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事宜列表
背景
范例准备
使用 Vancmycin 技巧的动态强制分光学在综合技术支持
映射在生存细菌的断开的活动
结论
鸣谢
背景
当前抗菌药也许在不久的将来成为无效由于称 pharmacoresistance 的现象。 这是指微生物的能力承受抗生素造成的 bacteriocidal (细胞杀害) 或制菌作用的 (增长的禁止) 作用。 细菌知道通过一个调优过程获取药物抗性，被抗生素普遍使用和误用驱动。 如果此公共卫生问题没有克服，各种各样的传染病可能变得无可救药。 药品效应结构对微生物的迄今很难懂。 许多问题留待去回答： 药物为什么停下来是高效的？ 我们如何可以选择更好部分？ 我们可以减速抵抗毒品的细菌的发展？
万古霉素是操作在革兰氏阳性的细菌的糖肽抗生素例如葡萄球菌、链球菌和肠球菌。 它束缚 specifi cally 对 peptidoglycan 前体最终 D 丙氨酸 D 丙氨酸，防止 transglycosylation 和 transpeptidation，为 peptidoglycan 综合需要的二个主要步骤，最终导致 cellysis。 基本强制显微学 (AFM)在领域已经显示了其好处的药理，提供关于药物与他们的目标配合的方式的相关信息。 此技术可能也用于评定断开与 pico 牛顿强制区分的活动在唯一原生质之间。
在本研究中， vancomycinmodified 技巧用于评定 vancomycin/D 丙氨酸 D 丙氨酸交往的强制和动力。 这些评定做在模型基体以及在居住的 Lactococcus lactis 细菌。
图 1. 测试的约束特异性 functionalized AFM 打翻使用模型基体
范例准备
细菌从按指数规律地增长的文化在缓冲被收获了，被重新悬挂了，并且被固定了在多孔聚碳酸酯纤维膜上。 使用 Bruker 多重状态的 AFM， AFM 联系模式图象和 forcedistance 曲线获得了。 使用 Bruker 的三角型氮化硅悬臂，评定进行了。 对于强制评定，最大应用的强制被保留在 250 pN 使凹进减到最小。 亲合力图象通过记录 16 x 16 强制距离曲线列阵和计算其中每一的黏附力强制得到在有些区。 发现悬臂的弹簧常数 ~0.011 N/m。
在综合技术支持的图 2. vancomycin/D 丙氨酸 D 丙氨酸交往的单一分子强制分光学。 金子技巧 functionalized 与 bis (万古霉素) cysteamide，当金技术支持终止与 OEG 时，并且 OEG 丙酸份额共价地起反应与 D 丙氨酸 D 丙氨酸肽。 (a) 有代表性的强制曲线和在万古霉素技巧和 D 丙氨酸 D 丙氨酸技术支持之间的 PBS 缓冲 (n = 978) 得到的黏附力直方图，与高增殖率。 (b) 控制实验达到与显示黏附力频率的严重的减少自由 D 丙氨酸 D 丙氨酸肽。 (c) 黏附力强制的剧情作为贷款利率的对数的功能在收缩时，当保持恒定和互作用时间接近航速时 (每数据点的 100 个评定)。 (d) 黏附力频率的剧情作为互作用时间功能的，当保留恒定途径和收缩速度时 (每数据点的 100 个评定)。
表 1。 化工方法在与相应地被评定和被外推的实验数据的汇总的表 1 被描述
实验
| 验证
| 结果
|
记录强制距离弯曲图 2A 与控制实验
图 2B
| 唯一分子黏附力强制
| 98 ± 33 pN (n=978)
|
记录与变化的负荷费率的强制曲线
图 2C
| 能垒长度缩放比例
| xB ~ 0.36 毫微米
|
| 离解运动比率常数在零的强制的
| Koff = 2x10-3 s-1
|
变化的互作用时间，当保留贷款利率常数时
图第 2
| 需要的互作用时间的束缚的半最大的概率
| t0.5 = 0.25s
|
| 关联费率常数
Kon = t0.5 -1NAVoff
| Kon = 5 M-1 s-1
|
| 平衡常数
KD = K/Koffon
| Kd = 0.4 mM
|
使用 Vancmycin 技巧的动态强制分光学在综合技术支持
强制距离曲线评定确认在万古霉素和 D 丙氨酸 D 丙氨酸之间的唯一和 specifi c 黏附力强制在综合技术支持。 动态分光学数据显示一个缓慢的绑定进程。 发现此活动平衡离解常数 0.4 mM，即高于在早先研究中。 这可以用在万古霉素和 D 丙氨酸DAla 肽附近的位的妨碍作用解释，可能修改识别进程。
映射在生存细菌的断开的活动
如图 3 所显示，万古霉素技巧用于映射唯一 D 丙氨酸 D 丙氨酸肽的配电器在居住的 Lactococcus lactis 的。 强制曲线是记录的陈列断开的活动在大约 12% 案件中。 与在平面技术支持的早先实验相对，黏附力强制直方图 (n = 1536) 显示了黏附力强制的一块双峰分布与最大数量的在 83 ± 22 pN 和 150 ± 16 pN (图 3C)。 第一个峰顶认为反射唯一交往，因为其值是接近在平面技术支持找到的那个 (~98 pN)。 另一个峰顶可能反射合作捆绑，是万古霉素的一种著名的现象。 此交往特异性证明使用突变体细菌生产结束由 D 丙氨酸 D LAC 而不是 D 丙氨酸 D 丙氨酸的 peptidoglycan 前体。
图 3. D 丙氨酸 D 丙氨酸站点想象和探查在生存细菌。 (a) 显示一唯一重量 Lactococcus latics 的 AFM 图象在 versalia 细胞被困住到为非侵入性和在原处想象特别是适应的一个多孔聚合物膜在部门进程期间。 中隔区以及环状的结构认为是富有的在最近被综合的 peptidoglycan 上 (白色箱子)。 (B， C) 黏附力绘图和黏附力强制直方图 (n = 1536) 与有代表性的强制曲线被记录在万古霉素技巧和生存细菌之间在中隔区。 (D、 E， F) 在突变体细菌执行的同样实验陈列 D 丙氨酸 D LAC 结束而不是 D 丙氨酸 D 丙氨酸，造成断开的活动的壮观的减少，在映射的黏附力和在直方图。
结论
单一分子 AFM 与抗生素被修改的技巧的强制评定启用抗生素断开的强制的评定和映射他们在活细菌的对应的配合基。 相关参数可以从强制分光学评定被提取，关于药物目标交往的 specifi 城市和动力的情报，可以是新的药物的发展和改善的巨大的帮助。
鸣谢
此工作由科学研究 (FNRS) 的国家基础支持， Université catholique de 卢万 (Fonds Speciauxx de Recherche)， Scientifi 的 c 联邦 Offi 铈，技术和文化事物 (吸引力程序大学之间的波兰人) 和奥地利科学基础 (项目 P-15295)。 工作在 J. Errington 实验室由从 BBSRC 的授予资助。 我们感谢 L. Piraux 为对这台热量蒸发器的使用， E. Ferain 为对扫描电子显微镜的使用。 Y.F. Dufrenee 和 P. Hols 是 FNRS 的研究员。 发布与美国化学会的权限。
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