных соответственно

Эксперимент Утверждение Результаты
Расстояние усилия Записи изгибает Диаграмму 2A против эксперимента по управления
Диаграмма 2B
Одиночные усилия прилипания молекулы 98 ± 33 pN (n=978)
Кривые усилия Записи с тарифами быстроменяющаяся нагрузка
Диаграмма 2C
Маштаб Длины энергетического барьера ~B x 0,36 nm
  Кинетическая константа -тарифа разобщенности на zero усилии Koff = 2x10-3 s-1
Меняя время взаимодействия пока держащ константу тарифа нагрузки
Вычисляйте 2D
Время Взаимодействия необходимое для половин-maximal вероятности связывать t0.5 = 0.25s
  Константа тарифа Ассоциации
Kon = t0.5 -1NAVoff
Kon = 5 M-1 s-1
  Константа равновесия
KD = K/Koffon
Kd = 0,4 mM

 

Спектроскопия Динамического Усилия Используя Подсказки Vancmycin на Синтетической Поддержке

Измерения кривого расстояния Усилия подтверждают усилия одиночных и specifi c прилипания между vancomycin и D-Ал-D-Алой на синтетической поддержке. Динамические на данные по спектроскопии показано медленный binding процесс. Была найдены, что была постоянная диссоциации уравновешения этого случая 0,4 mM, т.е. более высоко чем в предыдущих изучениях. Это может быть объяснено стерическими влияниями помехи вокруг vancomycin и пептидов D-Алы-DAla, который могут изменить процесс опознавания.

Отображать Unbinding Случаи на Живущих Бактериях

Как показано в Диаграмме 3, подсказки vancomycin были использованы для того чтобы отобразить распределение одиночных пептидов D-Ал-D-Алы на живя lactis Lactococcus. Кривые Усилия были записанными случаями показа unbinding в около 12% из случаев. В отличие от предыдущих экспериментов на плоскостной поддержке, гистограмма усилия прилипания (n = 1536) показала двухвершинное распределение усилий прилипания с максимумами на 83 ± 22 pN и 150 ± 16 pN (Диаграмма 3C). Подуманы, что отражает первый пик одиночные взаимодействия в виду того что свое значение близко к одному найденному на плоскостной поддержке (~98 pN). Другой пик может отразить кооперативную вязку, которая известное явление для vancomycin. Характерность этого взаимодействия была доказана при помощи бактерии мутанта производящ peptidoglycan прекурсоры кончаясь D-Ал-D-Lac вместо D-Ал-D-Алы.

Диаграмма 3. Воображение и зондировать мест D-Ал-D-Алы на живущих бактериях. (A) Изображение AFM показывая одиночное latics Lactococcus веса в клетке versalia поглощенной в пористую мембрану полимера специально приспособленную для неинвазивного и в воображении situ во время процесса разделения. Подуманы, что будет зона септума так же, как кольц-как структуры богата в заново синтезированное peptidoglycan (белая коробка). (B, C) картоведение Прилипания и гистограмма усилия прилипания (n = 1536) при репрезентивные кривые усилия записанные между подсказками vancomycin и живущей бактерией в зоне септума. (D, E, F) Такие Же эксперименты унесенные на бактерии мутанта показывая законцовки D-Ал-D-Lac вместо D-Ал-D-Алы, приводящ к в эффектном уменьшении unbinding случаев, и на прилипании отображая и на гистограмме.

Заключение

измерения усилия AFM Одиночн-Молекулы с антибиотик-доработанными подсказками включают измерение усилий антибиотика unbinding и отображать их соответствуя лигандов на бактериях в реальном маштабе времени. Уместные параметры можно извлечь от измерений спектроскопии усилия, обеспечивая информацию о городе specifi и динамике взаимодействия снадобь-цели, которое может быть большого подспорья для развития и улучшения новых снадобиь.

Подтверждения

Эта работа была поддержана Национальным Учредительством для Научного Исследования (FNRS), catholique de Louvain Université (Fonds Spéciaux de Вычурный), Федерального ce Offi для Scientifi c, Технических и Культурных Дел (Interuniversity Poles Программы Привлекательности), и Австрийского Учредительства Науки (проекта P-15295). Работа в лаборатории J. Errington была фондирована даром от BBSRC. Мы благодарим L. Piraux для пользы термального испарителя, E. Ferain для пользы электронного кинескопа скеннирования. Y.F. Dufrêne и P. Hols Научно-исследовательские Сотрудники FNRS. Опубликовано с позволением Общества Американского Химиката.

Эта информация найденный, расмотрена и приспособлена от материалов обеспеченных Поверхностями Bruker Nano.

Для больше информации на этом источнике пожалуйста посетите Поверхности Bruker Nano.

Date Added: Apr 2, 2008 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:27

Ask A Question

Do you have a question you'd like to ask regarding this article?

Leave your feedback
Submit