使用與 Functionalized 技巧的基本強制顯微學調查的藥物相互作用從 Bruker

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背景
範例準備
使用 Vancmycin 技巧的動態強制分光學在綜合技術支持
映射在生存細菌的斷開的活動
結論
鳴謝

背景

當前抗菌藥也許在不久的將來成為無效由於稱 pharmacoresistance 的現象。 這是指微生物的能力承受抗生素造成的 bacteriocidal (細胞殺害) 或制菌作用的 (增長的禁止) 作用。 細菌知道通過一個調優過程獲取藥物抗性,被抗生素普遍使用和誤用驅動。 如果此公共衛生問題沒有克服,各種各樣的傳染病可能變得無可救藥。 藥品效應結構對微生物的迄今很難懂。 許多問題留待去回答: 藥物為什麼停下來是高效的? 我們如何可以選擇更好部分? 我們可以減速抵抗毒品的細菌的發展?

萬古黴素是操作在革蘭氏陽性的細菌的糖肽抗生素例如葡萄球菌、鏈球菌和腸球菌。 它束縛 specifi cally 對 peptidoglycan 前體最終 D 丙氨酸 D 丙氨酸,防止 transglycosylation 和 transpeptidation,為 peptidoglycan 綜合需要的二個主要步驟,最終導致 cellysis。 基本強制顯微學 (AFM)在領域已經顯示了其好處的藥理,提供關於藥物與他們的目標配合的方式的相關信息。 此技術可能也用於評定斷開與 pico 牛頓強制區分的活動在唯一原生質之間。

在本研究中, vancomycinmodified 技巧用於評定 vancomycin/D 丙氨酸 D 丙氨酸交往的強制和動力。 這些評定做在模型基體以及在居住的 Lactococcus lactis 細菌。

圖 1. 測試的約束特異性 functionalized AFM 打翻使用模型基體

範例準備

細菌從按指數規律地增長的文化在緩衝被收穫了,被重新懸掛了,并且被固定了在多孔聚碳酸酯纖維膜上。 使用 Bruker 多重狀態的 AFM, AFM 聯繫模式圖像和 forcedistance 曲線獲得了。 使用 Bruker 的三角型氮化硅懸臂,評定進行了。 對於強制評定,最大應用的強制被保留在 250 pN 使凹進減到最小。 親合力圖像通過記錄 16 x 16 強制距離曲線列陣和計算其中每一的黏附力強制得到在有些區。 發現懸臂的彈簧常數 ~0.011 N/m。

在綜合技術支持的圖 2. vancomycin/D 丙氨酸 D 丙氨酸交往的單一分子強制分光學。 金子技巧 functionalized 與 bis (萬古黴素) cysteamide,當金技術支持終止與 OEG 時,并且 OEG 丙酸份額共價地起反應與 D 丙氨酸 D 丙氨酸肽。 (a) 有代表性的強制曲線和在萬古黴素技巧和 D 丙氨酸 D 丙氨酸技術支持之間的 PBS 緩衝 (n = 978) 得到的黏附力直方圖,與高增殖率。 (b) 控制實驗達到與顯示黏附力頻率的嚴重的減少自由 D 丙氨酸 D 丙氨酸肽。 (c) 黏附力強制的劇情作為貸款利率的對數的功能在收縮時,當保持恆定和互作用時間接近航速時 (每數據點的 100 個評定)。 (d) 黏附力頻率的劇情作為互作用時間功能的,當保留恆定途徑和收縮速度時 (每數據點的 100 個評定)。

表 1。 化工方法在與相應地被評定和被外推的實驗數據的彙總的表 1 被描述

實驗 驗證 結果
記錄強制距離彎曲圖 2A 與控制實驗
圖 2B
唯一分子黏附力強制 98 ± 33 pN (n=978)
記錄與變化的負荷費率的強制曲線
圖 2C
能壘長度縮放比例 xB ~ 0.36 毫微米
  離解運動比率常數在零的強制的 Koff = 2x10-3 s-1
變化的互作用時間,當保留貸款利率常數時
圖第 2
需要的互作用時間的束縛的半最大的概率 t0.5 = 0.25s
  關聯費率常數
Kon = t0.5 -1NAVoff
Kon = 5 M-1 s-1
  平衡常數
KD = K/Koffon
Kd = 0.4 mM

 

使用 Vancmycin 技巧的動態強制分光學在綜合技術支持

強制距離曲線評定確認在萬古黴素和 D 丙氨酸 D 丙氨酸之間的唯一和 specifi c 黏附力強制在綜合技術支持。 動態分光學數據顯示緩慢的綁定進程。 發現此活動平衡離解常數 0.4 mM,即高於在早先研究中。 這可以用在萬古黴素和 D 丙氨酸DAla 肽附近的位的妨礙作用解釋,可能修改識別進程。

映射在生存細菌的斷開的活動

如圖 3 所顯示,萬古黴素技巧用於映射唯一 D 丙氨酸 D 丙氨酸肽的配電器在居住的 Lactococcus lactis 的。 強制曲線是記錄的陳列斷開的活動在大約 12% 案件中。 與在平面技術支持的早先實驗相對,黏附力強制直方圖 (n = 1536) 顯示了黏附力強制的雙峰分佈與最大數量的在 83 ± 22 pN 和 150 ± 16 pN (圖 3C)。 第一個峰頂認為反射唯一交往,因為其值是接近在平面技術支持找到的那個 (~98 pN)。 另一個峰頂可能反射合作捆綁,是萬古黴素的著名的現象。 此交往特異性證明使用突變體細菌生產結束由 D 丙氨酸 D LAC 而不是 D 丙氨酸 D 丙氨酸的 peptidoglycan 前體。

圖 3. D 丙氨酸 D 丙氨酸站點想像和探查在生存細菌。 (a) 顯示唯一重量 Lactococcus latics 的 AFM 圖像在 versalia 細胞被困住到為非侵入性和在原處想像特別是適應的多孔聚合物膜在部門進程期間。 中隔區以及環狀的結構認為是富有的在最近被綜合的 peptidoglycan 上 (白色箱子)。 (B, C) 黏附力繪圖和黏附力強制直方圖 (n = 1536) 與有代表性的強制曲線被記錄在萬古黴素技巧和生存細菌之間在中隔區。 (D、 E, F) 在突變體細菌執行的同樣實驗陳列 D 丙氨酸 D LAC 結束而不是 D 丙氨酸 D 丙氨酸,造成斷開的活動的壯觀的減少,在映射的黏附力和在直方圖。

結論

單一分子 AFM 與抗生素被修改的技巧的強制評定啟用抗生素斷開的強制的評定和映射他們在活細菌的對應的配合基。 相關參數可以從強制分光學評定被提取,關於藥物目標交往的 specifi 城市和動力的情報,可以是新的藥物的發展和改善的巨大的幫助。

鳴謝

此工作由科學研究 (FNRS) 的國家基礎支持, Université catholique de 盧萬 (Fonds Speciauxx de Recherche), Scientifi 的 c 聯邦 Offi 鈰,技術和文化事物 (吸引力程序大學之間的波蘭人) 和奧地利科學基礎 (項目 P-15295)。 工作在 J. Errington 實驗室由從 BBSRC 的授予資助。 我們感謝 L. Piraux 為對這臺熱量蒸發器的使用, E. Ferain 為對掃描電子顯微鏡的使用。 Y.F. Dufrenee 和 P. Hols 是 FNRS 的研究員。 發布與美國化學會的權限。

此信息是來源,覆核和適應從 Bruker 納諾表面提供的材料。

關於此來源的更多信息请請參觀 Bruker 納諾表面

Date Added: Apr 2, 2008 | Updated: Jan 23, 2014

Last Update: 23. January 2014 11:05

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